1、         【摘要】     目的 探討二?英(TCDD)對大鼠成骨細胞增殖及分泌功能的調(diào)控作用。方法 應用1×10-101×10-8mol/L濃度的二?英作用原代培養(yǎng)的大鼠顱蓋骨成骨細胞24 h；采用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法檢測二?英對成骨細胞增殖能力的影響；采用對硝基酚磷酸鹽法測定成骨細胞培養(yǎng)液堿性磷酸酶(ALP)濃度。結果 二?英對大鼠成骨細胞增殖和分泌功能有負性調(diào)節(jié)作用，與對照組比較，1×10-8mol/L的二?英使大

2、鼠成骨細胞增殖能力降低60，使成骨細胞ALP活性減少58，差異有統(tǒng)計學意義(P    【關鍵詞】  二?英；成骨細胞；細胞增殖    二?英(TCDD)是人類生存環(huán)境中廣泛存在的類雌激素樣環(huán)境污染物質(zhì)，TCDD類不是人們有意生產(chǎn)的化學品，而是在廢棄物焚燒、化工生產(chǎn)、金屬冶煉等隨廢氣或殘渣排放的微量或痕量污染物。關注TCDD類對人體健康的影響，也促進了TCDD類毒理學研究。TCDD具有分布廣泛、生物半衰期長、生物體內(nèi)蓄積、致畸致癌等生物特征，但其對機體的毒性作用機制還不完全清楚1。成骨細胞主要完成成骨活動，

3、一般認為堿性磷酸酶(ALP)是成骨細胞分泌的早期標志，骨鈣素是成骨細胞分化成熟的標志，I型膠原也是成骨細胞的標志物之一。本文研究TCDD對大鼠成骨細胞增殖及分泌功能的作用機制，為TCDD在骨骼發(fā)育成骨細胞功能轉(zhuǎn)變方面研究提供理論依據(jù)。    1  材料與方法    1?1  材料  Wistar大鼠(中國醫(yī)科大學動物部)；TCDD、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑(美國Promega公司)；Trizol RNA抽提試劑和胎牛血清培養(yǎng)基(DMEM)(美國Gibco公司)。新生牛血清(杭

4、州四季青生物制品公司)；四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶，2型膠原酶，二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)。    1?2  成骨細胞的體外培養(yǎng)  取出生24 h內(nèi)的Wistar大鼠，采用顱蓋骨消化法培養(yǎng)成骨細胞。待細胞長滿培養(yǎng)瓶壁時傳代培養(yǎng)，傳至第2代時用差速貼壁法除去成纖維細胞。    1?3  TCDD作用成骨細胞  成骨細胞常規(guī)培養(yǎng)于10的DMEM培養(yǎng)基(含有10胎牛血清、100 U/ml青霉素、100

5、 g/ml鏈霉素)，在37、5CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長。培養(yǎng)24 h達對數(shù)生長期進行實驗。實驗分組：第1組第4組TCDD濃度分別為0，1×10-10，1×10-9，1×10-8 mol/L。TCDD均溶于DMSO，濃度為1×10-4 mol/L。第1組為對照組，加入等體積的DMSO，DMSO終體積不超過0?1，此濃度的DMSO對細胞生長無明顯影響。培養(yǎng)24 h后收集細胞。    1?4  MTT法檢測成骨細胞增殖  第2代成骨細胞以1×105/ml的密度分別植入3塊96孔板中，每板接種3

6、6孔，每孔100 l，用含10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24 h后換無血清DMEM再培養(yǎng)24 h(此為清洗期)；設立對照組，仍使用無血清DMEM培養(yǎng)，試驗組分別用含不同濃度TCDD的無血清DMEM培養(yǎng)，每組6孔，在設定的培養(yǎng)(24 h)結束前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)20 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150 l，振蕩10 min,使結晶物充分溶解，490 nm波長測定吸光度(A)值。    1?5  成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性檢測  第2代成骨細胞以3×104/ml的密度接種到2塊6孔板中

7、，每孔3 ml用含10%滅活胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)14 d(每3 d換液)，更換無血清培養(yǎng)基24 h后，設立的對照組(n=6)仍使用無血清DMEM培養(yǎng)，試驗組的培養(yǎng)液為含TCDD的無血清DMEM，培養(yǎng)48 h后，吸棄孔中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，每孔加入細胞裂解液1 ml(細胞裂解液配方：10 mmol/L pH=7?5的Tri.HCl加入體積比為0?1 Triton X-100)，37作用20 min，收集裂解液采用對硝基酚磷酸鹽法測定ALP濃度，采用Braford法測定裂解液中總蛋白濃度，ALP活性以U/mg蛋白表示。    

8、;1?6  統(tǒng)計分析  采用SPSS 12統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)。    2  結果    2?1  TCDD對成骨細胞增殖能力的影響(表1)  TCDD作用時間24 h，TCDD濃度在1×10-101×10-8mol/L之間，隨著TCDD濃度的遞增，原代培養(yǎng)的成骨細胞中MTT產(chǎn)物的A值呈下降趨勢，其中1×10-8mol/L的TCDD使成骨細胞增殖能力增加60%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。  

9、;  表1  TCDD對成骨細胞增殖及分泌功能的影響（略）    注：與對照組比較，* P<0?05    2?2  TCDD對成骨細胞ALP活性的促進作用  采用對硝基酚磷酸鹽法測定成骨細胞培養(yǎng)液中ALP的濃度，隨著TCDD濃度的遞增，原代培養(yǎng)的成骨細胞中ALP活性明顯降低，其中1×10-8mol/L的TCDD使成骨細胞ALP活性降低58，差異有統(tǒng)計學意義(P<0?05)。    3  討論&

10、#160;   隨著工業(yè)的發(fā)展環(huán)境污染日趨嚴重，TCDD對人類健康產(chǎn)生了嚴重的危害，導致腫瘤、免疫缺陷、神經(jīng)毒效應等，尤其是類似雌激素作用的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引起動物生殖變異，出生缺陷和骨質(zhì)疏松。但是，對骨骼發(fā)育及代謝的影響機制尚未完全闡明。Ivnitsk等2同用雞胚模型觀察到TCDD可以影響雞胚心肌細胞的增殖與凋亡，繼而影響心血管系統(tǒng)結構的正常發(fā)育，最終導致畸形的發(fā)生。成骨細胞的增殖及分泌功能被認為是骨骼發(fā)育、生長、重塑過程的關鍵環(huán)節(jié)3。成骨細胞的發(fā)育、成熟、活化受多種因素調(diào)控，其中雌激素能通過某些特定的細胞因子對成骨細胞的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TCDD明

11、顯抑制成骨細胞增殖能力。細胞的功能是指細胞在分化的基礎上完成特定功能活動，如分泌、傳導、吞噬等。成骨細胞具有分泌功能，一般認為ALP是成骨細胞分泌的早期標志4。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠顱蓋骨培養(yǎng)的成骨細胞中，1×10-8mol/L的TCDD明顯抑制成骨細胞增殖，并且顯著降低成骨細胞基質(zhì)中的ALP含量。TCDD對成骨細胞增殖、分化的差別可能與各細胞系的種屬差異、細胞異質(zhì)性、分化階段不一、TCDD受體含量低或受體變異等有關。    【參考文獻】  1 Yumei Guo，Andrew G，Hendrickx，et al.Endocrine bi

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13、pment is preceded by a decrease in myoeyte proliferation and an increase in cardiac apoptosisJ.Teratology,2001，64(4)：201-212.        3 Cointry GR，Capozza RF,Negri AL,et al.Biomeohanieal background for a noninvasive assessment of bone strength and muscle?bone interactionsJ.J Museuloskelet Neuronal Interact,2004，4(1)：1-11.        4 Coelho MJ，F(xiàn)emandes MH.Human bone cell calmros