1、食品中大腸菌群的檢驗與食品中大腸菌群的檢驗與分析分析組長：組員： 一、 目的1、了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛生檢驗中的意義。2、練習并掌握大腸菌群的檢驗方法。二、原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在37、24小時能發酵乳糖產酸產氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的亞屬細菌組成。典型大腸桿菌的IMViC與硫化氫實驗結果為+-2、測定的意義該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，具有廣泛的衛生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品

2、中大腸菌群數系以每1g（或mL）檢樣內大腸菌群最可能數MPN（themostprobablenumber-簡稱MPN）表示3大腸桿菌的生物學特性基本形態： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。在普通營養瓊脂上有3中菌落形態： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自

3、凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46。三 、 材料1、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發酵調味品或其他食品。2、陽性對照菌大腸桿菌3、 儀器設備除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：恒溫培養箱、恒溫水浴箱、 均質器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養皿、菌落計數器等。 4、 培養基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯、 煌綠乳糖膽鹽（BGLB ）肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ) 、無

4、菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH ) 、 1mol/L 鹽酸（HCI ) 。 每個組準備的東西：250ml錐形瓶（一個是含有225ml的生理鹽水，另一個是結晶紫中性紅膽鹽瓊脂）12支試管（3支9ml生理鹽水，7支月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯）1支10ml無菌移液管6支1ml無菌移液管（沒有備用試管，請謹慎使用）8個無菌培養皿（沒有備用器皿，請謹慎使用） 四、 檢驗方法第一法 大腸菌群MPN計數法。第二法 大腸菌群平板計數法。試驗流程第一法 大腸菌群MPN計數法1、樣品的稀釋（1） 固體和半固體樣品 稱取25g 樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌

5、均質杯內，8 000r/min-10000r/min 均質1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的樣品勻液。（2） 液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10 的樣品勻液。（3） 樣品勻液的pH 值應在6.5-7.5 之間，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸（HCI ）調節。（4） 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9

6、mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。（5）、 根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。 2、 初發酵試驗每個樣品，選擇3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）, 361 培養24h2h ，觀察倒管內

7、是否有氣泡產生，如未產氣則繼續培養至48h2h 。記錄在24h 和48h 內產氣的LST 肉湯管數。未產氣者為大腸菌群陰性，產氣者則進行復發酵試驗。（請大家明天中午過來觀察，并且記錄）3、 復發酵試驗用接種環從所有48h2h 內發酵產氣的LST 肉湯管中分別取培養物l環，移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB）肉湯管中，361 培養48h2h ，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。4、 大腸菌群最可能數（MPN ）的報告根據大腸菌群陽性管數，檢索MPN 表（見附錄B ) ，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN 值。注意：當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內的數也應相應減少或增加。 試驗流

8、程1、 樣品的稀釋直接使用按第一法中的稀釋液進行。2、 平板計數（1） 選取2個3個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2） 及時將15 mL-20mL冷至46 的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36l 培養18h-24h 。2、 平板計數（3） 平板菌落數的選擇選取菌落數在15-150 之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5 mm 或更大。2、 平板計數（4）、 證實試驗 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內，361 培養24h-48h ，觀察產氣情況。凡BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。2、 平板計數（5）大腸菌群平板計數的報告 經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每克（或毫升）樣品中