1、用純化的 INH 抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的INH抗體、 HRP 標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物（TMB）顯色。 TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的 INH 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1、酶標板： 一塊（ 96 孔）2、標準品 （凍干品）： 2瓶，請臨用前15 分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml ，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時反復顛倒 / 搓動以助溶解，其濃度為 4,000 pg/ml ，然后做系列倍比

2、稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋） ，分別配制成 4,000 pg/ml ，2,000 pg/ml ，1,000 pg/ml ， 500 pg/ml ， 250 pg/ml ，125 pg/ml ，62.5 pg/ml ，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml 。如配制 2,000 pg/ml標準品：取 0.3ml（不要少于 0.3ml） 4,000 pg/ml的上述標準品加入含有 0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。1、酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）2、微量加液器及吸頭，EP 管3、蒸餾水或去離子水，濾紙標本的采集及保存1、 血清：全血標本請于室

3、溫放置 2 小時或 4 過夜后于 1000 g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于 -20 或-80 保存，但應避免反復凍融。2、 血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 1000 g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于 -20 或 -80 保存，但應避免反復凍融。3、其它生物標本：請 1000g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于 -20或-80保存，但應避免反復凍融。操作步驟實驗開始前， 各試劑均應平衡至室溫， 試劑不能直接在 37 溶解；試劑或樣品配制時， 均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過

4、高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100，余孔分別加標準品或待測樣品 100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜， 37 溫育 2 小時。 ELISA 試劑盒性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加ELISA試劑盒100（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育 1 小時。3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 400 / 每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍

5、干）。4、每孔加 檢測溶液 B 工作液 （臨用前配制） 100，加上覆膜， 37溫育 1 小時。5、棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟3。6、 每孔加 底物溶液 90 ，酶標板加上覆膜 37 避光顯色 （反應時間控制在 15-30分鐘，當標準孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯時，即可終止）。7、 每孔加 終止溶液 50 ，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。8、 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（值）注：5、在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、ELISA試劑盒工作液、

6、檢測溶液 B 工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請精確配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液 A 時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液 A 工作液、 檢測溶液 B 工作液。6、 反應時間的控制： 加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。7、 底物： 底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射洗板方法1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，吸去（不可

7、觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據需要，重復此過程數次。2、自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性本試劑盒可同時檢測重組或天然的人INH ，且與其它相關蛋白無交叉反應。計算各標準品及樣本值扣除空白孔值后作圖（七點圖），如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數坐標），值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3，根據樣品值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數； 或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式， 將樣

8、品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。檢測范圍：2,000 pg/ml62.5 pg/ml - 4,000 pg/ml， 1,000 pg/ml，500 pg/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：4,000 pg/ml，250 pg/ml， 125 pg/ml，62.5 pg/ml。，最低檢測限 ： 15.6 pg/ml說明1 、 由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。2 、 最終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請務必準備充足的標本備份。3 、 只有全部使用ELISA試劑盒才能保證檢測效果，因為所有試劑都是有關聯的，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守 ELISA 試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結果。如果由于實驗者的操作失誤或試劑盒保存不當導致結果不佳，不屬產品質量問題。4 、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。5、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A 和檢測溶液 B 保存于 -20，其余試劑短期保存請置于4 ，長期保存則置于 -20 。開封后的