1、熒光探針定量PCR檢測HBV-DNA賴宏芳付曉野董玉琳鄧志軍 摘要本文采用熒光探針定量(FQ-PCR)法準確定量檢測HBV-M陽性標本中的HBV-DNA數量。結果顯示：HBeAg(+)組(32份)的陽性率為100%，HBV-DNA拷貝數范圍在105109/ml之間。HBeAb(+)組(47份)的陽性率為23.4%，HBV-DNA拷貝數范圍在103105.7/ml之間；HBsAb(+)組(37份)的陽性率為2.7%，HBV-DNA拷貝數為105/ml。以上44例HBV-DNA陽性拷貝數范圍在103109/ml之間。HBeAg(+)組血清中HBV-DNA含量(107.091顯著高于HBeAb(+)

2、組(104.71)和HBsAb(+)組(105)。結果表明：HBV-DNA的FQ-PCR檢測較常規PCR更具有較高的靈敏度和特異性，且定量準確，結果可靠，能避免PCR后處理污染導致的假陽性，可反映HBV真實感染和低復制狀態。結合HBV-DNA含量測定判斷HBV病毒復制狀態，對臨床診斷、治療及判斷預后具有重要的指導意義。 關鍵詞乙型肝炎病毒熒光探針定量-聚合酶鏈反應脫氧核糖核酸 常規PCR技術因存在擴增產物污染、所用染色劑溴化乙啶是強烈致癌物，以及臨床不能準確定量等缺點。為此，本文采用FQ-PCR法，以克服常規PCR的不足。對116例ELISA法檢測的乙肝血清標志物(HBV-M)陽性的標本進行H

3、BV-DNA測定，以探討FQ-PCR技術在HBV病原體感染診斷中的臨床應用價值。 材料和方法 一、材料和儀器116份經HBV-M檢測陽性的血清，HBV-M ELISA試劑盒，廈門新創科技公司提供。FQ-PCR試劑盒，中山醫科大學達安基因診斷中心提供。檢測儀器為PE7700自動熒光PCR儀(美國PE公司)。 二、檢測方法FQ-PCR法是在常規PCR基礎上，添加了一條標記熒光發光分子和一個熒光淬滅分子的雙標記探針，前者標記5端，后者標記在3端。完整的探針在激光激發下，發光分子所產生的熒光被淬滅分子全部吸收，從而無熒光。PCR擴增中Taq酶在鏈延長過程中可以通過自身的53核酸外切酶活性而降解，與模板

4、結合的特異性熒光探針(切口平移效應)2，使得熒光發光分子從探針上切下，而與熒光淬滅分子分開，從而在激光激發下產生特定波長的熒光。這種熒光隨著PCR擴增過程而動態性增強。FQ-PCR儀通過全過程動態監測可以得到每一個樣品實際擴增曲線以找到PCR擴增的對數期，比較標準樣品(單位：拷貝數/ml)的對數期，得出每一樣品特定模板DNA的起始拷貝數/ml。 定量范圍為01010/ml，定量準確度為100%。 本法操作是用常規的堿裂解法從血清中提取HBV-DNA。各反應管放入PE7700自動熒光檢測儀，按下列條件擴增：93 2 min預變性，然后按照9345 s，55120 s，共經40個循環后，由儀器軟件

5、自動分析計算出定量結果。 定量結果采用計算對數平均值的方法來計算HBV-DNA平均拷貝數，遇有陰性結果，不參加平均值的統計。其單位采用：拷貝數/ml。 結果 116例HBV-M陽性標本用FQ-PCR檢測HBV-DNA含量詳見附表：檢測HBV-DNA拷貝數范圍在103109/ml之間。 附表FQ-PCR檢測的HBV-DNA含量(s) 組別 例數 陽性數(%) HBV-DNA (以指數表示) P值(與1比) 1.HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+ 32 32 (100) 7.091.03 2.HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+ 47 11 (23.4) 4.71 0.01 3.HBsA

6、b+ 37 1 (2.7) 5 0.01 注：各組拷貝數范圍為：101.96s/ml HBeAg(+)組HBV-DNA拷貝數范圍在105109/ml之間，其HBV-DNA含量顯著高于HBeAb(+)組與HBsAb(+)組 HBeAb(+)組11例HBV-DNA拷貝數范圍在103107/ml之間。 HBsAb(+)組只檢出1例HBV-DNA拷貝數為105/ml。 討論 熒光探針定量PCR技術融匯PCR和DNA探針雜交技術的優點，直接探測PCR過程中熒光信號的變化，根據PCR反應的酶動力學特點，獲得DNA模板的準確定量結果。該技術整個實驗過程均在完全閉管的狀態下進行，無需PCR后處理和冗長的電泳、

7、紫外或染色檢測，解決了常規PCR實驗不能準確定量及擴增產物污染而導致的假陽性，操作繁復以及強烈致癌物溴化乙啶對操作人員的危害和污染環境等問題，成為常規PCR的更新換代技術。 本文采用的FQ-PCR試劑盒用中國藥品生物制品檢定所的靈敏度標準品測試，靈敏度可達到0.01 fg/ml，相當于2.5個HBV Dane顆粒/ml，其靈敏度亦高于常規PCR的102103個拷貝/ml。 FQ-PCR可以準確定量出01010個拷貝的病原體，定量范圍極寬，具有重要的臨床診斷價值。以乙肝為例，HBsAg強陽性的血清中可測出高達105109病毒顆粒，隨著治療的進程，病毒拷貝數逐步減少，部分病人完全轉陰，多數病人在H

8、BsAg轉陰后HBV DNA仍呈陽性。據此，可建立乙肝治愈與否的分子診斷標準。而PCR定性測定難以得出治愈與否的判定。 FQ-PCR法采用實時檢測技術，可以得到每一個樣品實際擴增曲線以找到PCR擴增對數期，以標準品比較，所得值與原始模板數量呈線性相關，定量準確率較高。有資料顯示：常規PCR在實驗過程中，影響實驗結果的因素很多，在實驗中沒有對照標準，故其結果很難重復3。此外常規PCR法的定量是針對PCR終產物進行的，其平臺效應大為干擾了PCR的原始數量和終產物之間的相關性，使定量準確度難以提高4。 本文結果顯示：標志感染期HBeAg(+)組：FQ-PCR定量的平均拷貝數為107/ml，標志恢復期

9、HBeAb(+)和HBsAg(+)組：FQ-PCR定量的平均拷貝數為104.7/ml和105/ml，以上結果表明：FQ-PCR可以清楚反映乙肝患者的病程變化情況及真實反映HBV的感染和復制情況。進而用于臨床診斷、治療和療效觀察，將有較高的臨床應用價值。 賴宏芳（昆明市延安醫院650051） 付曉野（昆明市延安醫院650051） 董玉琳（昆明市延安醫院650051） 鄧志軍（中山醫科大學達安基因診斷中心） 參考文獻 1張復春，吳婉芬，董惠卿，等中華傳染病雜志，1997；15(1)24 2Holland P M,Abramson R D,Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5to 3exonuclease a