1、文件名稱AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程頒發部門制訂人：復核人：批準人：質保部制訂日期：復核日期：批準日期：執行日期版本1.0編號SOP04006制作份數份發送部門修訂記錄修訂人修訂原因修訂內容版本修訂日期1. 目的：確保熒光定量PCR儀能夠正確和正常的使用，保證擴增及結果分析的標準化、標準化。2. 范圍：適用于AB7500熒光定量PCR儀的使用及維護。3. 定義：無4. 職責：熒光定量PCR儀使用人員負責本規程的實施。質保部對本規定的有效執行承當監督檢查責任。5. 內容：5.1室內溫度控制在 1530 C,相對濕度 4575%。5.2儀器操作依次翻開電腦顯示器和電腦主

2、機的電源開關，進入Windows界面。接著翻開AB7500儀器電源開關，預熱 10分鐘。點擊7500 Software v2.3 圖標，翻開軟件。按壓儀器托盤上的按壓位，待托盤彈出后，將所需檢測的8聯PCR反響管或者96孔PCR反響板放入檢測孔位，記下放置位置。檢測8聯PCR反響管用*反響孔模塊，檢測 96孔PCR反響板用*反響孔模塊。檢測8聯PCR反響管需放入蓋緊管蓋的空8聯PCR反響管配平，檢測 96孔PCR反響板無需配平再次按壓托盤使其滑入儀器。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 2 / 29新建擴增參數模板：例如新建一個UG-63-62的模板，擴

3、增參數是95° 10'95° 10； 63°45"X5 cycles ;95° 10； 62° 35M0 cycles ,在 62°時收集熒光信號 HEX、FAM 信號， 20卩反響體系。5.2.6.1 在 Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples 中，將 Target Name 下的 Target1 改成 FAM ;點擊Add New Target，將新增的 Target1改成HEX，點擊 Reportee下拉菜單，選擇 VIC。5.262 在 Setup-Run M

4、ethod-Graphical View 中的 Reaction Volume Per Well 后面輸入 20 20 口1 反響 體系。選中第一個 Holding Stage ,點擊 Delete Selected 刪除；在 Cycling Stage 中的 Number of Cycles后輸入5，在Step1中輸入時間10秒，在Step2中輸入溫度63度，輸入時間45秒， 將63度下面收集熒光圖標點掉；點擊Add Stage下拉菜單項選擇擇 Cycling ,在Cycling Stage中的Number of Cycles后輸入40,在Step1中輸入時間10秒，在Step2中輸入溫度

5、62度， 輸入時間35秒，在62度下面點擊圖標收集熒光。5.2.6.3 點擊 Save 下拉菜 單下的 Save As Tamplate ,文件 名輸入 UG-63-62 ,保存在默認 ab7500-c on fig-tamplates文件夾內，關閉設置界面。已有擴增參數模板：在軟件 Home界面中點擊 Template，選擇需要的模板，點擊翻開。例如：UG-63-62 ,其擴增參數就是 95° 10；95° 10" 63° , 45" X5 cycles ；95° 10" 62° , 35" >4

6、0 cycles，在 62° 時收集熒光信號HEX、FAM 信號，Reaction Volume Per Well :20 卩120卩1 反響體系。5.2.8 在 Setup-Plate Setup-Assign Targets and Samples 中選擇 8 聯管擺放的位置，全部勾選 Sample 1 ；UGT1A1*6 勾選 HEX , UGT1A1*28 勾選 FAM。5.2.9 在Run-AmplificationPlot中點擊 START RUN，命名為20210101-1 當日日期+當日上機次數，例:2021年1月1日第1次上機編號為20210101-1，保存在默認文

7、件夾中，開始運行。結果分析5.2.10.1 PCR反響結束后自動保存結果，對擴增曲線進行分析。也可根據分析后圖像調節Baseline的Start值、End值以用戶可根據實際情況自行調整，Start值可以在 315、End值可設在 520，Threshold 值Rn丨推薦設定為 500015000，點 擊Analyze進行分析，然后到 Plate窗口下記錄每個反響的Ct值。實驗結束后取出反響管切勿翻開管蓋，順序關閉AB7500軟件、定量PCR儀電源，關閉電腦。5.3儀器維護每周維護文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程檢查電腦磁盤空間。如需要，將實驗文件歸檔或備份。?

8、至少每周檢查一次電腦磁盤空間。?如果硬盤的可用空間缺乏其總容量的20%，應將較陳舊的數據傳輸到備份存儲設備上保存。關閉控制7500 Instrument的電腦，30秒后再次開啟電腦。用無絨布塊不脫毛蘸取 75%酒精清潔7500 Instrument的外表。注：切勿使用有機溶劑清潔 7500 Instrument。使用75%酒精浸泡反響管托架晾干后放回儀器內 。每月維護執行背景校準。可執行一次背景校準以檢查是否存在污染物5.322運行磁盤清理和磁盤碎片整理。?至少每月一次。?當Windows ?操作系統顯示消息提示執行碎片整理時。?切勿同時運行磁盤管理實用工具和7500 Real-Time PC

9、R Software 。每半年6個月維護檢查燈具狀態。 在 7500 Software 中，選擇 Instrument 宀 Lamp Status/Replacement以確定鹵素燈的狀態。顯示 Lamp Status/Replacement對話框：? Condition-表示以下其中一種狀況：-Good -燈具工作良好，不需要更換。單擊Close。-Failed -必須更換燈具。單擊 Close，然后按照步驟更換鹵素燈。-Change Soon-燈具使用超過 2000小時；生產商建議將其更換。單擊Close，然后決定是否更換燈具。如果斷定更換，請按照步驟更換鹵素燈。? Usage (Hour

10、s)-燈具已照明的總小時數。? Lamp Current-燈具的輸出電流，以安培為單位(A)。低電流意味著燈具可能將要失效。? Date Last Replaced-上次更換燈具的日期。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 4 / 29Lamp Status J ReplacementCurrent Lamp StatusConditl ori:GoodUsag« (Hours):0Lamp Current:UnknownDate Last Replaced: 10/01/200?Re卩 lace Lei m pReset Lamp TimerY

11、ou must reset the lamp timer after replacing the lamp.NOTE: The lamp timer cn only be lesetwhen tfie instrument is idle.在執行一次運行之前或期間，7500 Software可能顯示以下警告:消息描述Warning - Cannot detect sufficientcurrent from在運行開始時，燈具電流低于可接受水平。在lamp. Either lamp is notinstalled properly or|按照步驟更換鹵素燈具之前，無法繼n eeds to ber

12、eplaced.續該運行。Warning - Cannot detect sufficientcurrent from7500 Software停止了該次運行，因為在運行lamp. Either lamp is notinstalled properly or中燈具電流下降到可接受水平之下。在按照n eeds to bereplaced.步驟更換鹵素燈具之前，無法繼續該運行。在消息框中單擊 OK,檢查儀器日志，然后更換燈具。Warning - The lamp usage hasexceeded 2000在運行開始時，燈具使用時間超過2000小時。hr. We recommendreplaci

13、ngthe lamp soon to單擊Cancel Run，然后更換燈具，或者單擊en sure optimal assay performa nee.Continue Run。重新運仃 ROI、背景、光學和染料校準。執行目標區ROI校正。執行背景校準。執行光學校準。執行染料校準。執行RNase P儀器驗證試驗。其它維護任務需要時執行樣本塊污染去除。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程執行以下程序，去除7500 Instrument樣本塊的熒光污染。熒光污染是導致背景運行失敗的常見原因，在此情況下，一個或多個反響孔會持續表現出異常的高信號。注意！切勿移去設備上的

14、蓋板。7500 Instrument中沒有用戶可平安維修的組件。如果疑心存在 問題，請聯系生產商效勞代表。 全程戴上一次性無粉手套操作。 找到樣本塊中受污染的反響孔參閱542.13“如何確定污染。 從7500 Real-Time PCR Instrument中取出反響板和托盤支架。a. 按壓托盤門，將其翻開。b. 取出反響板和托盤支架。c. 關閉托盤門。以一定角度向托盤右側施加壓力。 手動降低樣本塊:a. 在 7500 Software 中，選擇 Instrument 宀 Instrument Maintenance Manager 。b. 在 Instrument Maintenance M

15、anager 的 ROI 選項卡中，單擊 Start Manual Calibration 。 c .在 ROI Inspector 對話框中，單擊 Move Block。d.當 ROI Inspector 對話框顯示“ Block Down 時，單擊 Done。 關閉7500 Real-Time PCR Instrument，然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻 15分鐘。 翻開 7500 Real-Time PCR Instrument的檢查門。a. 將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔內，然后推動以解開門栓。b. 翻開儀器前門。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規

16、程抬起門栓，然后將受熱的護蓋門推到儀器的反面。 使用少量的雙蒸水，清潔樣本塊中被污染的反響孔：a. 用移液管吸取少量雙蒸水并滴入每個受污染的反響孔中。b. 抽吸并滴入反響孔中的雙蒸水數次，以沖洗反響孔。c. 將用過的雙蒸水水吸入廢液瓶中。d. 使用棉花拭子，擦試每個被污染的反響孔的內壁。e. 使用無絨布料，吸出剩余的雙蒸水。 7500 Real-Time PCR In strume nt將受熱的護蓋門拉到儀器的正面。抬起門栓，然后將受熱的護蓋門緊固到交叉桿。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程 翻開 7500 Real-Time PCR Instrument的檢查

17、門。?插上電源插頭并開啟 7500 Instrument 。?通過執行背景校準運行確認已消除污染參閱 5.4.2 “背景校準。?如果污染仍然存在，重復步驟至，然后使用95%乙醇溶液清潔樣本塊中受污染的反響孔：a. 用移液管吸取少量 95%乙醇溶液并滴入每個受污染的反響孔中。b. 抽吸并滴入反響孔中的溶液數次，以沖洗反響孔。c. 將用過的乙醇溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反響孔之后，應始終使用雙蒸水沖洗反響孔。?重復步驟至？，以沖洗樣本塊的反響孔，并驗證已去除掉污染物。?如果污染仍然存在，重復步驟至，然后使用10%漂白劑溶液清潔樣本塊中受污染的反響 孔：a. 用移液管吸取少

18、量10%漂白劑溶液并滴入每個受污染的反響孔中。b. 抽吸并滴入反響孔中的溶液數次，以沖洗反響孔。c. 將用過的漂白劑溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反響孔之后，應始終使用去離子水沖洗反響孔。?重復步驟至？，以沖洗樣本塊的反響孔，并驗證已去除掉污染物。如果仍有污染，請與生 產商技術支持聯系。?確保受熱蓋門完全關閉并上閂。如果沒有，那么7500 Software顯示錯誤消息。5.342移動PCR儀。更換或移動光學器件的任何部件后，必須執行ROI校準、背景校準、光學校準、染料校準以及 RNase P儀器驗證。更換鹵素燈。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操

19、作規程 全程戴上一次性無粉手套操作。 關閉7500 Instrument，然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻15分鐘。a. 注意！灼熱。7500 In strume nt和燈具灼熱！燈具在使用中會變得非常灼熱。在處理燈具之 前，應允許燈具冷卻 15分鐘，并戴上無粉防護手套。b. 重要！為防止灼傷及縮短新燈具的使用壽命，處理燈具時請戴上一次性無粉手套。c. 注意！ 7500 Instrument按設計僅可使用12V、75W的鹵素燈。 翻開7500 Instrument的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔內，然后推動以解開門栓。a. 向下滑動燈具釋放桿。b. 用手緊緊地抓住鹵素燈并向上

20、提，使燈具從安裝槽口中脫出。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程ab查看燈具并確定有無故障跡象有故障的燈具內壁上通常有碳黑層。將新燈具安裝至儀器上：a. 向上滑動燈具釋放桿。b. 用手緊緊地握住燈具，將燈具放入帶槽口的安裝座內，然后小心地向下滑動燈具，使其到位。關閉儀器前門。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程 插上電源插頭并開啟7500 In strume nt 翻開 ROI Inspector 對話框:a. 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentInstrument Maintenance Managerb

21、.在 Instrument Maintenance Manager的 ROI 選項卡中，單擊 Start Manual Calibration。Done 。 在 ROI Inspector 對話框中，選擇 Lamp ControlIdle。?當儀器運行時，通過檢查門上的縫隙觀察，確保燈具發光，然后單擊t Lamp Status/Replacement ，單擊Reset Lamp Timer ，然后單擊OK。如果燈具不發光，那么替換的鹵素燈可能有缺陷。重新更換 燈具。如果再次更換燈具后仍不發光，檢查儀器的保險絲是否存在故障參閱第71頁。?更換燈具后，按順序執行以下校準。請參閱：? 目標區ROI丨

22、校準? 背景校準? 光學校準 ? 染料校準? 驗證儀器性能5.3.4.4 更換 7500 Instrument 保險絲。 保險絲損壞時，更換7500 Real-Time PCR In strume nt保險絲。注意！為在長時間內防止火災，更換保險絲時請使用類型和額定值與儀器原始保險絲相同的經認可的保險絲。 全程戴上一次性無粉手套操作。 關閉儀器電源，并拔下電源插頭。 使用平口螺絲刀從儀器上旋松并卸下保險絲座。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程 將每一個保險絲從其保險絲座中取出，然后檢查是否損壞。損壞的保險絲內部通常有炭黑覆蓋。好的保臉世損壞朗怪忙汙 使用12.5

23、A、250V、5X 20mm保險絲更換損壞的保險絲。注：電壓和電流額定值見保險絲座。說明保險絲已安裝成功。注：保險絲損壞可能是由儀器供電電源波動導致。為了防止繼續出現故障，可以考慮安裝電氣 保護設備，例如 UPS或其他電涌保護器。5.345 更新 Windows ?操作系統。5.346 更新 7500 Software。監控儀器狀態使用Function Test對話框對主要 7500 Instrument組件執行高級診斷。一般情文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 12 / 29況下不需要執行功能測試，除非疑心有硬件故障，或者Life Tech no lo

24、gies代表指示這樣做。 在 7500 Software 中，選擇 Instrument 宀 Function-Test 。 根據需要執行功能測試。要測試：所有組件-單擊 All Tests，然后等候軟件執行所有功能測試。一個或多個特定組件-單擊以下其中一項或多項。? USB -測試 7500 Real-Time PCR Instrument和電腦之間的通用串行總線USB連接。如果7500 Software 能夠和7500 Real-Time PCR Instrument建立通信，那么表示測試通過。? CCD -測試7500 Real-Time PCR Instrument 內的CCD攝像機。

25、如果攝像機能夠拍攝圖像，那么表示測試通過。? Filter Wheel -測試7500 Real-Time PCR Instrument內的過濾輪。如果過濾輪控制器運行正確版本的固件，那么表示測試通過。? Shutter -測試7500 Real-Time PCR Instrument的光學快門。如果快門控制器運行正確版本的固件，那么表示測試通過。? Lamp -測試7500 Real-Time PCR Instrument的鹵素燈。如果燈具控制器運行正確版本的固件，那么表示測試通過。? Thermal Cycler -測試7500 Real-Time PCR Instrument內的熱循環儀

26、樣本塊。如果熱循環儀的控制器運行正確版本的固件，那么表示測試通過。當7500 Software完成一項測試時，軟件報告該測試的通過/失敗狀態，并提供結果描述。rFunction Test回Pass/FailDescriptionUSBPass|USB checkCCDPassCCDFiler VMneelPass|Fiiter Wheel check passelShutterPass|Shutt§rcck pawwmd.LanvPass|Lamp ch« tk passedThermo CyclerAll TestsPassPassrhermo Cycler check

27、passed.Close結束測試時，單擊Close 。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程5.4儀器校準目標區ROI丨校準全程戴上一次性無粉手套操作。從貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中取出 ROI校準反響板。讓ROI校準反響板溫度上升至室內溫度約需 5分鐘。在立即運行反響板之前，不要從包裝袋 內取出ROI校準反響板。反響孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時間曝光可降低染料在反響 板中的熒光。從包裝袋中取出 ROI校準反響板。將光學薄膜留在反響板上。不要丟棄存放ROI校準反響板的包裝袋。假設貯存于原始包袋中，反響板最多可重復使用三次。振蕩ROI校準反響板5秒鐘。用板式離

28、心機將反響板離心 2分鐘。ROI校準反響板必須充分混合并離心。確認ROI校準反響板每個反響孔中的液體均位于反響孔底部。如果不是，那么以更高的轉速及更 長的時間離心反響板。按壓托盤門，將其翻開。將反響板裝入儀器中的反響板架。確保放置時反響板在反響孔板適配器中被正確對齊。裝入標準反響板，使 A12凹口位置位于托盤的右上角。以一定角度向托盤右側施加壓力，從而關閉托盤門。5.4.1.10 執行自動 ROI校準 在 7500 Software 中，選擇 Instrument 宀 Instrument Maintenance Manager。 在 Instrument Maintenance Manage

29、r的 ROI 選項卡中，單擊 Start Calibration 。 按照向導的指示，完成校準。ROI Calibration 對話框顯示三個選項卡：? Setup -顯示ROI校準設置說明。單擊 Next提示可以翻開 Run選項卡。? Run -單擊START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以翻開Analysis 選項卡。? Analysis -指明校準狀態Passed/Failed。如果校準失敗，請參閱5.4.1.13 “排除ROI校準故障。執行手動ROI校準 在 7500 Software 中，選擇 Instrument 宀 Instrument Mainten

30、ance Manager。 在 Instrument Maintenance Manager的 ROI 選項卡中，單擊 Start Manual Calibration。 在ROI Inspector對話框中如圖 1：文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程a. 在 Exposure Time 字段中，輸入 2048。b. 選擇Filter A濾光器1。圖1 單擊Snapshot，生成一張 ROI圖像。 確定ROI圖像是否可接受以下圖所示為未飽和以及過飽和的圖像。可接受圖像中的反響孔：?在不過飽和的前提下，必須盡可能明亮。生成ROI校準時，如果反響孔過飽和，那么顯示一

31、條警告。?可以含有但不是必須含有紅色像素表示飽和。未飽和正常飽和過度飽和如果ROI圖像可接受，轉至步驟。如果ROI圖像過飽和，將 Exposure Time降低一半,然后單擊Snapshot。重復執行，直至獲得可接受的ROI圖像。如果無法獲得可接受的圖像，請參閱5.4.1.13 “排除ROI校準故障。 單擊Generate Calibration。 7500 Software 采集一張截圖，然后顯示一個消息框或ROI圖像：如果軟件顯示：執行：文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 15 / 29單擊 Save Calibration 。軟件保存濾光器 1新產

32、生的ROI校準。在ROI Inspector的Filter Masks Loaded 區域，"OK文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程出現在濾光器1旁邊。Exposure Time 重置為對其余濾光器重復步驟至，對每個濾光器執行校準之前，將2048。當所有濾光器的Filter Masks Loaded 都顯示 OK時，ROI校準完成。E-£w»1rtirn|L«TvCortFriL<jiif-elnfwMtF Mi Rib： r aF胡In紳即憫 Wdt F»nnd' %£鼻吒町 qA1 O

33、K B OK C：QKD 0* t：OK當所有濾光器的 Filter Masks Loaded 都是OK時，校準完成。點擊Done。拆卸反響板注意！灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過 100 ° C。假設剛使用過儀器,在樣本塊恢復至室溫之前，請勿觸摸樣本塊。 取出校準反響板：a. 按壓托盤門，將其翻開。b. 取出校準反響板。c. 按壓托盤門，將其關閉。 將校準反響板放入其包裝套中。如果要執行背景和光學校準:a. 在接下來的8小時，將ROI校準反響板置于室溫下。光學校準使用ROI校準反響板。b. 第二天將放入包裝套的反響板放回貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中。c. 重要！不要丟棄校準

34、反響板。如果將反響板裝在其原始包裝套內貯存，在翻開其包裝后最 多可重復使用反響板 3次。d. 重要！執行ROI校準后，也必須執行背景校準、光學校準、染料校準以及儀器驗證。排除ROI校準故障問題/病癥可能原因行動ROI校準失敗ROI圖像模糊樣本塊可能位于降低的位置。1.如果 ROI Inspector 的 CCD Control/Settings 顯示"BlockUp ，那么單擊Block Up將樣本塊升高文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 17 / 29單擊2.檢查確認受熱的蓋組件已被全程向前拉出，以確保托盤可以被正確推入。如果 7500 In

35、 strume nt安裝了受熱蓋栓，檢查確認蓋栓處于鎖定位置。3.如果ROI校準仍然失敗， 檢查7500 Instrument內的鹵素燈狀態參閱5.3.3.1 “監控燈具狀態，然后，如果需要時，更換燈具參閱5.343 “更換鹵素燈。背景校準全程戴上一次性無粉手套操作。542.2從貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中取出準備好的背景反響板。542.3讓背景反響板溫度上升至室溫至少需要 5分鐘。從包裝袋中取出背景反響板。重要！不要丟棄存放反響板的包裝袋。假設將背景反響板貯存在其原始包裝套內，背景反響板最多可重復使用三次。振蕩反響板5秒鐘。用板式離心機將反響板離心2分鐘。反響板必須充分混合并離心。確認反響

36、板每個背景反響孔中的液體均位于反響孔底部。如果不是，那么以更長的時間離心反響板。按壓托盤門，將其翻開。將反響板裝入儀器中的反響板架。確保放置時反響板在反響孔板適配器中被正確對齊。以一定角度向托盤右側施加壓力，從而關閉托盤門。注：如果無法翻開托盤，樣本塊可能位于其“升高位置，鎖定了托盤門位置。要降低樣本塊，選擇Instrument宀Calibrate | 然后退出 ROI Inspector。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程542.8 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentInstrument Maintenance Manager。在

37、InstrumentMaintenance Manager 中，選擇 Background 選項卡。在 Background 選項卡中，單擊 Start Calibration 。按照向導的指示，完成校準。 Background Calibration對話框顯示四個選項卡：? Overview -顯示校準相關信息。? Setup -顯示背景校準設置說明。單擊Next提示可以翻開 Run選項卡。? Run -單擊 START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以翻開Analysis選項卡。? Analysis -指明校準狀態(Passed/Failed)。如果校準失敗，請參

38、閱5.4.2.12 “排除背景校準故障。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間最多可達10分鐘，以允許受熱的護蓋到達正確溫度。校準完成后，取出校準反響板： 按壓托盤門，將其翻開。 取出校準反響板。 按壓托盤門，使其滑入儀器。將校準反響板放入其包裝套內，并將包裝好的反響板放回冷凍柜內的光譜校準套件中。重要！不要丟棄校準反響板。如果將反響板裝在其原始包裝套內貯存，在初次翻開其包裝后最多可重復使用反響板3次。排除背景校準故障問題/病癥可能原因行動背景校準失敗背景反響板上的一個或多 J1.使用相同的背景反響板重復執行校準。個反響孔產生的光譜超過2.假設校準再次失敗，請使用另一不同的背景儀器的最高限度。

39、反響板重復執行校準。3.假設校準再次失敗，請按下文“如何確定污染的說明，確定污染源。如何確定污染假設信號超過正常背景熒光的限度，那么說明校準反響板或樣本塊上存在熒光污染物。常見污染物包括記號筆中殘存的油墨、一次性手套灑落的粉末及灰塵。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 19 / 29欲確定污染來源和位置： 在查看原始數據時，選擇反響板布局中數塊連續的較小區域，以找出受污染反響孔的位置。 將背景反響板旋轉180。，然后再次執行背景校準。 重復步驟以找出污染物的位置。如果步驟和中找到的包含污染物的反響孔位置：?相同-那么說明樣本塊中含有污染物。請按照“樣本塊

40、污染去除的說明，除去樣本塊中的污染物。?相反-那么說明背景反響板中含有污染物。丟棄當前使用的背景反響板，并使用新背景反響板執行背景校準程序。如果更換背景反響板并且取出樣本塊的污染后校準失敗： 將用黑紙覆蓋的反響板裝入7500 Instrument 。 按照本章的說明，執行背景校準程序。 校準完成后，選擇反響板布局中的所有反響孔。 查看光譜圖譜中的峰值。如果峰值：?可見-那么說明7500 Instrument的光學部件可能已被污染。請與生產商聯系。?不存在-那么說明樣本塊已被污染。請按照“樣本塊污染去除的說明，除去樣本塊中的污染物。光學校準全程戴上一次性無粉手套操作。543.2從貯存在冷凍柜內的

41、光譜校準套件中取出ROI校準反響板。543.3讓ROI校準反響板溫度上升至室溫至少需要 5分鐘。從包裝袋中取出 ROI校準反響板，振蕩反響板5秒鐘。重要！不要丟棄存放反響板的包裝袋。假設將ROI校準反響板貯存在其原始包裝套內，ROI校準反響板最多可重復使用三次。如果執行ROI校準后，將ROI校準反響板保持在室溫，那么跳到步驟，以減少在反響板在室溫時形成的冷凝。如果ROI校準反響板位于冷凍柜中，轉至步驟。用板式離心機將反響板離心2分鐘。ROI校準反響板必須充分混合并離心。確認ROI校準反響板每個反響孔中的液體均位于反響孔底部。如果不是，那么以更長的時間離心反響板。按壓托盤門，將其翻開。將反響板裝

42、入儀器中的反響板架。確保放置時反響板在反響孔板適配器中被正確對齊。以一定角度向托盤右側施加壓力，從而關閉托盤門。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程543.7 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentInstrument Maintenance Manager。在 InstrumentMaintenance Manager 中，選擇 Optical 選項卡。在 Optical 選項卡中，單擊 Start Calibration 。 按照向導的指示，完成校準。Optical Calibration 對話框顯示四個選項卡：? Overview -

43、顯示校準相關信息。|? Setup -顯示光學校準設置說明。單擊 Next提示可以翻開 Run選項卡。? Run -單擊START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以翻開 Analysis選項卡。? Analysis -指明校準狀態(Passed/Failed)。如果校準失敗，請參閱5.4.2.12“排除背景校準故障。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間最多可達10分鐘，以允許受熱的護蓋到達正確溫度。取出校準反響板： 按壓托盤門，將其翻開。 取出校準反響板。 按壓托盤門，使其滑入儀器。將校準反響板放入其包裝套中。將放入包裝套的反響板放回貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中。

44、重要！不要丟棄校準反響板。如果將反響板裝在其原始包裝套內貯存，在翻開其包裝后最多可重復使用反響板 3次。染料校準全程戴上一次性無粉手套操作。從冷凍柜中取出光譜校準套件，并從套件內取出所有染料反響板。將光譜校準套件放回冷凍柜貯藏。讓染料反響板溫度上升至室內溫度約需 5分鐘。重要！在立即運行之前，請勿從包裝袋內取出染料反響板。在每個染料反響板上，反響孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時間暴露在光線中會降低反響板的熒光信號強度。注：如果將7500 Real-Time PCR Instrument染料反響板貯存在其原始包裝內并放在冷凍柜中，那么在翻開包裝后 6個月內可以校準 7500 Real-Time

45、 PCR Instrument最多3次。5.4.4.5 在 7500 Software 中，選擇 InstrumentInstrument Maintenance Manager。在 InstrumentMaintenance Manager 中，選擇 Dye 選項卡。在 Dye 屏幕上，選擇 System Dye Calibration。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 21 / 29單擊 Start Calibration 。544.6按照向導的指示，完成每個反響板的校準。重要！在每個校準中，向導將單獨指示。必須獨立設置、運行和分析每個染料反響板。

46、Dye Calibration對話框顯示四個選項卡：? Overview -顯示校準相關信息。當軟件提示獲取需要的材料時，選擇要校準的染料。? Setup -顯示染料校準設置說明。單擊Next提示可以翻開 Run選項卡。當軟件提示裝入染料反響板時，按照步驟 所述準備并裝載反響板。? Run -單擊 START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以翻開Analysis選項卡。? Analysis -指明校準狀態(Passed/Failed)。當軟件提示分析從每個染料反響板采集的光譜時， 核實校準的狀態：? Passed 7500 Instrument 校準通過。轉到步驟5.

47、4.4.11 的。? Failed 7500 Instrument校準失敗。請參閱 5.4.4.15“排除染料校準故障。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間最多可達 10分鐘，以允許受熱的護蓋到達正確 溫度。將軟件所需的染料反響板從其包裝中取出。振蕩反響板5秒鐘。重要！不要丟棄存放反響板的包裝袋。假設貯存于原包袋中，反響板最多可重復使用3次。用板式離心機將反響板離心2分鐘。反響板必須充分混合并離心。確認反響板每個背景反響孔中的液體均位于反響孔底部。如果不是，那么以更長的時間離心反響板。檢查并確保要裝入的染料反響板與在7500 Software中選取的熒光匹配。按壓托盤門，將其翻開。將反響板裝

48、入儀器中的反響板架。確保放置時反響板在反響孔板適配器中被正確對齊。關閉托盤門。以一定角度向托盤右側施加壓力。注：如果無法翻開托盤，樣本塊可能位于其"升高位置，鎖定了托盤位置。要降低樣本塊，選擇Instrument宀Calibrate , 然后退出 ROI Inspector 。因為向導對每個染料校準單獨提供指示，所以請對校準的每個染料執行以下程序。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程Page 22 / 29 驗證校準狀態：? Passed 7500 Instrument 校準通過。轉到 b。? Failed 7500 Instrument校準失敗。請參閱

49、 5.4.4.15 “排除染料校準故障 核實染料光譜的分組：a. 在反響板布局中，選擇反響板的孔。b. 檢查原始數據。對于每個光譜，請確認峰值：?位于7500 Instrument 的可檢測范圍內。?無不規格光譜峰值。?出現在染料的正確通道上。如果某光譜不符合上述標準，請參閱5.4.4.15“排除染料校準故障。注：在含有相同染料的各反響孔中，光譜位置和峰值位置的差異是由于不同反響孔之間 的光學屬性及激發能存在細微差異而引起的。 假設所有光譜均可接受，那么單擊Next。取出校準反響板：注意！灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過100 ° C。假設剛使用過儀器，在樣本塊恢復至室溫之前，

50、請勿觸摸樣本塊。 按壓托盤門，將其翻開。 取出校準反響板。 按壓托盤門，將其關閉。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程 將校準反響板放入其包裝套中。將放入包裝套的反響板放回貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中。注：如果將7500 Real-Time PCR Instrument染料反響板貯存在其原始包裝內并放在冷凍柜中，那么在翻開包裝后 6個月內可以校準 7500 Real-Time PCR Instrument最多3次。在按照指示將染料反響板取出后，單擊Finish。文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程5-670=里畫SX芝 jWtfT*

51、 = = JCY5染料544.15排除染料校準故障問題/病癥可能原因一個或多個原始光/?光譜校準反響板未充別離譜到達或低于校準心。1的可檢測閾值。1/?光譜校準反響板含有陳舊試/劑或試劑體積缺乏。?假設正運行定制光譜校準反應板，染料可能濃度缺乏。一個或多個原始光/?樣本塊或光譜校準反響板含譜超過 7500有熒光污染物。In strume nt 的最高/?假設正運行定制光譜校準反限量。應板，染料可能濃度過大。光譜在一個以上的7樣本塊或光譜校準反響板含濾光器中含有峰/有熒光污染物。值。行動1. 卸載7500 Instrument 并查看光譜校準反響板的反響孔。假設反響孔中的液體不是：-位于反響孔底

52、部，請將反響板離心更長時間， 然后重復執行校準。-體積相等，那么說明反響板未密封致使試劑揮發。請將其丟棄，并運行另一反響板。2. 假設光譜校準反響板顯示正常，那么丟棄該反響板并運行另一塊反響板。3. 如果問題依然存在，請與生產商聯系。注：假設正運行定制光譜校準反響板，請創立另一 反響板但要增加產生缺乏信號的染料的濃度。請按照5.4.2 “背景校準操作，以確認是否存在 污染物。假設背景校準未顯示樣本塊含有污染物， 那么光譜校準反響板可能含有污染物。注：假設正運行定制光譜校準反響板，請創立另一 反響板但要降低超過可檢測限量的染料的濃度。驗證儀器性能 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.5.2 冷凍

53、柜中取出 TaqMan ? RNase P 96-Well Instrument Verification Plate，然后讓反響板溫度上文件名稱：AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程 升到室溫大約需要 5分鐘。545.3從包裝袋中取出 RNase P反響板。振蕩反響板 5秒鐘。545.4用板式離心機將反響板離心2分鐘。反響板必須充分混合并離心。確認液體位于反響板每個反應孔底部。如果不是，那么再次以更長的時間離心反響板。重要！注意不要讓 RNase P反響板的底部染上塵污。反響板底部沾上的液體和其它污染物可污染樣品區組，導致異常高的背景信 號。上圖為RNase P反響板上標

54、準和未知種群的分布情況。RNase P反響板包括五個重復組的標準物1250、2500、5000、10,000和20,000拷貝、兩個未知重復組 5000和10,000拷貝 和陰性對照反響孔(NC)。按壓托盤門，將其翻開。將反響板裝入儀器中的反響板架。確保放置時反響板在反響孔板適配器中被正確對齊。關閉托盤門。以一定角度向托盤右側施加壓力。5.4.5.6 開始運行反響板：在 7500 Software 中，選擇 Instrument 宀 Instrument Maintenance Manager 。 在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 RNase P 選項卡。在 RNase P 屏幕，單擊 Start RNase P Run 。按照向導的指示，完成校準。RNase P對話框顯示四個選項卡：? Overview -顯示校準相關信息。|? Setup -顯示RNase P運行設置