1、位嵋字雜志,2010,20(2:47-,48,502010CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATIONRNA聚合酶II啟動子shRNA表達 載體構建的研究進展周天龍1王會敏2綜述 周青霞1審校中周分類號R34文獻標識碼A 文章編號10051740(201002一0047一03置蠶虢瑟蔫主戮翳1RNA聚合酶II啟動子調控的RNAi中的效應分子及作 用機制有兩類RNA分子參與RNAi:小干擾RNAs(siRNAs 和miRNAs。前者主要由RNA聚合酶III啟動子啟動表達, 而后者為聚合酶11啟動子表達調控。miRNA是一類長約22個堿基的非編碼RNAs,它們與 信使RN

2、A結合并調控其翻譯或將其降解口。對模式生物 秀麗新小桿線蟲、果蠅的研究結果顯示,生物體內天然存在 miRNA基因,在細胞核內轉錄生成含有幾百個或幾千個核 苷酸的原始miRNA(Primary miRNA,pri-miRNA。由 RNAse家族的Drosha切割生成miRNA前體(Precursor miRNAs,pre-miRNAs,pre-miRNAs長70nt,3端有2個核苷酸的突出。隨后,其在Exportin5的協同作用下進入 細胞質,并被Dicer轉變為成熟的miRNA。接著,miRNA與 RNAi誘導沉默復合物(RNAi-lnduced Silencing Complex, RISC

3、中的Argonaule-2(其能選擇性地組裝那些5末端結作者單位,咸寧學院附屬第二醫院檢驗科,郵政編碼 成寧 437100;2廣東省中醫院二沙島分院檢驗科本文2010-01-20收到.20100312修回,20100324接受砸字雜舂2010年荒20卷第2舶 構疏松的RNA鏈結合,一旦進行到這一步驟,RISC即會 發揮下調同源mRNAs表達的作用。當miRNA與mRNA 完全同源時,其能降解mRNA,而當其與mRNA不完全同 源時,其會在翻譯水平下調基因的表達口J。在人類,迄今已 經發現了大約470種miRNA,并且還在哺乳動物中對其進 行了許多研究56。研究認為每種miRNAs能調控數百種

4、信使RNA,但miRNA的靶基因仍沒有被鑒別出來7。2miRNA與s諏NA的相似點及不同點miRNA與RNAi經典途徑中的siRNA存在一些相似 點及不同點陽.9.相似點:(1siRNA和miRNA都由Dicer 產生;(2兩者都由22個核苷酸組成;(3兩者都能與一些核 酸酶一起形成RISC。不同點:(1siRNA通常來源于動物 RNAi中或是植物轉錄后基因沉默中的長雙鏈RNA(Long Double-Stranded RNA,dsRNA,而miRNA則是內源性的; (2siRNA被Dicer處理后形成3末端懸掛兩個核苷酸的雙 鏈結構,而miRNA在通常情況下是單鏈結構1們(3siRNA 被組

5、裝為RISC后能降解靶mRNA,而miRNA常常不降解 靶mRNA,而是在翻譯水平下調相應基因的表達11”3;(4 細胞內主要結構性的含22個核苷酸的RNA是miRNA,而 siRNA通常在病毒感染或dsRNA被人工引入細胞內及轉 座子被激活后被誘導產生,因此siRNA主要在抑制轉座子 的活動和病毒感染中發揮作用。3RNA Pol 111啟動子驅動的shRNA表達載體的缺點經化學合成的siRNA被轉染到細胞內,能發揮沉默基 因的作用,但因其量少,只能在細胞內發揮短暫的效應,且由 于其合成成本高,在一定程度上限制了其應用。而shRNA 在結構上與內源性miRNA前體相似,其進入細胞后被Dicer

6、 處理為21個核苷酸的siRNA或miRNA而發揮RN加效應。 盡管shRNA載體作為一種工具已被廣泛用來分析基 因的功能,但現有的shRNA載體卻存在一些缺陷。如每個 shRNA只能表達一個shRNA,所以,抑制多個基因就需要 有多個啟動子或載體,甚至在相同載體轉染時。多個shRNA 也不能達到相似的共表達水平。另外,對引入的shRNA的綜跡 周天龍.王會敏檢測需共表達一個由RNA Pol II啟動子驅動的報告基因, 這種情況下,標記基因的表達并不總是與shRNA的表達相 一致。還有,調控RNA Pol III啟動子的表達比調控RNA Pol II啟動予的表達更為困難。而含RNA Pol I

7、I啟動子的 RNAi表達載體能夠克服RNA Pol III啟動子的缺陷1“。 4含RNA Pol II啟動子的shRNA表達載體的構建及應用 4.1利用miRNA前體的干袢環結構作為合成miRNA的 骨架4.1.1用rnir-30前體作為骨架:Zeng等1釘第一次證實真正 的人類miRNA-mir-30能從不相關的含71個核苷酸的“r-30前體而非成熟mir-30的mRNA轉錄本上被識別并被切割 下來。他們將編碼整個71個核苷酸mir-30前體的eDNA序 列在CMV-IE(Cytomegalovirus Immediate Early啟動子的控 制下克隆入細菌載體內(pCMV-mir-30,

8、然后轉染人類293T 細胞。收集總RNA進行Northern blotting以分析mir-30的存 在。轉染了pCMV-mir-30的miRNA產物長22個核苷酸,與 報道過的mir.-30有相同的5末端,并且表達mir-30的miR NA能特異地抑制含互補靶位點的mRNA的表達。Lo等”3用siRNA序列代替miR一30干袢環結構的主干 部分設計合成了能在RNA Pol II啟動子控制下表達的 miRNA,用此miRNA能夠有效地抑制人類免疫缺陷病毒一1 (HIV-1的復制,抑制效率直接與其表達水平相關。他們還 發現載體的拷貝數與啟動子的長度均能影響siRNA抑制 HIV-1復制的能力。而

9、且,他們聯合應用RNA Pol II和RNA Pol III啟動子分別表達兩種不同的siRNAs,結果顯示其增強 了抑制HIV-I復制的效能而且沒有影響到細胞的活力。 Zhou等”3用巨細胞病毒(CMV啟動子檢測了一系列 模擬人類miRNAmir-30結構的發夾結構的變異體,結果 發現采用真正人類miv30結構的發夾在沉默基因方面最有 效。另外,他們又將最有效的發夾置于另一個人類RNA Pol II啟動子一UbC的下游,然后將這個重組體與廣泛使用的 RNA Pol III啟動子驅動的發夾重組體進行比較,結果, RNA Pol II啟動子與RNA Pol III啟動子相比,前者能驅動 shRNA

10、的合成并能高效介導基因沉默。4.1.2用mir-155前體作為骨架:Chung等17在非編碼 RNA BIC的基礎上發展了一種新的RNA Pol II表達載體, 命名為SIBR載體。BIC含有miR-155miRNA前體,他們發 現小鼠BIC基因第三個外顯子的小區域的表達能在哺乳動 物細胞產生miR-155。SIBR載體采用了改良過的miR-155前體主干及袢環結構,像RNA Pol III驅動產生的短發夾 RNA載體一樣,SIBR載體能有效地降低靶mRNA和蛋白 表達水平。此外,SIBR載體能在個轉錄本上同時表達兩 個不同的miRNAs,并且這兩個miRNAs均能有效的抑制兩 種不同的靶mR

11、NA。另外,至少8個串聯的miRNA拷貝能 在一個多順反子的轉錄本上表達,從而增加對靶RNA的抑 制效率。4.2直接將shRNA置于RNA Pol II啟動子的下游Ling等18將針對Survivin設計的shRNA插入到pEG一 蕾膏亨赫2010年第20卷薏2期 FPcl載體(含RNA Pol II啟動子GFP cDNA的3末端的 下游,然后用構建好的載體轉染HeLa細胞,結果發現RNA Pol II啟動子轉錄出的與GFP以融合形式結合的shRNA抑 制了熒光素酶的活性及Survivin的表達,這表明shRNA袢 環結構外多余的RNA序列(GFP并沒有影響shRNA的功 能。該作者第一次證實

12、shRNA能在其非翻譯區以融合表 達的形式發揮作用。Lakka等1叼等針對uPAR序列合成了21個堿基對+5個堿基的袢環+BamH I位點的核苷酸,在6x SSC緩沖液內 退火后連接到pcDNA3載體(含CMV啟動子的BarnH I位 點,相似地,金屬白酶一9(MMP-9序列的22個堿基+5個堿 基的袢環+EcoR I位點的核苷酸被連接到上述載體的EcoR l位點,最終構建了同時表達uPAR和MMP一9siRNA的雙 基因表達載體,這個重組體同時抑制了兩個基因的表達,且 在體內外實驗中抑制了血管樣結構的形成,最終顯著抑制了 神經膠質瘤細胞的侵襲及腫瘤的生長。.5展望近年來,RNAi技術取得了迅

13、猛發展,已被廣泛用于探 索基因功能和多種疾病及惡性腫瘤的基因治療。但是有很 多因素會影響RNAi的效率,如在抗病毒治療時,一些RNA 病毒和DNA病毒會產生突變從而逃避RNAi;某些靶mR NA的結構也會影響沉默效率;由于哺乳動物體內缺乏內源 性RNA擴增機制,外源性RNAi作用會隨著時間而逐漸減 弱等等。所以,用同時沉默兩個或兩個以上基因的RNAi技 術能極大地提高RNAi的效率,從而為疾病的治療提供更為 有利的工具。但是傳統的采用RAN Pol Ill啟動子方式存 在著許多缺點,且同時沉默多個基因有一定困難,采用RAN Pol II啟動子能彌補其缺陷,并能同時轉錄出多個shRNAs, 從而

14、為多基因沉默開辟了道路。Lo等15聯合應用RAN Pol II和RAN Pol III啟動子達 到了沉默兩個HIV-1片段進而增強了抑制病毒復制能力的 目的;Chung等173等利用SIBR載體在一個轉錄本上同時 表達兩個不同的miRNAs。且這兩個miRNAs均能有效抑制 兩種不同的靶MRNA;Silva等203用日益增長的RNAi生物化 學理論構建了第二代shRNA表達庫,這些構建體模擬了天然 的miRNA前體,因內源性的miRNA允許在組織特異的且可 被誘導的啟動子的控制下構建重組體,故大規模第二代短發 夾載體庫得以構建,而且在RNA Pol II啟動子控制下構建的 表達載體能有效抑制培

15、養細胞和動物體內基因的表達。綜上所述,用RAN Pol II啟動子代替RAN Pol III啟動 子進行RNAi,不僅能達到與RAN Pol III啟動子相同的,而 目且并且還能克服其缺點,同時沉默多個基因,從而為疾病 治療提供了更為有效的方法。 本文第一作者簡介:周天尼(1967.男.漢族.本科.主管技師(下轉第50頁 綜跡50吳國榮,陳國千,王春新.等 參考文獻1Le Bricon T,Thervet E,Froissart M,et a1.Plasma cystatin C is superior to24h creatinine clearance and plasma creatin

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