1、    腺病毒載體介導的遺傳病基因治療研究和應用進展            作者：萬成松 張文炳時間：2007-11-22 12:14:00                     關鍵詞： 人類腺病毒；遺傳性疾病；基因療法

2、60;     一群分布廣泛的呼吸道病毒，A:6090nM，無包膜，20面體立體對稱型。分為大約47個血清群，其中Ad2、Ad4、Ad5和Ad7在疫苗和基因轉移載體研究方面，應用最普遍。腺病毒粒子衣由252個殼粒組成，幾何排列成240個非頂角六鄰體和12個五鄰體。基因組為雙股DNA，呈線性，長度大約36kb。腺病毒的轉錄區分早期（early,E1、E2、E3、E4）轉錄區和晚期（late）轉錄區。復制周期大約為3236小時。 腺病毒載體法是基因治療中最有前途的基因轉移方法之一。其生物學特性得到廣泛研究。Ad有一個中等大小的基因組（平均36kb），適合于容

3、納于大片段基因，與反轉發病毒載體相比，腺病毒載體能有效地外源基因轉動到各種靶細胞或組織中。載體容易構建和操作。宿主范圍廣，感染性強，可經不同途徑進入不同組織，能感染分化后的非分裂期細胞。在Ad生活周期中，其基因不整合到宿主細胞中，無插入突變激活癌基因的危險，外源基因能游離地表達。Ad制成疫苗臨床應用表明，體內基因轉移是安全是。 最近幾年，Ad載體已引起科研人員的廣泛關注，Ad可用于遺傳病、傳染病和腫瘤等疾病基因治療的研究和應用。 一、不同動物組織中腺病毒介導的基因轉移 Rosenfeld等1把1抗胰蛋白酶（1-An-titrypsin,1-AT）基因轉動到肺上皮細胞中，證實重組腺病毒載體和其野

4、生型病毒一樣，易感染宿主上皮組織，特別是呼吸道上皮組織。但把Ad載體通過靜脈注射到小鼠模型體內，也可在肝內檢測到大量載體。科研人員在不同動物模型上作了大量基因轉移試驗，證實采用氣管內皮滴注法，肌肉注射、腦門實體接種等方法可感染Ad，感染部位有呼吸道內皮組織，肝組織、眼組織、羊膜內腔等。研究證明，重組Ad載體把目的基因轉動到不同組織中，為Ad載體介導的遺傳病基因缺陷糾正治療提供了理論基礎。 二、腺病毒介導的1抗胰蛋白酶基因轉移 大量臨床病例表明，1抗胰蛋白酶（1-AT）缺陷癥是高加索人肺部最普遍的致死遺傳性疾病之一。Rosenfeld等1構建了含Ad主要晚期啟動子（MLP）和重組人1-AT基因的

5、復制缺陷型Ad載體（Ad-1AT），體內外分別感染棉鼠呼吸道上皮細胞。Lemarchand等2將Ad-1-AT通過氣管內滴注給小鼠后，在呼吸道上皮內可檢測到人1AT mRNA，說明在肺組織內可合成并貯存人1-AT。在鼠的呼吸道粘液中也可檢測到人1-AT（1.7M），但會逐漸減少，一周后完全檢測不到。通過靜脈灌注，24小時后，可檢測到平均13g/ml的1-AT，證實了重組Ad載體介導的體內內皮細胞基因轉移的可能性。最近，Kochanek等3利用缺失了整個病毒編碼基因的Ad載體，鼠尾靜脈注轉移19kb的人1-AT基因組，發現13周內在鼠血清中可檢測到大約1g/ml的1-AT。 三、腺病毒

6、介導的低密度脂蛋白受體基因轉移 家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolaemia,FH）是由低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,LDL）受體缺乏導致而成，與高膽固醇和早期冠狀動脈疾病有關。最初在細胞培養中證實了Ad載體介導的LDL受體基因轉移，注射過載體的小鼠血漿中膽固醇水平明顯減少。據LDL受體的免疫熒光和-半乳糖苷酶染色等實驗檢測，大約90%的肝細胞表達了Ad轉移的基因。Kozarsky等4在轉導的FH肝細胞中，Ad.CBhLDLR誘導的LDL受體蛋白至少比骨源性的要高20倍，將該載體注入一種叫新西蘭白兔（NZW）

7、中，發現NZW兔血清中膽固醇明顯減少。Kobayashik等5構建極低密度脂蛋白（VLDL）受本的Ad載體的相關研究也已開始。他們用3×1019PFU的Ad mVLDLR靜脈注射LDLR（-/-）小鼠，結果表明，感染后49天，小鼠體內總膽固醇水平減少50%。Ad載體介導的LDL和VLDL受體基因轉移方法是一種治療LDL或VLDL受體缺乏的有效方法，不足之處在于基因的表達量需加強。  四、腺病毒介導的囊性纖維變性轉導調節因子（CFTR）基因轉移 Ad載體介導的囊性纖維變性（cystic fibrosis,CF）基因治療是Ad載體體內基因治療最早的例子。一些

8、科學家做了大量的工作，先后克隆了CFTR基因，構建了E1區缺失的Ad cFTR載體，在CF小鼠、棉鼠、非人靈長類動物，人呼吸道上皮細胞中，完成了該載體的安全性、毒性和生物學效應的研究。 盡管CFTR的基因轉移率較低，但在感染細胞中，CFTR的基因表達要體內外都能被檢測出來。動物模型研究和臨床試驗表明，CFTR基因表達是短暫是，并且隨著宿主細胞免疫反應的發展而終結。這促使人們改進缺失E1區的Ad載體，試圖發展既缺失E2A區，又缺失部分E4區的新一代載體。最近，Fisher6等開始研究缺失所有病毒編碼序列的Ad載體，并且開始應用該載體把CFTR表達盒轉移到人氣管上皮細胞內。 五、腺病毒介

9、導的杜氏肌肉營養不良癥（DMD）基因轉移 DMD是由于功能性營養蛋白缺乏而引起的致死性遺傳病。DMD的基因治療就是通過質粒表達載體和重組病毒（如逆轉錄病毒和腺病毒等）載體，將功能性營養蛋白的cDNA導入肌肉細胞內。Hauser等7在轉基因mdx小鼠中，分別轉移6.3kb的一段基因和cDNA全基因，證實可以部分或全部糾正小鼠的病理癥狀，小鼠的肌肉力量可以恢復。1993年，Vincent等8最早通過缺失E1區Ad載體的介導，將微小基因轉移到新生的小鼠肌肉中，觀察到DMD癥狀明顯減弱。1996年，Acsadi等在利用mdx小鼠進行的腺病毒介導的營養不良微小的基因轉移中也證實了這一點。最近，Kocha

10、nek等10利用一種微小腺病毒載體，把全長DMD cDNA轉運到mdx小鼠的肌肉中也取得了很好的效果。 六、腺病毒介導的因子基因轉移 血友病B（haemophilia B）是一種血液凝血因子IX（F IX）缺乏綜合癥。現已通過不同的基因轉移方法在體內，外作了大量的基因轉移實驗。在動物模型中，把F iX基因轉移到成纖維細胞、內皮細胞、成肌細胞和角質形成細胞中，但表達水平較低。 利用Ad體內基因治療血友病B正在取代逆轉錄病毒介導的方法。Smithtag等11通過AvIH9B載體把呼吸道合胞病毒（RSV）啟動子啟動的F iX cDNA表達盒

11、注射小鼠尾靜脈中，結果可在肝得到有將效轉導，9周后，其表達水平才會慢慢減弱。Dai等12用Ad載體把帶有巨細胞病毒（CMV）增強啟動子的FIX表達盒肌肉注射到裸鼠體內，血漿中可得到人F iX的高水平表達（15g/ml），持續時間1年。如果載體在小鼠骨有某種免疫活性，血漿F iX的表達時間會縮短，表達量會降低，在血友病犬模型中也證實了這些結果。 七、腺病毒介導的因子基因轉移 血友病A（haemophilia A）是由因子正常或缺陷引起的，主要表面為不自主的出血并發癥。早期，采用細胞移植、反轉錄病毒載體等方法在動物模型中僅能得到F低水平表達和分泌。現在采用缺失E1區的

12、Ad載體，轉運B區缺失的F（BOD f）的cDNA，感染1周后，在HepG2細胞系和C57BL/6小鼠中，F得到了30793ng/ml的高水平表達。 AvlALApH81是一種小鼠白蛋白啟動子，由AvlALH91載體帶有一個Apo-A1內含子和一個HNF3/eG-Tf連接位點改建而成。Connelly等13把該載體注射到小鼠體內后，能顯著增加血漿中BOD-F含量，可達到1046 163ng/ml。BOD-F主要在肝中表達，其分泌時間可維持4周左右。據報道，通過改進Ad載體，在血友病小鼠，BOD-F的表達時間可持續13周以上。最近，Alemany14等第一次構建F微小腺病毒載

13、體，用2.5kb的人白蛋白基因片段作啟動子，轉移全基因組的人FcDNA表達盒，將該載體注射到血友病鼠后，血漿中可產生300ng/ml的F表達量，并且在40ng/ml的水平上可維持6周。 八、腺病毒介導的其它基因轉移 基因治療適合于治療一些單基因遺傳疾病。鳥氨酸氨甲酰基轉移酶（OTC）缺乏癥和苯丙酮酸尿癥（PKU）是另外兩類Ad介導的基因轉移方法病例。OTC缺乏癥是一種伴X染色體的氨基酸缺乏疾病，能影響尿素的生物合成而導致尿素癥。Morsy等15在OTC缺乏癥小鼠體內小外活體試驗，證實了Ad介導的基因轉移方法能引起OTC的有效表達，這項研究也給OTC缺乏癥病人的治療帶來了曙光。PKU是由于肝內苯

14、丙氨酸脫氨酶（PAH）缺乏而造成的先天性代謝紊亂，可導致個人嚴重的精神障礙。含人PAH cDNA基因的重組Ad載體已經構建，并且導入到PAH缺乏的小鼠中。這些動物血中苯丙氨酸過多的癥狀完全可以在1周內恢復正常。遺憾之點是這種治療的效果不能持續太久。參考文獻 Rosenfeld MM,et al.Science,1991;252:431 Lemarchand P,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:6482 Kochanek,et al.Keystone

15、60;Gene Therapy Smyposium,1997 Kozarsky KF,et al.J Biol Chem,1994;269:13695 Kobayashi K,et al.J Biol Chem,1996;271:6852 Fisher KJ,et al,Virology,1996;217:11 Hauser X,et al.Am J Human Gen,1994;55:A47 Vircent N,et al.1993;5:130 Acsadi G,et al.Huan Gene Ther ,1996;7:129 Kochanek S,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:5731 Smith T,et al.Nat Genet,1993;5: