1、-NMMA對大鼠單側睪丸扭轉后對側睪丸生精功能的保護作用         【摘要】  目的:探討N-甲基-L-精氨酸（L-NMMA）對大鼠單側睪丸扭轉后對側睪丸生精功能的保護作用。方法:42只健康雄性SD大鼠隨機均分為假手術組、安慰劑組和L-NMMA組。建立左側睪丸扭轉模型。安慰劑組和L-NMMA組大鼠分別于扭轉復位前30 min通過尾靜脈緩慢推注生理鹽水和L-NMMA。三組大鼠分別于術后1周、2個月時處死7只，即刻采集各組大鼠未扭轉側睪丸標本，測定睪丸組織丙二醛(MDA)水平，同時進行組織病理學觀察。結

2、果:與安慰劑組相比，L-NMMA組1周時MDA值明顯下降，平均曲細精管直徑明顯升高，而睪丸結構評分則明顯偏低（P0.05）;2個月時主要表現在生精上皮層數和平均曲細精管直徑較高，睪丸結構評分較低，兩組間比較均有統計學差異（P0.05）。結論:L-NMMA可以減輕大鼠單側睪丸扭轉后對側睪丸的早期損害，對晚期對側睪丸的生精功能具有一定的保護作用。 【關鍵詞】  L-NMMA 睪丸扭轉 生精功能   Abstract:  Objective:To explore the biochemical and histological changes in the c

3、ontralateral testis of rats with unilateral testicular torsion and elucidate the protective effects of L-NMMA on the contralateral testicular spermatogenetic function. Methods: Fouty-two prepubertal Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups, with 14 rats in each. The rats in sham-opera

4、ted group underwent a sham operation of the left testis under general anaesthesia. The rats in saline group and L-NMMA group underwent a similar operation but the left testis was rotated 720°clockwise for 4h, maintained by fixing the testis to the scrotum, and saline/L-NMMA infused during half

5、an hour before detorsion was performed. All the right(untwisted) testis were removed from rats at 1 week and 2 months intervals after surgery, 7 rats were taken from each group each time. Then the malondialdehyde (MDA) levels were evaluated; histology and seminiferous tubule diameters were assessed.

6、 Results:Compared with saline group, the MDA levels in L-NMMA group decreased significantly while the mean seminiferous tubular diameter of contralateral testis and histological grades maintained in a better condition at 1 week interval; and it was also known that the rats in L-NMMA group got a high

7、er score at the grades of germ cell layers and mean seminiferous tubular diameter of contralateral testis at 2 months interval. Conclusion: L-NMMA can reduce the damage of contralateral testis of prepubertal rats with unilateral testicular torsion during the early period, and L-NMMA may also have a

8、protective effect on the testicular spermatogenetic function in the later stage.   Key words:  L-NMMA; testicular torsion; testicular spermatogenetic function   睪丸扭轉是常見的泌尿外科急癥，多見于25歲以下青少年,發病率約為1/4 000，即使及時手術復位固定，仍可能引起對側睪丸生精功能的損傷1。單側睪丸扭轉后如何保護對側睪丸的生精功能受到越來越多的臨床和實驗關注。本研究通過建立大鼠單

9、側睪丸扭轉模型，探討L-NMMA對大鼠單側睪丸扭轉后對側睪丸生精功能的保護作用，為更好地進行臨床治療提供實驗基礎。   1  材料和方法   1.1  動物分組  選取出生約28 d的健康雄性SD大鼠42只，隨機分為假手術組、安慰劑組和L-NMMA組，每組14只。   1.2  動物模型建立  睪丸扭轉模型采用Turner法制作。予2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，左下腹小切口，游離左側睪丸，切斷睪丸引帶，分離周圍組織至附睪頭。假手術組僅將左側睪丸游離后還納睪丸，縫合切

10、口后術畢。其他兩組待左側睪丸完全游離后,睪丸順時針扭轉720 °，固定扭轉側睪丸防止自然復位，維持4 h后原切口打開復位扭轉睪丸,關閉切口。其中安慰劑組在扭轉復位前30 min予尾靜脈緩慢注射生理鹽水30 mg/kg；L-NMMA組在扭轉復位前30 min予尾靜脈緩慢注射L-NMMA 30 mg/kg。   1.3  標本制備  各組大鼠分別于術后1周、2個月時快速脫頸法處死7只，采集未扭轉側睪丸標本，將所有睪丸標本沿中軸切開分為兩部分，一部分睪丸用于制備組織勻漿，另一部分睪丸迅速置于10%的中性福爾馬林中待制作石蠟切片常規HE染色。 

11、;  1.4  檢測方法   1.4.1  丙二醛(MDA)含量測定：按試劑盒要求制備組織勻漿，化學比色法測定睪丸組織中MDA。操作步驟嚴格按說明書要求進行。   1.4.2  睪丸組織病理學檢查：石蠟切片常規HE染色，置于光鏡下鏡檢，觀察睪丸曲細精管結構，計數生精上皮層數，測量平均曲細精管直徑（MSTD），對睪丸組織結構評分。等級一：正常睪丸，結構層次分明，生殖細胞排列整齊有序。等級二：受損睪丸，生殖細胞排列較等級一不規則，結構松散（彼此細胞間無黏附），但緊貼精細小管排列。等級三：較重受損睪丸，生殖細胞排列更加不

12、規則，且有脫落、缺失，可見核固縮現象，精細小管邊界模糊不清。等級四：嚴重受損睪丸，緊貼精細小管的生殖細胞出現明顯的凝固性壞死。   1.5  統計學處理方法  用SPSS12.0統計軟件進行分析，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊性用LSD檢驗，方差不齊性用Dunnetts T3檢驗。            2  結果   2.1  MDA含量  術后1周時，與假手術組比，安慰劑組MDA含量明顯升

13、高，兩者差異有顯著性(P0.05)；L-NMMA組MDA值與其余兩組相比差異均有顯著性(均P0.05)。術后2個月時，三組間MDA含量無明顯差異，詳見表1。   2.2  睪丸組織病理學比較  安慰劑組和L-NMMA組在術后1周與2個月時生精上皮層數、平均曲細精管直徑（MSTD）、睪丸組織結構評分與假手術組比差異都有顯著性(均P0.05)。與安慰劑組比，L-NMMA組術后1周時平均曲細精管直徑（MSTD）和組織結構評分均有顯著性差異(均P0.05)，而術后2個月時生精上皮層數、平均曲細精管直徑（MSTD）、睪丸組織結構評分上差異均有顯著性(均P0.05)

14、。詳見表2、表3。假手術組術后1周和2個月時，生精上皮分別為3層和5層，均緊貼精細小管生長，排列緊密，有序。小管間隙間可見少許紅細胞，為取材時出血所致，不影響評分，兩者評分均為1分。安慰劑組術后1周和2個月時的精細小管結構，示精細小管結構不連續，損傷明顯，管腔內有大量滲出。生精上皮層排列紊亂，僅基底層較明顯，其余生精上皮層或缺失，或脫落，且見毛玻璃樣改變。病理評分均為4分。L-NMMA組術后1周和2個月時的精細小管結構示精細小管結構完整。生精上皮層尚緊貼精細小管排列，雖然排列略顯紊亂，但層數仍可辨認，病理評分為2分。見圖1。   3  討論  

15、 單側睪丸扭轉后對側睪丸生精功能損傷機制較為復雜，爭議較多。近年來不少學者認為對側睪丸損傷是由于扭轉側睪丸復位后缺血再灌注引起的，再灌注時NO、氧自由基等的增多均可直接或間接引起對側睪丸組織損傷。當單側睪丸扭轉復位后，一方面扭轉側可以生成過量的NO與氧自由基結合形成更具毒性的ONOO-，導致對側睪丸組織的損傷;另一方面通過脂質過氧化反應、促炎癥遞質聚集、過度擴張血管、誘導細胞凋亡等作用對兩側睪丸組織造成更大的損傷。   在本實驗中,安慰劑組過氧化脂質的降解物丙二醛(MDA)在早期含量明顯增多，表明早期睪丸組織存在脂質過氧化損傷；同時早期的病理發現局部睪丸組織出血水腫、炎性細

16、胞浸潤、上皮細胞排列紊亂等。而術后2個月時，三組間MDA含量無明顯差異，但病理學上改變明顯, 表現為生精上皮層數減少、平均曲細精管直徑減小、細胞空泡樣變性、睪丸組織間質增生等。說明單側睪丸扭轉后，對側睪丸組織如果早期未能及時治療，將使得晚期睪丸組織的損害不能恢復，生精上皮細胞發育延遲，導致睪丸生精功能低下。   L-NMMA即N-甲基-L-精氨酸，為非選擇性一氧化氮合酶（NOS）的拮抗劑，對誘生和固有型NOS活性都有抑制作用，能抑制一氧化氮（NO）產生，是目前國際上實驗用于治療缺血再灌注損傷的常見藥物之一。在本實驗中術后1周，在假手術組、安慰組、用L-NMMA組的MDA含量

17、分別是（132.6±14.3）nmol/g、（276.5±31.2）nmol/g、（181.8±21.9）nmol/g，提示應用L-NMMA在早期可以降低脂質過氧化反應產物MDA的含量，同時也發現能降低睪丸組織結構評分。而在術后2個月時，雖然三組間MDA含量無明顯差異，但是發現應用L-NMMA后對側睪丸組織生精上皮層數和平均曲細精管直徑都相對較高。說明L-NMMA在早期可以減輕對側睪丸組織的損害，有效地保護對側睪丸組織，使得晚期睪丸的生精功能得到一定的保護。      L-NMMA可能通過以下幾種途徑起作用：通過抑制患側睪丸

18、組織NOS的產生從而減少NO的生成，改善患側睪丸的缺血再灌注損傷，從而減少患側睪丸交感神經活性，抑制了神經反射對對側睪丸的影響。直接作用于對側睪丸組織，抑制睪丸間質細胞NOS的活性與產生，抑制NO的過量產生，改善對側睪丸血供，從而減輕對側睪丸生精細胞的損害。   單側睪丸扭轉對對側睪丸生精功能的影響是長期和顯著的，最終可以影響患者的生育能力，因此早期的干預措施顯得至關重要。藥物治療將成為今后睪丸扭轉復位后睪丸保護研究的重要方向之一 。本實驗證實了L-NMMA能有效地保護對側睪丸的生精功能，同時對其作用機制進行了初步地探討，為臨床治療提供了一定的實驗依據。【參考文獻】  1 Savas C,Ozguner IF, Ozguner M,et al.The effects of unilat-eral testicular ischemia and hemicastration on contralateral test