1、N軟脂酰基殼聚糖的制備及其改善靛玉紅水溶性的藥動學研究(1)                        作者：王來友 蔣剛彪 方羽生 巫瑋 臧林泉 曾明華【摘要】  目的 制備N軟脂?；鶜ぞ厶牵≒LCS）納米膠束，改善難溶性藥物靛玉紅的溶解性與生物利用度。方法 首先使用溶脹的殼聚糖與軟脂酸酐在二甲基亞砜溶劑中反應合成水溶性的PLCS，通過IR和1HNMR

2、表征PLCS的結構；然后用其負載靛玉紅，以激光散射和透射電鏡檢測載藥納米膠束的物理特征,用HPLC法測定其包封率。最后進行載藥納米膠束腹腔注射給藥后在大鼠體內的藥動學實驗,與靛玉紅混懸劑對照。結果 合成得到的PLCS能很好地負載并增溶靛玉紅，載藥率可達10%左右。藥動學研究表明，用PLCS載靛玉紅后較靛玉紅混懸劑的AUC提高了2.21倍，顯著提高了靛玉紅在大鼠體內的生物利用度。結論 PLCS可作為提高難溶性藥物靛玉紅生物利用度的有效載體，進而可能改善靛玉紅治療白血病的療效。 【關鍵詞】  靛玉紅 N軟脂?；鶜ぞ厶?納米膠束 藥動學從青黛等中藥中提取的靛玉紅在白血病治療中已顯示出獨特的

3、優勢，它既能有效破壞白血病細胞，又對正常骨髓無明顯抑制作用。然而靛玉紅的水溶性很差，不利于被吸收，生物利用度非常低；同時，它對胃腸道黏膜有很強的刺激作用。吳正紅等1認為可通過增加靛玉紅的溶解度以提高其生物利用度，在劑型設計上要以提高靛玉紅的溶解度為中心。目前，通過對殼聚糖表面進行修飾并利用其做為藥物載體，是新型水溶性制劑研究的前沿陣地2。Sirica A E等3曾報道殼聚糖本身對白血病癌細胞具有選擇性聚集作用，而且殼聚糖及其衍生物對白血病癌細胞也有較強的抑制作用4。因此，本文采用殼聚糖分子接枝軟脂?；苽銷軟脂?；鶜ぞ厶牵≒LCS）來增溶控釋靛玉紅，以提高靛玉紅的生物利用度和降低其對消化道的

4、毒副作用，并發揮殼聚糖衍生物納米粒子作為抗白血病藥物載體所具備的獨特優勢。1    材料與方法1.1    試劑、藥品與儀器      殼聚糖（分子量45 kDa，脫乙酰度為95，上海博奧生物科技公司），軟脂酸、乙酐（廣州化學廠），HPLC用甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純，靛玉紅（自提取，純度95以上）。      LC10AT 高效液相色譜儀(shimadzu,Japan)， Nicolet 670 FTIR紅外光譜儀(T

5、hermo Nicolet,USA)， Mercure plus 300 MHz 1HNMR 核磁共振儀（Varian,USA），BI200SM goniometer激光散射儀(Brookhaven,USA)， JEM2010電子顯微鏡(JEOL,Japan)， IEC Micromax Microentrifuge(Thermo Electron corporation,USA)。1.2    PLCS的合成與聚合物結構表征1.2.1    PLCS的合成方法    參考Hirano等5的方法:2.0

6、g（0.012 moL）殼聚糖（脫乙酰度95%）溶解在100 mL 0.1 mol/L的稀乙酸中，再以0.2 mol/L NaOH溶液沉淀，過濾，蒸餾水洗滌到pH值接近7，瀝干水分，分散到100 mL二甲基亞砜（DMSO）中，磁力攪拌下升溫至60 ，緩慢滴加0.0240.048 moL軟脂酸酐，保溫反應8 h結束反應，加入丙酮沉淀產物，過濾，濾渣依次用丙酮和乙醚洗滌多次，除去軟脂肪酸和軟脂酸酐，產物60 下真空干燥，產物的取代度(DS)定義為殼聚糖分子中每100個糖環中所引入的脂肪酰基個數，用酸堿滴定以及1HNMR法測定。1.2.2    PLCS聚合物結構表征1

7、.2.2.1    FTIR分析    以KBr壓片，用Nicolet 670 FTIR紅外光譜儀測定。1.2.2.2    1HNMR分析    以Mercure Plus 300 MHz spectrometer核磁共振儀在室溫下測定，以氘代DMSO(DMSOd6)為溶劑（TMS內標），試樣質量濃度約為3%。1.2.2.3    空白納米膠束制備和膠束性能檢測    用直接溶解法制備膠束，稱取一定量的PLCS置小

8、燒杯中，量取一定體積的二次蒸餾水（經0.5 m濾膜過濾處理）倒入燒杯中，用普通超聲儀震蕩3次（每次10 s），可看到PLCS逐漸溶解，除液面有少許泡沫外，溶液基本澄清。再用觸點超聲儀震蕩3次(每次5 s )，此時液面產生大量泡沫，但不久泡沫消散得澄清溶液，即得到PLCS膠束溶液，用光電筆穿透照射溶液，可觀察到明顯的光路，即溶液有明顯的丁達爾現象。      用動態光散射方法測定膠束的水動力學半徑( hydrodynamic radii )和聚合物分散度。將按上述方法配制的PLCS水溶液倒入檢測池中，以532 nm的激光垂直照射樣品池，檢測器與入

9、射光的角度為90°。      在以透射電鏡（TEM）檢測膠束粒子之前，膠束納米粒子先通過甲胺鎢酸鹽染色：取按“3.2.1”項的方法配制的PLCS水溶液12滴，滴在200目表面鍍了碳膜的銅網上，自然干燥5 min后，以濾紙輕輕吸干銅網上的液珠，然后把銅網浸泡在甲胺鎢酸鹽的緩沖溶液中，染色1 min，再在清水中漂12次，室溫下晾數分鐘，在電鏡下觀察納米膠束的粒徑和形貌。1.3    靛玉紅PLCS納米膠束的制備與載藥量測定      準確稱取多份靛玉紅(每份

10、約200 mg)置小三口瓶中，依次倒入15 mL二氯甲烷、10 mL丙酮，磁力攪拌使靛玉紅完全溶解，然后加入PLCS(DS 14.  2) 2001 000 mg,繼續磁力攪拌，此時PLCS不溶解，隨后緩慢滴加1530 mL雙蒸水，隨著雙蒸水的不斷加入，PLCS逐漸溶脹、溶解并逐漸聚集形成膠束纏繞負載上靛玉紅?；旌先芤豪^續攪拌12 h，揮發有機溶劑后，冷凍干燥得載藥粉末。用大量二氯甲烷反復浸泡和淋洗沒有負載上的以及黏附在PLCS粉末表面的靛玉紅，通過配制標準溶液和繪制標準曲線，用HPLC法檢測沒有被PLCS負載的靛玉紅的質量，根據公式LC=(A-B)/C 6 （A=投入靛玉紅的總質量

11、; B=沒有被負載靛玉紅的質量; C=投入PLCS的質量）計算PLCS對靛玉紅的載藥量。1.4    載靛玉紅PLCS納米膠束在大鼠體內的藥動學141    色譜條件    色譜柱：Angilent Hypersil ODS(4.0 mm×250 mm,5 m)；流動相：甲醇水乙酸（體積比74251）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：287 nm；進樣體積：20 L。142    給藥方案與血樣采集與處理    將雄

12、性SD大鼠（約300 g,購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：粵監證字2007A006）16只，隨機分成2組，分別按體質量1.25 mL·100 g-1灌胃0.80 mg·mL-1靛玉紅混懸液(精密稱取約8 mg靛玉紅原料藥，加1 mL DMSO充分混勻，加入10%吐溫80溶液0.  5 mL，超聲混合，雙蒸水定容至10 mL)以及上述納米膠束水溶液，注射前禁食12 h，可自由飲水。注射給藥后分別于0、0.016、0.08、0.16、0.32、0.64、1、2、 4、6、10 h斷尾取血0.5 mL置肝素化的離心管中，血樣于3 000 r/min離心10 min

13、，上層血漿樣品處理方法及含量測定同文獻7 。1.5    統計學處理        實驗數據采用SPSS13.0軟件進行students t檢驗，比較各組變量間有無差異。本篇論文由網友投稿，讀書人只給大家提供一個交流平臺，請大家參考，如有版權問題請聯系我們盡快處理。2    結果與討論2. 1    PLCS的合成與聚合物結構表征      合成前的原料、反應后的產物N軟脂?；鶜ぞ厶羌t外

14、光譜如圖1所示，殼聚糖在1 574 cm-1有NH彎曲振動吸收峰，表明殼聚糖有未被酰化的自由氨基，3 426 cm-1是羥基的吸收峰。當殼聚糖被?；?，出現了具有明顯特征的1 638和1 525 峰，分別對應酰胺的羰基伸縮震動（amide band）和酰胺峰(amide band,即NH )。譜圖中在1 7101 760 cm-1沒有出現吸收峰，該位置是成酯羰基特征吸收峰，因此可明確判斷殼聚糖的羥基沒有被酯化，?；囊胗懈叨鹊倪x擇性，反應的位點全部為殼聚糖的氨基。      圖2為PLCS（DS14.2）在DMSOd6溶劑中的1HNMR譜圖，

15、 0.85為接枝的軟脂酰基中的甲基氫， 1.23為軟脂?；衼喖谆鶜?， 1.49為軟脂酰基中羰基的位亞甲基氫， 1.85為軟脂酰鏈中與羰基相鄰的位亞甲基氫， 2.08為殼聚糖分子中殘余乙?；械募谆鶜?， 2.88為殼聚糖葡聚糖環上的H2， 3.203.90為葡聚糖環上H3,4,5,6,6與水峰重疊。 4.865.49葡聚糖環上的H1， 8.52為氨基上發活潑氫NH。1HNMR譜圖表明殼聚糖分子中的氨基發生了?；磻?。殼聚糖?；〈瓤赏ㄟ^1HNMR譜圖中軟脂酰基鏈甲基峰的積分強度與3倍H2的積分強度的比值估算（0.85/32.88）8。圖1    殼聚糖（a）以及

16、PLCS（DS分別為b.21.6，c.14.2，d.9.5）的FTIR光譜（略）Figure 1    FTIR spectra of chitosan(a), PLCS (DS 21.6) (b), PLCS(DS 14.2) (c) and PLCS(DS 9.5) (d)圖2    PLCS（DS 14.2）在DMSOd6溶劑中的1HNMR譜（略）Figure 2    1HNMR spectra of PLCS (DS 14.2 ) in DMSOd6    

17、;  激光散射測得PLCS(DS 21.6)粒徑為85 nm，PLCS(DS 14.2) 粒徑為110 nm，PLCS(DS 9.5) 粒徑為140 nm。圖3顯示膠束粒子的形貌近似球狀，粒徑在1050 nm范圍，遠比由DLSC測得的數值小，產生這種現象的原因是DLSC測出的結果是膠束粒子在水溶液中的流體力學粒徑，而TEM呈現的是膠束粒子脫水晾干后的粒徑。圖3    PLCS（DS 14.2）膠束粒子的透射電鏡掃描圖（略）Figure 3    TEM of selfaggregates based on PLCS (DS

18、14.2)2.2    靛玉紅PLCS納米膠束的制備與載藥量測定      所得載藥體系為分散良好的暗紅色粉末，改變藥物與納米載體的投料比例，獲得的靛玉紅載藥量分別為5.5%、8.2%、13.3%。2.3    載靛玉紅PLCS納米膠束在大鼠體內的藥動學      從載藥納米膠束水溶液（載藥量為8.2%）和原料藥混懸液在大鼠體內的藥動學結果（如圖4，表1所示）可見：采用PLCS負載靛玉紅制備成納米膠束后，AUC提高了2.21倍，靛玉紅的

19、生物利用度大大提高；載藥納米膠束較原料藥混懸劑的Cmax高1.72倍；而且達峰時間Tpeak也有顯著性差異(P<0.05)，載藥納米膠束較原料藥混懸液略有提前；表明靛玉紅制備成PLCS納米膠束后，其吸收速度和程度都有明顯改善。提示PLCS負載靛玉紅不僅能提高其水溶性，而且穿透生物膜的能力也得到改善。圖4    單劑量腹腔注射靛玉紅混懸劑與靛玉紅PLCS納米膠束后的大鼠血藥濃度（略）Figure 4    Plasma concentration of indirubin after single intraperitoneal

20、injection of indirubin suspension and PLCSloaded indirubin nanomicells in rats表1    大鼠腹腔注射10 mg/kg靛玉紅混懸劑與靛玉紅PLCS納米膠束的藥動學參數（略）Table 1    Pharmacokinetics of indirubin suspension and PLCSloaded indirubin nanomicells after intraperitoneal injections at a dose of 10 mg/kg i

21、n rat對于難溶性藥物來說，溶解是提高其被動擴散的前提（靛玉紅的小腸吸收為典型的被動擴散機制），將靛玉紅制備成PLCS納米膠束后，可以提高其水溶性，從而體內血藥濃度大大提高，生物利用度也顯著增加。提示PLCS可以作為提高難溶性藥物靛玉紅生物利用度的候選載體，并且有改善靛玉紅治療白血病療效的潛在可能?！緟⒖嘉墨I】  1 吳正紅,周靜,平其能,等.靛玉紅磷脂復合物的跨膜轉運及其犬體內藥代動力學J.中國藥科大學學報,2007,38 (4): 327-331.2 蔣剛彪,馮英,趙慧,等.聚合物納米粒子作為抗腫瘤藥物載體的應用J.中草藥,2007,38（8):1265-1269.3 SIRICA A E,WOODMAN R J. Selective aggregation of L1210 leukaemia cells by the polycation chitosanJ. J Natl Cancer Inst,1971,47(2): 377-381.4 PAE H,SEO W,KIM N,et al. Induction of granulocytic differentia