1、獸 醫 微 生 物 學（Veterinary Microbiology）肖書奇肖書奇動物醫學院預防獸醫學系動物醫學院預防獸醫學系E-mail： 電話四章第四章 病毒與細胞間的相互作用病毒與細胞間的相互作用第一節第一節 病毒的細胞培養病毒的細胞培養第二節第二節 病毒與細胞的相互作用病毒與細胞的相互作用第一節第一節 病毒的細胞培養病毒的細胞培養 病毒是嚴格的細胞內寄生微生物，培養病毒是嚴格的細胞內寄生微生物，培養病毒必須使用細胞。根據病毒的不同選用敏病毒必須使用細胞。根據病毒的不同選用敏感動物（感動物（動物接種動物接種）、雞胚（）、雞胚（雞胚接種雞胚接種）或）或離體細胞進

2、行分離培養（離體細胞進行分離培養（細胞培養細胞培養）。）。一、動物接種一、動物接種接種后通常以動物發病、死亡作為感染的指標。接種后通常以動物發病、死亡作為感染的指標。按病毒侵襲部位不同選擇適當按病毒侵襲部位不同選擇適當的接種途徑。嗜神經病毒接種的接種途徑。嗜神經病毒接種在小鼠的腦內。痘苗病毒和單在小鼠的腦內。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。純皰疹病毒接種于家兔角膜。動物接種的優缺點：動物接種的優缺點：優點：優點：（1）不需要復雜的儀器設備；不需要復雜的儀器設備； （2）技術簡單；）技術簡單； （3）易成功）易成功缺點：缺點：（1）個體差異大）個體差異大 （2）價格昂貴）價格昂貴 （3）數

3、量有限）數量有限 （4）需要隔離畜舍）需要隔離畜舍二、雞胚接種二、雞胚接種一種比較經濟簡便的方法。一種比較經濟簡便的方法。卵殼卵殼殼膜殼膜接種途徑接種途徑 絨毛尿囊膜接種絨毛尿囊膜接種 9-13日齡日齡尿囊腔接種尿囊腔接種 9-10 日齡日齡 卵黃囊接種卵黃囊接種 6-8日齡日齡 羊膜腔接種羊膜腔接種 10日齡日齡 腦內接種腦內接種 10日齡日齡 1氣室氣室 2卵殼卵殼 3卵黃囊卵黃囊 4卵白卵白 5 尿囊腔尿囊腔 6絨毛尿囊絨毛尿囊 7胚胎胚胎 8羊水腔羊水腔 9胚胎外腔胚胎外腔雞胚接種的優缺點：雞胚接種的優缺點：優點：優點：技術簡單、來源充沛、價格低廉、數量可大，技術簡單、來源充沛、價格低

4、廉、數量可大， 不需特殊設備不需特殊設備 缺點：缺點：很多病毒不能適應，主要是哺乳動物的病毒。很多病毒不能適應，主要是哺乳動物的病毒。 細胞培養細胞培養(cell culture)是指利用機械、酶或化學方法使是指利用機械、酶或化學方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至動物組織或傳代細胞分散成單個乃至24個細胞團懸個細胞團懸液進行培養。液進行培養。 三、細胞培養三、細胞培養n每個細胞生理特性基本一致，對病毒易感性相每個細胞生理特性基本一致，對病毒易感性相等等n無個體差異，準確性和重復性好無個體差異，準確性和重復性好n可嚴格執行無菌操作可嚴格執行無菌操作n細胞培養本身就能顯示病毒的生長特征細胞培養

5、本身就能顯示病毒的生長特征n應用空斑技術可進行病毒的克隆化應用空斑技術可進行病毒的克隆化優點：優點：根據細胞來源、染色體特征及傳代次數，可分為三種類型：根據細胞來源、染色體特征及傳代次數，可分為三種類型：n原代細胞：原代細胞：動物組織經胰蛋白酶消化處理，使細胞分散動物組織經胰蛋白酶消化處理，使細胞分散而得到的細胞。而得到的細胞。n二倍體細胞：二倍體細胞：將長成單層的原代細胞消化分散成單個細將長成單層的原代細胞消化分散成單個細胞，繼續培養傳代，其染色體數與原代細胞一樣，保持其胞，繼續培養傳代，其染色體數與原代細胞一樣，保持其二倍染色體數目的細胞，稱為二倍體細胞。二倍染色體數目的細胞，稱為二倍體細

6、胞。n傳代細胞：傳代細胞：能在體外持續增殖傳代的細胞，大多數由癌能在體外持續增殖傳代的細胞，大多數由癌細胞或二倍體細胞突變而成。細胞或二倍體細胞突變而成。（一）細胞的類型（一）細胞的類型（二）細胞培養的方法（二）細胞培養的方法靜置培養：靜置培養：實驗室常用。細胞懸液裝瓶，實驗室常用。細胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養，細胞沉降并貼附在玻面溫箱靜置培養，細胞沉降并貼附在玻面上生長分裂，最后長成單層。上生長分裂，最后長成單層。旋轉培養：旋轉培養：大規模生產疫苗。細胞在玻瓶內生大規模生產疫苗。細胞在玻瓶內生長時，玻瓶不斷緩慢旋轉，細胞貼附于玻瓶四周，長時，玻瓶不斷緩慢旋轉，細胞貼附于玻瓶四周，長成

7、單層。長成單層。懸浮培養懸浮培養微載體培養：微載體培養：懸浮、微載體懸浮、微載體第二節第二節 病毒與細胞的相互作用病毒與細胞的相互作用n殺細胞感染殺細胞感染n非殺細胞感染非殺細胞感染 引致持續感染，對細胞代謝無影響。引致持續感染，對細胞代謝無影響。nRNARNA干擾干擾 n產生干擾素產生干擾素 生產性感染（生產性感染（productive）：）：病毒感染后能產生病毒感染后能產生完整的子代病毒顆粒。宿主細胞感染病毒發生的變完整的子代病毒顆粒。宿主細胞感染病毒發生的變化可能是細胞死亡或細胞轉化。化可能是細胞死亡或細胞轉化。非生產性感染（非生產性感染（nonproductive）或稱頓挫感染或稱頓挫

8、感染（abortive infection）:病毒感染后不形成完整病毒感染后不形成完整的病毒顆粒。的病毒顆粒。持續性感染（持續性感染（persistent infection）:持續長時持續長時間的感染，感染過程中不形成感染性的病毒顆粒。間的感染，感染過程中不形成感染性的病毒顆粒。病毒在宿主易感細胞內增殖造成細胞損傷與死亡，這種感病毒在宿主易感細胞內增殖造成細胞損傷與死亡，這種感染稱為染稱為殺細胞性變化殺細胞性變化。 一、病毒引致的殺細胞變化一、病毒引致的殺細胞變化殺細胞變化殺細胞變化由病毒感染導致的細胞損傷。由病毒感染導致的細胞損傷。CPECPE能在光學顯微鏡下觀察。能在光學顯微鏡下觀察。細

9、胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細胞聚合，如腺病毒；細胞聚合，如腺病毒；細胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；細胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；有些病毒能形成包涵體有些病毒能形成包涵體。（一）細胞病變效應（一）細胞病變效應( (cytopathic effect,cytopathic effect,CPECPE) )CPE觀察觀察CPE觀察觀察CPE觀察觀察正常細胞正常細胞CPECPE觀察觀察正常單層正常單層A72A72細胞細胞接種接種CCVCCV后出現細胞拉網后出現細胞拉網的的單層的的單層A72A72細胞細胞CPE觀察觀察CPE觀察正常單層正常單

10、層A72A72細胞細胞接種犬冠狀病毒（接種犬冠狀病毒（CCVCCV）后形后形成合胞體的的單層成合胞體的的單層A72A72細胞細胞合胞體（合胞體（syncytia）是病毒感染后導致感染細胞及相是病毒感染后導致感染細胞及相鄰細胞細胞膜融合的產物，表現為若干細胞的相鄰細鄰細胞細胞膜融合的產物，表現為若干細胞的相鄰細胞膜消失，成為多核巨細胞。胞膜消失，成為多核巨細胞。可以使病毒從感染的細胞直接進入相鄰的正常細胞，有利于病毒在可以使病毒從感染的細胞直接進入相鄰的正常細胞，有利于病毒在細胞間的擴散。細胞間的擴散。 病毒引致的細胞凋亡和壞死病毒引致的細胞凋亡和壞死細胞死亡（細胞死亡（cell deathce

11、ll death）: :病毒的繁殖、產物等直接病毒的繁殖、產物等直接引起細胞的死亡。引起細胞的死亡。細胞凋亡（細胞凋亡（cell apoptosis）是病毒感染引起細胞的是病毒感染引起細胞的生理性死亡，即程序性死亡。生理性死亡，即程序性死亡。 由于病毒的殺細胞感染導致的死亡，總是發生在病毒復制完成由于病毒的殺細胞感染導致的死亡，總是發生在病毒復制完成之后。病毒抗凋亡，以延長細胞生命，直至完成子代病毒的復制周之后。病毒抗凋亡，以延長細胞生命，直至完成子代病毒的復制周期。期。 細胞總是在子代病毒產出之前自行死亡；是宿主細胞的重要防細胞總是在子代病毒產出之前自行死亡；是宿主細胞的重要防御機制。可及早

12、清除感染病毒的細胞，延緩病毒在體內蔓延。御機制。可及早清除感染病毒的細胞，延緩病毒在體內蔓延。病 毒 感 染 抗 體 依 賴 的 增 強 作 用病 毒 感 染 抗 體 依 賴 的 增 強 作 用 （ a n t i b o d y -dependent enhancement of viral infection, ADEsyncytia）:在病毒感染過程中，宿主產生的抗在病毒感染過程中，宿主產生的抗體與病毒結合，非但未能阻斷病毒吸附宿主細胞，反體與病毒結合，非但未能阻斷病毒吸附宿主細胞，反而增強了病毒對細胞的感染，提高了病毒的滴度。而增強了病毒對細胞的感染，提高了病毒的滴度。能夠使半數組織細

13、胞在一定條件下發生細能夠使半數組織細胞在一定條件下發生細胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。50%50%組織細胞感染量（組織細胞感染量（TCIDTCID5050）（二）（二） 空斑試驗空斑試驗 plaque assay細胞單層接種病毒后再覆蓋一層含營養液的瓊脂細胞單層接種病毒后再覆蓋一層含營養液的瓊脂層。這樣病毒自然感染釋放后不能懸浮于液體中，層。這樣病毒自然感染釋放后不能懸浮于液體中，只能感染鄰近與之接觸的細胞，以致感染區由原只能感染鄰近與之接觸的細胞，以致感染區由原始病灶向四周擴大，形成類似細菌的菌落，此即始病灶向四周擴大，形成類似細菌的菌落，此即空斑試驗

14、空斑試驗。空斑是由一個感染性病毒粒子復制形成的，類似于細菌的菌落，空斑是由一個感染性病毒粒子復制形成的，類似于細菌的菌落，稱為稱為空斑形成單位（空斑形成單位（PFU）。病毒懸液中的感染性病毒量以每病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的毫升含有的PFU來表示。來表示。 CELLS空斑試驗的用途：空斑試驗的用途：1. 測定病毒數量測定病毒數量2. 純化病毒純化病毒 單個空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，單個空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可獲得病毒克隆。可獲得病毒克隆。3. 鑒定病毒鑒定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。不同病毒的空斑具有不同的特征。（三）包涵體（三）包涵體（inclusion b

15、ody)定義：定義：是某些病毒感染細胞產生的特征性的是某些病毒感染細胞產生的特征性的形態變化，在普通光學顯微鏡下可見胞漿或形態變化，在普通光學顯微鏡下可見胞漿或胞核內出現的呈胞核內出現的呈嗜酸性嗜酸性或或嗜堿性嗜堿性染色、大小染色、大小數量不等的數量不等的圓形圓形或或不規則形不規則形的的團塊狀結構團塊狀結構，稱為包涵體，又稱為內基氏小體（稱為包涵體，又稱為內基氏小體（Negri body）。）。包涵體的性質包涵體的性質n病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體氏體n大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體的包涵體n細胞變

16、性的產物，不含病毒，如皰疹病毒的細胞變性的產物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體包涵體狂犬病毒包涵體（狂犬病毒包涵體（Negri body）定義：定義：細胞利用內源或外源的小分子雙股細胞利用內源或外源的小分子雙股RNA片段，特異性地降解同源基因的片段，特異性地降解同源基因的mRNA，從而導致靶基因轉錄后，從而導致靶基因轉錄后基因沉默基因沉默（post translational gene silence, PTGS）的現象。的現象。 二、二、RNA干擾（干擾（RNA interference, RNAi）定義：定義：由病毒或誘生劑刺激機體細胞產生的具有抗病毒、由病毒或誘生劑刺激機體細胞產生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的糖蛋白。抗腫瘤和免疫調節作用的糖蛋白。 種類：種類：、干擾素。干擾素。抗病毒作用：抗病毒作用：干擾素不直接作用于病毒，而是作用于干擾素不直接作用于病毒，而是作用于鄰近的細胞，使其產生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降鄰近的細胞，使其產生抗病毒蛋白，這些抗病毒