1、實驗八 果蔬中維生素C的提取和定量測定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）【目的】 1.學習并掌握定量測定維生素C的原理和方法。2.了解蔬菜、水果中維生素C含量情況。【原理】維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時會產(chǎn)生壞血病，因此又稱為抗壞血酸（ascorbic acid）。它對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。近年來，發(fā)現(xiàn)它還有增強機體對腫瘤的抵抗力，并具有化學致癌物的阻斷作用。維生素C是不飽和多羥基物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，許多水果、蔬菜中的含量更為豐富。維生素C具有很強的還原性。還原型抗壞血酸能還原染料2,6二氯酚靛酚（dichloro-phenol-indophenol，簡稱DC

2、IP），本身則氧化為脫氫型。在酸性溶液中，2,6二氯酚靛酚呈紅色，還原后變?yōu)闊o色。因此，當用此染料滴定含有維生素C的酸性溶液時，維生素C尚未全部被氧化前，則滴下的染料立即被還原成無色。一旦溶液中的維生素C已全部被氧化時，則滴下的染料立即使溶液變成粉紅色。所以，當溶液從無色變成微紅色時即表示溶液中的維生素C剛剛?cè)勘谎趸藭r即為滴定終點。如無其它雜質(zhì)干擾，樣品提取液所還原的標準染料量與樣品中所含還原型抗壞血酸量成正比。【試劑和器材】一、試劑2%草酸溶液： 草酸2g溶于100mL蒸餾水中。1%草酸溶液： 草酸1g溶于100mL蒸餾水中。標準抗壞血酸溶液(0.1mg/mL)：準確稱取50.0mg純

3、抗壞血酸（應(yīng)為潔白色，如變?yōu)辄S色則不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀釋至500mL，貯于棕色瓶中，冷藏。最好臨用前配制。0.1% 2,6二氯酚靛酚溶液：250mg 2,6二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO3的熱水中，冷卻后加水稀釋至250mL，貯于棕色瓶中冷藏 (4)，約可保存一周。每次臨用時，以標準抗壞血酸溶液標定。二、材料：水果、蔬菜三、器材研缽，組織勻漿器，吸量管，抽濾設(shè)備，離心機，濾紙，容量瓶，滴定管，錐形瓶。【操作方法】一、提取 水洗干凈待測的新鮮蔬菜或水果，用紗布或吸水紙吸干表面水分。然后稱取20g，加入1020mL 2%草酸，研磨成漿狀，抽濾，合并濾液，濾液總體積定容

4、至50mL。或者研磨后以2%草酸洗滌離心(4000r/min，10min)23次，合并上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度。二、標準液滴定 準確吸取標準抗壞血酸溶液1mL置50mL錐形瓶中，加9mL 1%草酸，以0.1% 2,6二氯酚靛酚溶液滴定至淡紅色，并保持15秒不褪色，即達終點；取10mL 1%草酸作空白對照，按以上方法滴定。由所用染料的體積計算出1mL染料相當于多少毫克抗壞血酸。三、樣品滴定 準確吸取濾液兩份，每份10mL, 分別放入2個錐形瓶內(nèi)，滴定方法同前。另取10mL 1%草酸作空白對照滴定。【計算】（VA-VB）×C×T×100維生素C含量（mg/

5、100g樣品）= D×W 式中：VA為滴定樣品所耗用的染料的平均毫升數(shù)； VB為滴定空白對照所耗用的染料的平均毫升數(shù)； C為樣品提取液的總毫升數(shù)；D為滴定時所取的樣品提取液毫升數(shù)；T為1mL染料能氧化抗壞血酸毫克數(shù)（由操作二計算出）；W為待測樣品的重量（g）。【注意事項】(1) 某些水果、蔬菜（如橘子、西紅柿等）漿狀物泡沫太多，可加數(shù)滴丁醇或辛醇。(2) 整個操作過程要迅速，防止還原型抗壞血酸被氧化。滴定過程一般不超過2min。滴定所用的染料不應(yīng)小于1mL或多于4mL，如果樣品含維生素C太高或太低時，可酌情增減樣液用量或改變提取液稀釋倍數(shù)。(3) 本實驗必須在酸性條件下進行。在此條件

6、下，干擾物反應(yīng)進行得很慢。(4) 2%草酸有抑制抗壞血酸氧化酶的作用，而1%草酸無此作用。(5) 干擾滴定因素有：若提取液中色素很多時，滴定不易看出顏色變化，可用白陶土脫色，或加1mL氯仿，到達終點時，氯仿層呈現(xiàn)淡紅色。Fe2可還原二氯酚靛酚。對含有大量Fe2的樣品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此時Fe2不會很快與染料起作用。樣品中可能有其它雜質(zhì)還原二氯酚靛酚，但反應(yīng)速度均較抗壞血酸慢，因而滴定開始時，染料要迅速加入，而后盡可能一點一點地加入，并要不斷地搖動三角瓶直至呈粉紅色，于15秒內(nèi)不消退為終點。【思考題】 1為了測得準確的維生素C含量，實驗過程中都應(yīng)注意哪些操作步驟？為什么？2試簡述

7、維生素C的生理意義。【小資料】一、維生素C維生素C是人類膳食中必需的維生素之一，如果缺乏維生素C，將導致壞血病發(fā)生。因此，維生素C又稱為抗壞血酸，有防治壞血病的功效。抗壞血酸在自然界分布十分廣泛，存在于新鮮水果和蔬菜中，尤其是檸檬果實和一些綠色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特別豐富。抗壞血酸在機體同具有廣泛的生理功能，已知體內(nèi)許多重要物質(zhì)的代謝反應(yīng)都需要抗壞血酸的參與。它是脯氨酸羥基化酶的輔酶，故有增進膠原蛋白合成的作用。機體中許多含疏基的酶，需要依賴于作為還原劑的抗壞血酸的保護，使酶分子的疏基處于還原狀態(tài)，從而維持其催化活性。由于抗壞血酸的氧化還原作用，它可促進免疫球蛋白的合成，增強機體的抵

8、抗力。同時還能使氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽（簡稱GSH），而GSH可與重金屬結(jié)合而排出體外，因此維生素C常用于重金屬的解毒。此外，抗壞血酸尚有許多其他生理功能，但其作用機理還不十分清楚。抗壞血酸是一種不飽和的多羥基內(nèi)酯化合物，稍有酸味的糖類白色晶體，易溶于水，故屬于水溶性維生素。在溶液中其分子內(nèi)C2和C3之間的烯醇式羥基上的氫極易解離并釋放出 H+ ，而被氧化成脫氫抗壞血酸，氧化后仍具有維生素C的生理活性，但它易分解為二酮古洛糖酸，此化合物不再具有維生素C的生理活性。維生素C有很強的還原性，在堿性溶液中加熱并有氧化劑存在時，易被氧化而破壞。還原型和氧化型抗壞血酸可以互相轉(zhuǎn)變，在生物組織

9、中自成一氧化還原系統(tǒng)。由于維生素在營養(yǎng)學和臨床方面的重要意義，故對食物和生物材料中維生素含量的測定是十分必須的。抗壞血酸的定量測定方法很多，有2,6二氯酚靛酚（簡稱DCIP）滴定法、碘滴定法、2,4二硝基苯肼法、 Folin試劑比色法、紫外吸收法等。其中廣泛采用的是DCIP 滴定法，它具有簡便、快速、比較準確等優(yōu)點，適用于許多不同類型樣品的分析。缺點是不能直接測定樣品中的脫氫抗壞血酸及結(jié)合抗壞血酸的含量，易受其他還原物質(zhì)的干擾。如果樣品中含有色素類物質(zhì)，將給滴定終點的觀察造成困難。在酸性環(huán)境中，抗壞血酸（還原型）能將染料2,6DCIP還原成無色的還原型2,6DCIP，而抗壞血酸則被氧化成脫氫抗

10、壞血酸。氧化型2,6DCIP在中性或堿性溶液中呈藍色，但在酸性溶液中則呈粉紅色。因此，當用2,6DICP滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時，在抗壞血酸未被全部氧化前，滴下的2,6DCIP 立即被還原成無色，一旦溶液中的抗壞血酸全部被氧化時，則滴下微量過剩的2,6DCIP 便立即使溶液顯示淡粉紅色或微紅色，此時即為滴定終點，表示溶液中的抗壞血酸剛剛?cè)勘谎趸Ｒ罁?jù)滴定時2,6DCIP 標準溶液的消耗量 (mL)，可以計算出被測樣品中抗壞血酸的含量。氧化型2,6DCIP與還原型抗壞血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中進行反應(yīng)。即先將樣品溶于一定濃度的酸性溶液中或經(jīng)抽提后，再用2,6DCIP標準溶液滴定至終點。食

11、物和生物材料中常含有其他還原物質(zhì)，其中有些還原物質(zhì)可使2,6DCIP還原脫色。為了消除這些還原物質(zhì)對定量測定的干擾，可用抗壞血酸氧化酶處理，破壞樣品中還原型抗壞血酸后，再用2,6DCIP 滴定樣品中其他還原物質(zhì)。然后從滴定未經(jīng)酶處理樣品時2,6DCIP標準溶液的總消耗量中，減去滴定非抗壞血酸還原物質(zhì)2,6DCIP 標準溶液的消耗量，即為滴定抗壞血酸實際所消耗的2,6DCIP標準溶液的體積，由此可以計算出樣品中抗壞血酸的含量。另外，還可利用抗壞血酸和其他還原物質(zhì)與2,6DCIP反應(yīng)速度的差別，并通過控制樣品溶液在pH1 3 范圍內(nèi)，進行快速滴定，可以消除或減少其他還原物質(zhì)的作用，一般在這樣的條件

12、下，干擾物質(zhì)與2,6DCIP的反應(yīng)是很慢的或受到抑制。生物體液（如血液、尿等）中的抗壞血酸的測定比較困難，因為這些樣品中抗壞血酸的含量很低，并且存在許多還原物質(zhì)的干擾，同時還必須預(yù)先進行脫蛋白處理。在生物體液中含有巰其、亞硫酸鹽及硫代硫酸鹽等物質(zhì)，它們都能與DCIP反應(yīng)，但反應(yīng)速度比抗壞血酸慢得多。樣品中巰基物質(zhì)對定量測定的干擾，通常可以藉加入對氯汞苯甲酸(簡稱PCMB)而得到消除。二、壞血病幾百年前的歐洲，長期在海上航行的水手經(jīng)常遭受壞血病的折磨，患者常常牙齦出血，甚至皮膚淤血和滲血，最后痛苦地死去，人們一直查不出病因。奇怪的是，只要船只靠岸，這種疾病很快就不治而愈了。水手們?yōu)槭裁磿脡难?/p>

13、呢？  一位隨船醫(yī)生通過細心觀察發(fā)現(xiàn)，水手在航海中很難吃到新鮮的水果和蔬菜。這位醫(yī)生試著讓水手天天吃一些新鮮的柑橘，奇跡出現(xiàn)了壞血病很快就痊愈了。那么，柑橘為什么會有如此神奇的本領(lǐng)呢？經(jīng)過長期的研究，科學家后來從新鮮的水果和蔬菜中提取出維生素C（又叫抗壞血酸），并證實壞血病就是維生素C缺乏癥。疾病簡介壞血病（scurvy），由維生素C缺乏引起，所以維生素C缺乏病主要是指壞血病。但維生素C缺乏不僅能引起壞血病，還與炎癥、動脈硬化、腫瘤等多種疾患有關(guān)。壞血病在歷史上曾是嚴重威脅人類健康的一種疾病。過去幾百年間曾在海員、探險家及軍隊中廣為流行，特別是在遠航海員中尤為嚴重，故有“水手的恐怖”

14、之稱。關(guān)于壞血病的明確記載始于十三世紀十字軍東征時代，有的學者追溯至公元前希波克拉底（Hippocrates）時代。另據(jù)稱，在原始社會人類的遺體上也曾發(fā)現(xiàn)壞血病的遺跡。關(guān)于壞血病的防治，早在17-18世紀就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以利用新鮮蔬菜、柑桔及檸檬等防治。1753年Lind的壞血病名著問卷心菜、腎上腺中提取出抗壞血病物質(zhì)“已糖醛酸”（hexuronic acid）。與此同時，它的化學結(jié)構(gòu)，1933年Reichstein人工合成成功，從而，人類終于征服了壞血病。但有關(guān)維生素C的理論和應(yīng)用的研究則遠未結(jié)束。病因和發(fā)病情況：主要由于食物中缺乏維生素C而致病，人工哺乳嬰兒及成人食物中長期缺乏新鮮果蔬(嗜酒、偏食等)、或長期感染對維生素C需要量增多時，可患本病。癥狀：維生素C缺乏后數(shù)月，患者感倦怠、全身乏力，精神抑郁、虛弱、厭食、營養(yǎng)不良，面色蒼白，牙齦腫脹、出血，并可因牙齦及齒槽壞死而致牙齒松動、脫落，骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛，皮膚淤點、淤斑，毛囊過度角化、周圍出血，小兒可因骨膜下出血而致下肢假性