1、    急性髓性白血病細胞CD87表達及其意義        【摘要】目的探討小兒急性髓性白血病細胞尿激酶受體(uPAR, CD87)表達及其臨床意義。方法應用流式細胞術(FCM)檢測了54例急性髓性白血病(AML)及20例急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒CD87的表達，還用FCM及逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測了U937、HL-60、K562細胞在氟波酯(PMA)作用下誘導分化過程中CD87表達的改變。結果54例AML中33例（61%）CD87為陽性表達，20例

2、ALL均為陰性表達。CD87陽性組與陰性組AML發生髓外浸潤的比例分別為88%和19%(P<0.001)；外周血幼稚細胞百分率分別為（61.0±21.5）%和（30.5±15.2）%(P<0.001)；完全緩解（CR）率分別為52%和86%(P<0.05)；發生出血的比例分別為73%和62%(P>0.05)。U937、HL-60、K562經PMA誘導分化后，CD87表達增高。結論CD87可作為白血病診斷、分型、判斷預后的指標之一，也可作為誘導分化的指標之一。【關鍵詞】受體，細胞表面白血病，粒細胞，急性流式細胞術 The expression and

3、the clinical implication of CD87 on acute myeloid leukemia cells in childrenXU Jie, CHAI Yihuan, XI Xiaodong, et al. Childrens Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215003【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of receptor for urokinase (CD87) on acute myeloid leukemia (AML) cells in childre

4、n and its clinical implication.MethodsThe expression of CD87 was detected with flow cytometry (FCM) in 54 AML patients and 20 acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. The expressionsa of CD87 on U 937, HL-60 and K562 cells were also studied with FCM and reverse transcription-polymerase chain rea

5、ction (RT-PCR) during differentiation induced by phorbol myristate acetate (PMA) in vitro.ResultsThe staining for CD87 was positive in 33 of 54 patients with AML (61%) and negative in 20 patients with ALL. In CD87 positive and negative groups of AML, the percentages of infiltration of extramedullary

6、 tissues were 88% and 19% (P<0.001), respectively. The percentages of blast cells in peripheral white blood cells were（61.0±21.5）% and（30.5±15.2）% (P<0.001), respectively. The complete remission rates were 52% and 86% (P<0.05), respectively. The percentages of bleeding tendency we

7、re 73% and 62% (P>0.05), respectively. The CD87 expressions on U937, HL-60 and K562 cells were increasing during differentiation induced by PMA.ConclusionCD87 might be used as one of the markers for leukemia diagnosis, typing and prognosis, and also for myeloid leukemia cells differentiation.【Key

8、 words】Receptors, cell surfaceLeukemia, myelocytic, acuteFlow wtometry許多惡性腫瘤細胞尿激酶受體(urokinase receptor, uPAR ,CD87)表達增高，并參與其浸潤、轉移等過程。進一步研究表明，CD87還參與腫瘤細胞的增殖、分化、信號傳導等1。既往腫瘤CD87的研究多局限于實體瘤，但近幾年來的研究表明，在部分白血病細胞也有CD87的表達2。其意義有待于進一步研究。我們用流式細胞術檢測了54例小兒急性髓性白血病細胞(acute myeloid leukemia, AML)CD87的表達，并報道了CD87表達與

9、臨床表現及預后的關系。另外，還檢測了不同的白血病細胞株在誘導分化過程中CD87表達的改變。對象及方法一、對象 54例AML及20例急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)均為本院確診的初治患兒。男42例，女32例；年齡5個月14歲，其中M1 6例，M2 27例，M3 10例，M4 4例，M5 6例，M6 1例；L1 15例，L2 4例，L3 1例。二、主要試劑和材料CD87單抗為America Diagnostic公司產品。淋巴細胞分離液為上海試劑二廠產品。異硫氰酸熒光素標記羊抗鼠單抗(FITC-GAM IgG)為邦定公司產品。RPMI-1640

10、及逆轉錄酶MMLV為Gibcol公司產品。胎牛血清為杭州四季青公司產品。氟波酯(phorbol myristrate acetate, PMA)為Sigma公司產品。以無水乙醇配制成濃度為16 mol/L的貯存液，置-20保存。三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)及DNA分子量標準購自Sangon公司，Taq酶為Boehringer Mannheim公司產品。隨機6寡聚核苷酸引物及RNA酶抑制劑(RNAsin)購自華美生物工程公司。三、流式細胞術檢測方法取骨髓血經淋巴細胞分離液，常規分離制備單個核細胞懸液，0.01 mol/L PBS洗滌，錐蟲藍活細胞計數>95%。10%胎牛血清孵育30分鐘以

11、封閉Fc受體。以PBS調整細胞密度為2×105/ml，取細胞懸液100 l加CD87單抗20 l（l50稀釋），室溫孵育30分鐘，陰性對照加鼠IgG代替一抗，經PBS洗滌后，加FITC-GAM IgG 20 l(1:10稀釋)，室溫下避光30分鐘，經PBS洗滌后流式細胞儀（Coulter公司，Epics XL型）檢測。每例檢測5 00010 000個細胞，陽性判斷標準為熒光陽性細胞>20%。四、白血病細胞株的誘導分化白血病細胞株HL-60、U937、K562細胞懸浮于RPMI-1640培養液（含15%胎牛血清），分別加入PMA終濃度為50 nmol/L，細胞起始密度為2

12、5;105/ml，置37，5%CO2培養箱，培養5天，分別于作用前及作用后1、3、5天，取部分細胞用流式細胞術檢測其CD87表達的改變。五、細胞形態觀察及硝基四氮唑藍（NBT）還原試驗U937、K562、HL-60細胞經PMA作用前及作用后1、3、5天后取部分培養細胞涂片，瑞氏染色，光鏡下觀察形態。部分培養細胞懸液加入等量0.2% NBT Hanks液（無Ca2+, Mg2+）混勻后，37孵育30分鐘離心制片，瑞氏染色，計數200個細胞中陽性細胞數。六、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）根據CD87 cDNA序列設計合成引物（由法國Genset公司合成），引物序列為：引物：5-CTG CTGC

13、TGCTCCACACCTG-3引物：5-ACGCCCTTCTTCACCTTCCTG-3擴增產物為450 bp，-actin作為內參照（由中國科學院上海細胞所合成），引物序列為：引物：5-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3引物：5-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG GAT-3擴增產物為360 bp。取1×106細胞經異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取總RNA，乙醇沉淀，干燥，蒸餾水溶解。測吸光度A(曾稱光密度OD)260值計算RNA濃度。取1 g RNA加0.1 g隨機6聚寡核苷酸引物，加蒸餾水至20 l，70變性5分鐘，再加入5×逆轉錄緩沖液

14、8 l，二硫蘇糖醇（DTT，0.1 mol/L）4 l，dNTPs（10 mmol/L）2 l，RNAsin 50 U，逆轉錄酶MMLV 200 U，加蒸餾水至40 l，混合后37 45分鐘，95 5分鐘。取逆轉錄產物10 l，加10×PCR緩沖液5 l，MgCl2（50 mmol/L）1.5 l，dNTPs（10 mmol/L） 1 l，uPAR引物、各2 l(5 mol/L)，-actin引物、各1l(5 mol/L)，Taq酶1 U，加蒸餾水至50 l，置PTC-100 PCR擴增儀（MJ Research Inc），94變性5分鐘，循環參數為94 30秒，56 30秒，72

15、1分鐘，共30個循環，最后72 5分鐘，取擴增產物20 l進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外線下觀察并照相，照片在GS300吸光度掃描儀（Hoefer Scientific Instruments公司產品）上進行定量分析。七、統計學檢驗采用t及2檢驗。結果一、臨床病例CD87表達54例AML中33例為陽性表達（61%）。6例M1中2例表達陽性，27例M2中15例(56%)為陽性表達，10例M3中6例(60%)表達陽性，4例M4及6例M5皆為陽性。1例M6及20例ALL均為陰性表達。二、CD87表達與臨床表現及預后的關系54例AML中，CD87陽性組發生髓外浸潤及外周血幼稚細胞百分率明

16、顯高于陰性組；CD87陽性組的完全緩解率明顯低于陰性組；兩組之間發生出血的比例無顯著差異（表1）。表1AML患兒CD87表達與臨床表現及預后的關系CD87總例數髓外浸潤出血CR外周血幼稚細胞(%)例數百分率(%)例數百分率(%)例數百分率(%)陽性組3329882473175261.0±21.5陰性組214191362188630.5±15.2兩組比較2值25.5840.6976.582t值5.659P值<0.001>0.05<0.05<0.001三、白血病細胞誘導分化過程中CD87表達的改變U937、HL-60、K562細胞經PMA作用5天后，NB

17、T還原率明顯增高，大部分成為貼壁細胞，形態向單核巨噬細胞轉變。HL-60和K562細胞在PMA作用前及作用后1、3、5天CD87的表達分別為（20.5±4.1)%、(60.1±5.6)%、(73.3±4.5)%、(85.0±7.2)%和（36.7±6.1）%、（55.2±5.5）%、（70.5±6.3）%。U937細胞在未經PMA作用前即已有（92.5±4.2）%的陽性表達率，故作用主要表現為熒光強度的改變，其相對熒光強度作用前及作用后1、3、5天分別為（2.0±0.6）、（5.8±0.8）、（

18、7.8±1.3）、（8.5±1.2）。四、白血病細胞經PMA作用后CD87 mRNA表達的改變U937細胞CD87 mRNA表達較高，HL-60及K562細胞也有少量CD87 mRNA表達，而經PMA作用后U937，HL-60及K562細胞CD87 mRNA水平均明顯增高，與-actin的比值見表2。表2PMA作用前后U937、HL-60、K562細胞CD87 mRNA水平(n=3)細胞CD87mRNA/-actint值P值作用前作用24小時后U9370.61±0.110.87±0.103.023<0.05HL600.22±0.070.7

19、6±0.224.252<0.01K5620.11±0.080.74±0.185.526<0.01討論CD87是一高度糖基化的單鏈糖蛋白，分子量為50 00065 000，由羧基端通過磷脂酰肌醇錨定形式結合于細胞膜，氨基端為uPA結合區3。在血細胞CD87主要表達于成熟的粒、單核及嗜酸細胞，而在正常造血前體細胞不表達4。本組54例急性髓性白血病細胞中33例（66%）CD87表達陽性，而20例急性淋巴細胞白血病均為陰性表達。Plesner等2檢測了27例急性髓性白血病，其中12例（44%）為陽性表達，在急淋未見CD87表達。Jardi等5也曾報道表達TdT

20、和CD2的髓系白血病細胞不表達CD87。說明CD87可作為急性白血病細胞診斷分型的指標之一。本研究CD87陽性表達率比Plesner的結果高，但經統計學處理，2=2.025，P>0.05，差異無顯著意義。尿激酶（urokinase or urokinase-type plasminogen activator, uPA）通過CD87結合于細胞表面，激活結合于細胞表面鄰近的纖溶酶原使之轉變為纖溶酶。纖溶酶不僅本身可降解一些細胞外基質成分，如層素、纖維連接蛋白等。而且還可以激活其他金屬蛋白酶原，以進一步降解細胞外基質。因此，CD87在細胞對組織的纖溶中起著重要的啟動、定位和擴大作用，可參與組

21、織修復、血管形成以及腫瘤浸潤轉移等多種生理病理過程。在成熟的粒、單核細胞CD87表達，脫離骨髓及血管，進入組織并在其中游走，從而參與炎癥及免疫反應6。在M5往往有CD87的表達，而M5往往有肝、脾、皮膚、粘膜等髓外組織浸潤表現。因此，推測白血病細胞CD87表達與其脫離骨髓進入外周血循環以及對髓外組織的浸潤有關。Martinez等7對鼠白血病細胞株WEH I3B的研究也證明，白血病細胞表面纖溶活性與其對細胞外基質的降解有關。但到目前為止，尚未見白血病細胞CD87表達與其臨床表現及預后關系的報道。本研究結果表明，CD87表達陽性組發生髓外浸潤的比例及外周血幼稚細胞數明顯高于CD87表達陰性組，CD

22、87陽性組的CR率明顯低于陰性組。因此，uPAR表達與髓性白血病的臨床表現，生物學特性有關。可作為判斷其預后的指標之一。Frade等8曾報道在急性髓性白血病血漿 uPA增高與出血傾向有關。而本結果表明，白血病細胞CD87表達與出血無明顯關系。白血病細胞CD87表達而使其細胞表面纖溶活性增高，主要與其浸潤能力有關。CD87表達于成熟的粒、單核細胞，是髓系細胞成熟的標志。本組結果表明，U937、HL-60、K562細胞經PMA誘導分化后CD87表達增加。說明CD87可作為髓系白血病細胞誘導分化較好的指標。但是K562細胞經PMA誘導前FCM未檢出CD87表達，而RT-PCR檢測其mRNA有少量表達

23、，可能是誘導前僅少量表達于胞漿內。另外，Nusrat等9的研究表明在PMA誘導HL-60細胞分化過程中，uPA可促進其分化，而uPA單抗可抑制PMA的誘導分化作用。近年來較多的研究也表明CD87還參與細胞的信號傳導。因此，CD87可能不僅是髓系白血病細胞誘導分化的指標，而且在誘導分化過程中可能還起著促進作用，這方面尚有待于進一步的研究。 本課題部分由國家教委留學回國人員科研基金資助(項目編號：96-644)作者單位：215003 蘇州醫學院附屬兒童醫院（徐杰、柴憶歡、李禎萍、王津媛）；蘇州醫學院血栓與止血研究室（奚曉東、白霞、王愛青、陸長明、阮長耿）參考文獻1Dano K, Behrendt

24、N, Brunner N, et al. The urokinase receptor: protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion. Fibrinolysis, 1994, 8: 189-203.2Plesner T, Ralfkiaer E, Wittrup M. et al. Expresseon of the receptor for urokinase-type plasminogen activation in normal and neoplastic blood cells a

25、nd hematopoietis tissue. Am J Clin Pathol, 1994, 102: 835-841.3Ploug M, Ronne E, Behrendt N, et al. Celluar receptor for urokinase plasminogen activator. Carboxyl-terminal processing and membrane anchoring by glycosyl-phatidylinesitol. J Biol Chem, 1991, 266: 1926-1933.4Knapp W, Strobl H, Majdic O, et al. Flow cytometric analysis of cell-surface and intracellular antigen in leukemia diagnosis. Cytometry, 1994, 18: 187-198.5Jardi M, Ingl