1、光合細菌的分離與特性研究摘 要：從華南農業大學水田土壤中經過富集培養和分離篩選，得到 4 株光合細菌,編號為 B1B4。 采用不同培養條件對菌株進行了菌株生長和色素合成情況的觀察檢測，結果表明，以 3 000 lx 為最優生長光照強度，以厭氧+光照為促進光合色素合成的最佳組合條件。 通過對菌株 B2 的菌落形態、 培養特征、 菌體形態學觀察及生理生化特性測定， 初步鑒定其為膠狀紅長命菌（Rubrivivax gelatinosus），該菌株發酵液對茄子、辣椒的促生作用已初有效果。關鍵詞:光合細菌； 分離； 色素合成； 生理生化特性Isolation and characteristics st

2、udy on photosynthetic bacteriasAbstract： Four strains of photosynthetic bacteria numbered from B1 to B4 were isolated from the paddy soil of South ChinaAgricultural University through enrichment culture， isolation and screening。 Condition of the growth and pigment synthesis was observed,which showed

3、 3000 lx was the optimum light intensity for growth and anaerobic condition with light had greatest impact on pigmentsynthesis. By enrichment and purification， colonial morphology, culture characteristic and thallus morphology and the determination ofphysiological and biochemical characteristics， st

4、rain B2 was identified to be Rubrivivax gelatinosus。 Contrast with compound fertilizer，there was an early effect in promoting the growth of eggplant and chili by fertilizing fermentation liquor of strain B2。Key words： photosynthetic bacteria； isolation; pigment synthesis； physiological and biochemic

5、al characteristics光合細菌(Photosynthetic bacteria,PSB）是地球上最早出現、自然界中普遍存在、具有原始光能合成體系的原核生物1，包括產氧光合細菌（藍細菌等)和不產氧光合細菌(紅螺菌等)， 是一類具有相同功能光合作用的混合菌群。不同自然環境下,光合細菌具有固氮、脫氮、固碳、硫化物氧化等多種功能2，每一種功能都使光合細菌的研究既具理論意義，又具實用價值. 已有研究表明，光合細菌發酵液中含有多種生理活性物質，如葉綠素 a、b,類胡蘿卜素,維生素(尤其是 B 族維生素)，植物激素（如 IAA、GA3、ABA、乙烯、細胞分裂素)和核酸、水楊酸、氨基酸以及單細胞

6、蛋白質、輔酶 Q 和抗病毒因子等3。 由于菌體本身無毒,又含有這些營養物質和生理活性物質， 使其具有調節微生態平衡、促進動植物生長、增加產量和提高質量等獨特的生理功能，光合細菌在農業生產方面有很好的應用價值4。本試驗從水田土壤中分離4 株光合細菌進行生長影響因素檢測， 并對其中能在瓊脂平板上快速生長的兼性需氧株B2 進行了基本特性的鑒定，研究此菌株發酵液對農作物的促生作用，以進一步研制光合菌肥制劑.1 材料與方法1.1 培養條件分離培養基每1 000 mL 水中加入 KH2PO40.5 g，K2HPO40。6 g, （NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g,Na

7、Cl 0。2 g,CaCl2·2H2O 0.075 g，乙酸鈉 1。5 g，酵母膏 0。1 g，微量元素液 1。0 mL(H3BO30。28 g、NaMoO40。075 g、CuSO40.004 g、MnSO40.21 g、ZnSO40.024 g、水 1 000 mL）,pH 為 7.2（±0。2)5。 富集培養液設置為分離培養基各營養成分的3 倍。 培養溫度選擇 286.1。2 光合細菌的富集與分離篩選分離源為華南農業大學教學試驗農場的水田土壤. 稱取水田土壤10 g，加無菌水 50 mL 充分振蕩打散,制成懸濁液，與富集營養液按 15 比例裝人三角瓶中，并覆蓋一層無菌

8、液體石蠟(高約 2 cm），封口，靜置于光照培養箱，28培養714 d，待瓶壁上長出黃、綠、紅、紫紅等多種不同顏色的菌株，取此菌懸液 1 mL 繼續富集培養，持續培養至第 3 代。采用梯度平板涂布法和梯度傾注厭氧法對光合細菌進行初步篩選，選取長勢較好的菌落作進一步平板劃線，直至菌株得以分離純化。1.3 光照強度對光合細菌生長的影響將光合細菌分離株的菌懸液等量接種于規格統一的富集培養液試管中，使初始OD600約為0.2，分別于 1 000、3 000 和 5 000 lx 光照下靜置培養 ，溫度 28；每隔 24 h取樣測定OD600，繪制生長曲線。1.4 光照與氧氣對光合細菌合成色素的影響將分

9、離株接種于富集培養液，在 3 000 lx 光照強度培收稿日期：2012-02-23基金項目：國家“973”基礎研究發展計劃項目（2010CB126502）;教育部新世紀優秀人才支持項目(NCET07-0315）；高校博士點專項基金項目（20094404110006）;廣東省科技計劃項目(2010B060200017,2010B090400450）作者簡介:張茜（1986-)，女，在讀碩士生，E-mail:zhangqianfsl通訊作者：彭桂香（1968-），女,博士，副教授,E-mail：gxpengscau。edu。cn廣東農業科學2012 年第 9 期112（下轉第128 頁)表1 不

10、同光照、氧氣組合下光合細菌生長過程顏色變化培養條件厭氧光照好氧光照好氧黑暗厭氧黑暗B1澄清淡黃黃綠澄清淺黃淺綠澄清黃白澄清B2澄清紅深粉紅澄清淡紅紅澄清紅澄清淡紅B3澄清淺褐褐澄清淺黃黃褐澄清黃白澄清B4澄清紅紅褐澄清黃紅澄清淺黃淺黃澄清分離菌株顏色變化養箱和遮光培養箱中分別靜置和搖床培養，溫度28。 于接種后1、3、7 d 觀察菌體及培養物顏色變化。1。5 菌株 B2 的鑒定和基本特性研究參照文獻7-8，對菌落的形態 、細胞形狀進行觀察 ，以鑒定分離株；利用本實驗室生產的Bio-BIQA 碳源利用板對碳源利用進行測定9-10；利用本實驗室生產的Bio-BIQB板對抗生素、NaCl 及 pH

11、的耐受性測定10；吲哚試驗、明膠液化試驗與生長素分泌定性試驗參照文獻11-12.1.6 菌株 B2 發酵液促生效果研究以普通復合肥為對照，菌株 B2 發酵液為處理，施用在茄子及辣椒作物上，考察菌株 B2 發酵液對作物的促生長作用。2 結果與分析2.1 光合細菌菌株的篩選選擇10410-6 稀釋度的平板篩選菌株。 傾注厭氧法平板中的菌株種類多,色澤鮮明,但不易挑取；平板涂布法平板中菌落種類較少，顏色較淡，其中具有不同菌落特征的4 株菌得以分離純化， 保存并分別命名為 B1 (淡綠，點狀）、B2（淺紅,點狀）、B3(淺褐，點狀)、B4（紅色，餅狀）。2。2 光照強度對光合細菌生長的影響試驗結果顯示

12、（圖 1）,菌株 B1 在 3 種光照強度下均生長欠佳；菌株 B2、B3 則均表現出較高的生長速率，且弱光條件下B2 也能達到較高水平；B4 長勢稍差， 且不喜強光。表明光合細菌在不同光照強度下， 生長活性有較大差異，且適宜光合細菌生長繁殖的光照強度為3 000 lx, 在該光照強度下,菌體對數生長期較長，細胞增殖達到較高數值。2。3 光照和氧氣對光合細菌合成色素的影響由2.1 可知，傾注法厭氧光照培養,菌落具有色澤,說明光照、厭氧是光合細菌合成色素的要素，因此，本試驗繼續探討了形成色素的優化培養條件，結果見表1。表1 顯示，光合細菌在黑暗條件下培養，不形成色素物質，且無氧黑暗條件下長勢更差；

13、而在光照條件下，長勢、色澤均優于黑暗培養,且厭氧培養能使菌株更具光合細菌顏色特征。 光照和厭氧對光和色素合成的影響原因可能是：光照條件下，菌株在生長初始階段先進行好氧生長并逐漸消耗基質中的氧氣， 而后在厭氧條件合成色素物質(葉綠素和類胡蘿卜素)13,這可從這些菌株培養時間越長、菌液顏色越深的現象中證實。 菌株 B1 顯色情況差，認為該菌株合成色素可能要求較低的氧化還原電位，只有在嚴格厭氧和光照下才能合成色素。 由此表明部分光合細菌在厭氧光照條件下由光合磷酸化得到能量， 在好氧和黑暗條件下，以有氧呼吸的有機物氧化磷酸化中取得能量，代謝途徑可隨著環境的變化而進行轉換。2。4 菌株 B2 菌體形態及

14、特征菌株B2 為革蘭氏陰性 ,單個細胞為短桿狀(圖 2,封三)，二分分裂繁殖. 在光照厭氧、好氧，黑暗好氧及微好氧條件均能生長，光照厭氧液體培養物由最初的淺黃色變為深粉紅色, 瓶底、 瓶壁及液面上形成一層深紅色隔氧膜,不隨震蕩散開而集聚成團. 瓊脂平板上菌株也能較快生長,呈淺紅至深紅色點狀菌落，菌落表面微光滑、突起、濕潤、有光澤、透明，菌落邊緣整齊。2。5 菌株 B2 理化性質Bio-BIQA 96 孔板中（圖 3，封三），B2 能利用的碳源有吐溫40、吐溫 80、D-葡萄糖、D甘露糖、L-果糖、D-果糖、酮戊二酸、琥珀酸鈉和水楊酸鈉。Bio-BIQB 板結果（圖 4，封三)顯示，B2 喜堿不

15、喜酸，耐pH 410；耐 NaCl 濃度達 4。0；對 300 g/mL 的氨芐青霉素仍有耐受性；耐慶大霉素、新霉素可達50 g/mL；而對卡拉霉素、鏈霉素僅能在 5 g/mL 濃度下生長；低濃度的氯霉素、四環素、紅霉素就能抑制菌株 B2 生長. 菌株 B2的吲哚反應呈陽性，且能分泌生長素IAA，能液化明膠。2.6 菌株 B2 發酵液促生效果由于未至結果期，尚未開始測量菌株B2 發酵液促生1.21.00.80。60.40.20OD600B1B2B3B40 24 48 72 96 120時間（h）1。21。00。80.60。40。20OD6001。21。00。80.60。40.20OD600B1

16、B2B3B4B1B2B3B40 24 48 72 96 120時間（h）0 24 48 72 96時間（h)A B CA：1000lx；B：3000lx；C：5000lx圖1 不同光照強度下 4 株菌生長曲線113（上接第 113 頁）效果的具體數值。但從圖 5（封三）、圖 6（封三）均可明顯看出，右邊的處理比左邊的對照長勢優越，可初步看出其促生效果。3 結論經試驗比較，傾注法厭氧光照培養，分離獲得的光合細菌種類多，菌落具有明顯的色澤；平板涂布法具有操作簡單、培養時間短的優點, 但部分菌株在培養短時間內不具有光合細菌顏色。 采用普通平板涂布法、光照培養，能較有效地分離兼性光合細菌. 在光照強度

17、為 3 000 lx 的條件下，光合細菌細胞對數增殖期較長，并達到較高數值，為生長適宜強度. 兼性光合細菌在有氧光照培養條件下，尤其是培養時間較長時，菌落能形成明顯的色澤；但對于大多數光合細菌而言,厭氧、光照條件的組合是形成光合色素的最佳選擇；黑暗不利于光合細菌的生長和光合色素生成。綜合菌株B2 形態特征和理化性質試驗結果，參照文獻78，鑒定 B2 為紫色非硫細菌類，變形菌綱，伯克氏菌目，科未定，紅長命菌屬，膠狀紅長命菌(唯一種）；此菌株發酵液對茄子和辣椒作物的促生作用已初見成效,并將在下一步的應用研究中做出詳細測定。參考文獻：1 林多，趙磊,陳寧,等。光合菌肥對黃瓜生長和品質的影響J。北方園

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