1、1 周海鈞周海鈞中國藥品生物制品檢定所中國藥品生物制品檢定所（杭州，（杭州，06.11.2906.11.29）ICHICH生物技術生物技術/ /生物生物藥品的藥品的質量要求質量要求2基因工程藥物的質量控制基因工程藥物的質量控制 基因工程產品的質量控制與傳統生產方法所得產品有本質的差別。可能會含有用傳統生產方法不可能存在的有害雜質。例如在細菌中表達的產品可能有內毒素、致敏原，在動物細胞中表達的產品可能有雜質和病毒。3 基因工程產品審評的要點基因工程產品審評的要點(1)(1)化學物理鑒定的一致性化學物理鑒定的一致性(2)(2)污染物限度控制的重要性（熱原、病毒、宿主細胞污染物限度控制的重要性（熱原

2、、病毒、宿主細胞DNADNA）(3)(3)全過程控制質量的必要性全過程控制質量的必要性(4)(4)效價測定的重要性效價測定的重要性(5)(5)標準化的趨勢標準化的趨勢4動物的種族特異性動物的種族特異性IFNIL-4, IL-9IL-3, IL-5, GM-CSFIL-1, IL-2, IL-6, IL-8FGF-B, TNF, G-CSF, EPO, t-PASource: Sundwall et al.19905不同類別產品藥理毒理測試項目不同類別產品藥理毒理測試項目類 別激 素 ,細 胞 因 子 ,調 節 因 子血 液 制 品單 克 隆 抗 體疫 苗I 亞 類項 目 a bIIIIIIII

3、IIII*II*III*急 性 毒 理亞 急 性 毒 理慢 性 毒 理生 殖 毒 理致 突 變致 癌 變依 賴 性局 部 刺 激抗 原 性致 熱 原 性其 他 : 免 疫 毒 性 交 叉 反 應一 般 藥 理ADMEXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX*XX6不同類別產品藥理毒理測試項目不同類別產品藥理毒理測試項目m原則上必須做。 可能必要的。如產品與人體蛋白結構不同，則必須做。 可能必要的。如有合理理由，可省略。X 可能不必要的。I a 蛋白相同，生理劑量。I b 蛋白相同，高劑量。II 蛋白與人體接近。III 蛋白與人體相差較多。I* 人 型。I

4、I* 非人型。III* 與藥結合型。7基因工程藥物的評價基因工程藥物的評價要從以下三方面:（1）起始材料的評價，包括宿主細胞及用于生產的基因的來 源、性質和序列的基礎資料。（2）制造過程的評價。（3）最終產品的評價。8ICHICH對生物技術對生物技術/ /生物制品質量要求的文件生物制品質量要求的文件 ICH對生物技術/生物制品的質量要求，除了應符合ICH有關文件外，在質量部分，重點提出了個文件：ICH Q5AQ5A、Q5BQ5B、Q5CQ5C、Q5DQ5D、Q5E Q5E 和和 Q6BQ6B。9ICHICH對生物技術對生物技術/ /生物制品質量要求的文件生物制品質量要求的文件 病毒安全性評價病

5、毒安全性評價 ( (Q5AQ5A） 細胞的表達構建體分析（細胞的表達構建體分析（Q5BQ5B） 生物制品穩定性試驗（生物制品穩定性試驗（Q5CQ5C） 細胞基質的來源和鑒定（細胞基質的來源和鑒定（Q5DQ5D） 生產工藝改變產品的可比性（生產工藝改變產品的可比性（Q5EQ5E） 標準規格標準規格 ( (Q6BQ6B) )10病毒安全性評價病毒安全性評價 (Q5A)(Q5A)q 要對細胞基質原材料進行全面定性和篩查，以明確存在哪些病毒污染物。q 通過確定污染物的人向性，對危險程度做出評價。q 制定測試外源病毒的計劃。q 為獲得最佳病毒清除效果，對病毒清除或滅活研究應進行仔細設計，在同一生產過程中

6、使用不同的病毒滅活或消除方法.q 認證和評價病毒滅活和消除的方法。11去除或滅活病毒安全性指南去除或滅活病毒安全性指南 (Q5A)(Q5A)q病毒去除或滅活的驗證研究主要是用于評價在生產過程中去除或滅活病毒的能力（種類及滴度）q由于用的模型病毒不會與實際污染病毒相同，因此要根據生產品種和知識加以判斷。q研究的模型病毒要有針對性q病毒污染可來自起始材料，亦可能來自工藝過程。12去除或滅活病毒安全性指南去除或滅活病毒安全性指南 (Q5A)(Q5A)評價滅活或去除病毒的能力，應考慮q 滴度降低q 滅活的速度，滅活曲線形狀q 方法耐用性，即條件改變后的適用性q 對不同種類病毒的可選擇性13去除或滅活病

7、毒安全性指南去除或滅活病毒安全性指南(Q5A)(Q5A) q 病毒去除與病毒滅活不同 如用層析去除(remove)病毒，則流速和柱孔徑是重 要可變因素。 如用緩沖液滅活(inactivation)病毒，則溫度和PH是 重要因素。q 從統計角度看，病毒污染試驗有一定的局限性，主要取決于樣 品數量，應用統計算出最大應用測試樣品數。q 生產工藝全過程要嚴格執行GMP，以免去除病毒或滅活病毒 后，生產過程再污染。 14細胞的表達構建體分析（細胞的表達構建體分析（Q5B）1. 表達構建體為含有重組蛋白編碼序列的表達載體。 表達構建體分析的目的是確保產品的正確編碼序列被導入到宿主細胞，并從培養到生產結束保

8、持不變，以保證終產品的質量和一致性。2. 在活細胞中產生的重組蛋白，其基因序列可能發生突變而改變蛋白質的性質，從而對病人產生潛在的副作用。蛋白質分析方法有時不能檢測到所有重組蛋白編碼序列突變造成的蛋白質結構變化， 核酸分析可用于驗證表達構建體的編碼序列和物理狀態。因次，用核酸分析和蛋白質分析才能保證最終產品的氨基酸序列。 15 3.用以制備主細胞庫（MCB）的表達構建體和細胞克隆l 對于目的基因：弄清來源，克隆經過l 對于表達載體：提供表達載體名稱、結構和遺傳特性，說明載體組成各部分的來源和功能，如復制子和啟動子來源，抗生素抗性標志物，構建中所用位點的酶切圖譜l 對于宿主細胞：要提供細胞株名稱

9、、來源、傳代歷史、檢定結果及基本生物學特性等。細胞的表達構建體分析（細胞的表達構建體分析（Q5B）164.細胞庫系統l細胞庫是裝有均一細胞成分并在規定條件下儲存的安瓿集合，每個 安瓿含有等份的單批細胞。l主細胞庫(MCB)通常來自選定的含有表達構建體的細胞克隆。l工作細胞庫（WCB）是通過擴增一個或多個MCB的安瓿制得。l重組蛋白的生產應建立在良好的主細胞庫和工作細胞庫基礎上。 應詳盡表述：q 細胞庫的生產過程以及其儲存條件。q 對細胞庫的表型和基因型的標記進行鑒定，證明重組蛋白的表達 或表達構建體的存在。q 采用限制性內切酶圖譜或其它適宜的技術分析表達構建體的拷貝 數、插入或缺失情況以及整合

10、位點的數目。 細胞的表達構建體分析（細胞的表達構建體分析（Q5B）17生物技術生物技術/生物制品穩定性試驗（生物制品穩定性試驗（Q5C）1. ICH制定的“新藥原料及制劑穩定性試驗”的指導原則總體上適用于生物技術產品及生物制品。但由于這類制品的活性成份一般是蛋白質和/或多肽，因此，維持其分子構型，從而保持其生物活性取決于共價鍵和非共價鍵的作用力。這些制劑對諸如溫度變化、氧化、光照、離子含量及切割力等環境因素較為敏感，為保持其生物活性，避免降解，必須嚴格規定其貯藏條件。2. 原材料和制劑的貯藏期應根據長期、真實時間、真實條件的穩定性研究的初步數據制定, 至少應提供3批的穩定性數據，這3批應能代表

11、生產規模的生產和貯藏條件。在貯藏期要求大于6個月時，至少需申報6個月的穩定性試驗資料。183.進行穩定性試驗的原料藥的質量應能代表用于臨床前研究、臨床究，以及規模化生產制品的質量。 4. 對于穩定性的指標，申報者應設計一系列穩定性試驗指標，以便能保證檢 測出制品成分、純度及效價的變化。效價測定是穩定性試驗的重要部分。 5. 當在長期穩定性試驗、加速試驗和/或強力破壞試驗中檢出降解產物有明顯的定性或定量變化時，應考慮其潛在的危害性，并需在長期穩定性試驗中對降解產物進行定性和定量的分析。 生物技術生物技術/生物制品穩定性試驗（生物制品穩定性試驗（Q5C）19 6. 生物技術產品及生物制品的貨架壽命

12、一般在半年到5年之間。l 如預定貨架壽命在1年或1年以內，真實時間穩定性研究應為前3個月每月進行一次，以后每3個月一次。l 如預定貨架壽命在1年以上，穩定性試驗應在貯藏期的第一年每3個月進行一次；第二年每6個月進行一次，以后每年進行一次。l以上所規定的測試次數適用于產品在批準前的穩定性試驗，如在該產品批準后，提供的數據說明產品仍是相當穩定的，則可減少穩定性試驗次數。生物技術生物技術/生物制品穩定性試驗（生物制品穩定性試驗（Q5C）20細胞基質的來源和鑒定（細胞基質的來源和鑒定（Q5D）“細胞基質細胞基質”是指微生物細胞或來自于人或動物的細胞系。是指微生物細胞或來自于人或動物的細胞系。l 動物來

13、源的細胞系是指所有后生動物，包括體外無限生長的傳代動物來源的細胞系是指所有后生動物，包括體外無限生長的傳代 細胞系以及體外有限代次的二倍體細胞。細胞系以及體外有限代次的二倍體細胞。l 微生物的來源包括細菌、真菌、酵母和其他單細胞生物。微生物的來源包括細菌、真菌、酵母和其他單細胞生物。 21鑒定目的：鑒定目的： 由于細胞源性的生物制品存在外來的污染物,對產品的質量具有重大影響。細胞基質的特性影響產品的質量和安全性，為有效地控制產品質量,需對操作細胞基質的各方面進行嚴格的控制。細胞基質的來源和鑒定（細胞基質的來源和鑒定（Q5D）22 鑒別試驗可利用細胞的表型或遺傳型的特征，但不必做所有的試驗。通常

14、對MCB做鑒別試驗，而對每個WCB僅做有限的鑒別試驗。后生動物細胞 對于人或動物細胞，可采用形態學分析與其他試驗相結合的方法。在大多數情況下，同工酶分析足以確證人或動物細胞庫的種屬來源；微生物細胞 對于大多數微生物細胞，分析細胞在選擇性培養基上生長情況就可確證宿主細胞庫的宿主細胞種族特性。細胞基質的鑒定（細胞基質的鑒定（Q5D）23 評估MCB和WCB的生物學純度，即無外源性微生物因子和外源性細胞污染是細胞研制和建庫的關鍵。后生動物細胞應用MCB和WCB單個容器（容器總數的1，但不少于2個）檢測 細菌和真菌；支原體；可能污染的病毒。微生物細胞設計特異性試驗方法檢測微生物細胞庫中外源性微生物因子

15、和外源 性細胞污染物。細胞庫的純度試驗細胞庫的純度試驗（Q5D）24生產工藝改變產品的可比性生產工藝改變產品的可比性 ( (Q5E)l ICH制訂了生物技術產品的質量評估和生產工藝有關 鑒定方法，分別在ICH文件(Q5A、Q5B、Q5C、Q5D、Q6B和CTD-Q)中，在應用中證明是行之有效的。Q5E是工藝改變后產品質量可比性的指導文件l 工藝改變將對原料藥及產品的質量產生影響，由此影響到生產部門的資源及效益。25) 產產品品仿仿制制已已生生產產產產品品已已批批準準改改變變生生產產工工藝藝產產品品正正開開發發批批準準以以后后的的可可比比性性不不同同階階段段的的可可比比性性藥藥廠廠B B藥藥廠廠

16、C C藥藥廠廠D D工工藝藝步步驟驟Y Y- -B B工工藝藝步步驟驟Y Y- -C C工工藝藝步步驟驟Y Y- -C C藥藥廠廠A A工工藝藝步步驟驟X X發發明明者者藥藥廠廠A A工工藝藝步步驟驟Y Y發發明明者者 兩類改變的可比性兩類改變的可比性(q5E)(q5E)26 研究的主要課題l 改變的階段，改變的程度。l 對產品的影響。l 鑒定方法的能力。l 質量標準具安全性/有效性的關鍵。 生物可比性（生物可比性（Q5E）27原料藥A細胞庫 發酵 提純 生產地點 原料藥A 處方 劑型容器 灌封產品A 產品A生物可比性生物可比性-改變的類型改變的類型（Q5E）28效價測定方法原料藥標準規格 產

17、品標準規格藥代動力學原料藥A原料藥A 產品A 產品A生物可比性生物可比性-數據的比較數據的比較（Q5E）29預期活性成分：預期活性成分：A 蛋白質具有預期的結構。B 蛋白質來自預期的DNA序列。C 蛋白質來自預期DNA序列并產生預期翻譯后修飾。D 蛋白質來自在預期下游提純后的修飾產生的生物活性分子。產品有關物質：產品有關物質：在生產和貯存過程中產生的預期變異體，其性能(化學、物理和生物)與預期產品是可比的，稱產品有關物質。列為活性成份。產品有關雜質：產品有關雜質：當預期產品的分子變異體，其性能與預期產品沒有可比性時，稱為產品有關雜質。 預期產品與其變異物的定義預期產品與其變異物的定義（Q5E）

18、30評估可認為是合格產品評估可認為是合格產品 相同的原始細胞株（或MCB） 分子結構和雜質屬性有可比性，包括 結構特征; 物理化學性 質; 免疫性質; 雜質的圖形 由于培養條件的改變導致糖基異質性的變異需各例分析預期產品預期產品 A A（例：單克隆抗體例：單克隆抗體） （Q5E）31評估可認為合格產品評估可認為合格產品l 相同的蛋白質分析結構（氨基酸序列）l 相同的物理化學性質l 相同的生物學特性，特別是空間結構物質 ，反映了臨床有效性l 具有可比性的雜蛋白質預期產品預期產品 B B （Q5E）32 評估認為合格產品評估認為合格產品l 相同的原始細胞株（或MCB）。l 相同的蛋白質結構（氨基酸

19、序列）。l 具有可比性物理化學性質。l 具有可比性的糖基類型：唾液酸形式和含量， 觸角圖形（用IEF,CE，FACE等方法）。l 具有可比性的生物學活性，特別對于高級結構蛋白 質，體內活性代表了臨床有效性。l 具有可比性的雜質譜。預期產品預期產品（例：糖基化形式）（例：糖基化形式）（Q5E）33 對其評估，需參考A、B、C，根據 其修飾類型和工藝改變的步驟各例分 拆加以評定。預期產品預期產品 （Q5E）34鑒定鑒定l全面了解原料的化學結構、物理性狀、生物學特性、雜 質圖譜 及降解途徑l選擇作為含量測定和穩定性試驗的指標。l改變工藝的步驟對原料藥的影響。生物可比性的關鍵因素生物可比性的關鍵因素

20、(5E)(5E)35標準準規格標準準規格保證工藝步驟是穩定的。保證產品質量是一致的。保證用藥安全和有效。生物可比性的關鍵因素生物可比性的關鍵因素 (5E)(5E)36 驗證驗證 最大程度上保證改變的步驟或物料可以穩定地生產出一種符合預定標準規格和質量要求的產品。 生物可比性的關鍵因素生物可比性的關鍵因素 (5E)(5E)37應用應用ICHICH文件評價生物可比性文件評價生物可比性(Q5E)(Q5E) 工藝步驟 ICH文件 工程菌構建 遺傳穩定性 Q5B 細胞基質 細胞基質 Q5D 建細胞庫 病毒安全性 Q5A 細胞培養 產品分離和純化 標準規格 Q6B 預期產品/預期原料藥 產品穩定性 Q5C

21、 產品處方 臨床前安全性 S6 產 品38生物可比性生物可比性- -工藝(Q5E) 全面評價改變工藝的專門 測試項目。 最可能影響質量的工藝步驟 的測試。39 Indication: mode of action; outcome measures. Dosing & patient response: units of activity; rout of administration; narrow therapeutic index Safety verses Efficacy: immunogeuicity; active ingredient vs impurities生物可比

22、性生物可比性- -臨床方面臨床方面(Q5E(Q5E) )40同一生產廠改變工藝需提供資料同一生產廠改變工藝需提供資料(Q5E)(Q5E)at pre-approval stageat pre-approval stage 當穩定性、臨床前、臨床關鍵性資料 完成后，申請者提出對工藝需更改， 則應提供原工藝與改變工藝不同產品 比較性試驗以證明對質量安全性和有 效性有無影響。41At post-approval stageAt post-approval stage 生產工藝；結構分析；化學物理和生物特性；各工藝可接受的標準 DS/DP標準規格。 產品穩定性資料。與已批準產品相互比較的資料。 單劑量

23、毒性試驗的資料（一種動物資料）；免疫原性和致熱性試驗資料（與已批準產品相比）。 用已批準產品相比的生物等效性資料。 對改變工藝的再評價和驗證的資料。同一生產廠改變工藝需提供資料同一生產廠改變工藝需提供資料(Q5E)(Q5E)42不同生產廠仿制已批準廠需提供文件不同生產廠仿制已批準廠需提供文件(Q5E)(Q5E) 生產工藝、結構分析，化學物理生物學特性的詳細資料。 單劑量毒性試驗及其他相關毒性研究的資料。 產品有效性藥理試驗的支持性資料。 證明產品有效性和安全性的臨床資料。 對各工藝的評價、驗證和質控的數據。43標準規格標準規格 (Q6B) 測試方法及限度規定q適用于基因重組或非基因重組經細胞表

24、達并純化的蛋白質和多肽、蛋白質多肽衍生物及蛋白質多肽的偶聯物。亦可用于從動物組織或體液中提取的蛋白質和多肽。q不適用于抗生素、合成多肽、肝素、各種維生素、細胞代謝物、DNA產品、常規疫苗、細胞制品、全血和血細胞成份。44鑒定（鑒定（Characterization） (Q6B)n 應建立合適的標準規格，規格的項目包括物理化學性質、生物效價、免疫化學特性、純度和雜質等。n 項目指標的依據是臨床前及臨床研究的數據，批與批之間一致的數據，穩定性試驗等開發階段的數據。n 向管理部門申報新藥時，需建立對照品，供測定生物效價和物理化學鑒定應用。45鑒定（鑒定（Characterization） (Q6B)

25、q 物理化學性質q 生物活性測定q 免疫化學性質q 純度、雜質和污染物q 含量46物理化學性質物理化學性質(Q6B)p 對產品物理化學性質的鑒定一般包括組分測定，物理性質和其一級結構測定。p 蛋白質存在一定程度內在結構的異質性，應規定產品異質性的形式，并證明與臨床前與臨床研究用的樣品是一致的。p 原料藥和制劑異質程度和概況應批與批之間一致。p 如產品產生與臨床前和臨床試驗時的異質時，應評價。47生物活性測定生物活性測定(Q6B)p 評價產品生物活性是鑒定產品的重要組成部分。p 測定生物活性可采用以下方法：p 用動物作生物檢定。測定產品對某器官的生物反應。p 用細胞作生物檢定。測定產品在細胞水平

26、上的生化和 生理反應。p 生物試驗。測定產品對酶反應速率的影響或免疫反應引起生物反應。亦可用如配體/受體結合試驗。48物理化學方法取代生物方法的條件物理化學方法取代生物方法的條件(Q6B)p 產品的物理化學方法數據較完善，并已證實其高級結構。p 物理化學與生物試驗之間的關系亦已闡明。p 工廠已積累了足夠數據，可用物理方法取代。p 當產品僅用物理化學方法表示生物活性，結果應用重量表示。p 產品出廠檢定，工廠可合理選擇定量方法（生物測定還是物理化 學鑒定）49免疫化學性質免疫化學性質(Q6B)p 產品的作用是產生抗體，則對其免疫性質應全面鑒定。p 抗原用蛋白結合試驗方法測定抗體需測定其親和力和免疫

27、反應性（包括交叉反應性）。p用免疫化學方法（如ELISA，Western Blot）測定的其些蛋白分子藥物，則用可識別蛋白分子上不同抗原決定簇的抗體。p蛋白質的免疫化學特性可用以建立鑒別、一致性、純度或定量方法。p如免疫化學特性試驗用作批出廠檢驗，則抗體有關材料應詳細建立。50純度、雜質和污染物純度、雜質和污染物(Q6B) 純度：純度：p 純度或相對純度的結果隨方法而異。p 以其某個生物活性為指標的相對純度用生物活性單位或重量表示。p 純度用幾種方法合并的結果進行估計。p 當變異體是從生產過程形成的預期產物，則應看作為產品有關物質而不是雜質。p 產品有關物質應制訂其一個成份或混合成份的具體要求

28、表示其純度。p 工廠在出廠檢驗時可選用合理的其中一種方法測定其純度。51純度、雜質和污染物純度、雜質和污染物(Q6B)雜質雜質 ：p 雜質有的是生產過程產生，有的是與產品有關。如果雜質可以分離，則應制訂雜質限度。p 生產有關雜質是指生產過程中產生的雜質，產品有關雜質是指生產過程或貯存過程產生的分子變異體。p 雜質限度制定要根據臨床前和臨床研究的數據和多批產品考察的數據而定。52純度、雜質和污染物純度、雜質和污染物(Q6B)污染物：污染物：p 污染物是指生產過程帶入的危險性物質，如化學/生化物質（微生物蛋白酶）或某些微生物。污染物需嚴格控制。在生產過程中和最廣終產品都要制訂指標。p 病毒和支原體

29、污染的檢查和質量控制參考ICH 的Q5A、Q5D。53含含 量量(Q6B)p 含量一般用蛋白質含量表示，應選擇合適的物理化學方法測定蛋白質含量。p 有時蛋白質測出的含量與生物測定的量是相關的。如有一定相關性，在生產過程中的參數可不用生物活性表示而用測得量表示。54分析方法有關問題分析方法有關問題(Q6B)p 對照標準品或對照物質: 如新藥為全新化合物，工廠應建立工廠用的一級對照品，在日常應用時還應建立工廠工作對照品。p 對產品有關物質、生產過程有關雜質應分別建立對照物質。p 分析方法的驗證: 除生物技術產品或生物制品特殊應用方法外，應按ICH的Q2A、Q2B方法進行驗證。55生產過程的控制生產過程的控制(Q6B)p 根據生產工藝制訂的標準規格對產品應是可控的并能重復的。p 生產過程中各步嚴格控制的數據作為生產的產品一致性依據。 生產過程的試驗結果可作為可接受限度亦可作為內控限度。p 生產用原料應符合一定的標準。用于各種劑型的輔料及容器系統應符合藥典標準。56放行的限度與貨架限度放行的限度與貨架限度(Q6B) 總的要求是出廠限度要比貨架限度更嚴，項目包括效價和降解產物，有些國家Release limit是指工廠的限度（in-house limits）不