1、中藥中重金屬檢測研究進展重金屬免疫檢測技術PPT模板下載： 行業PPT模板： 節日PPT模板： PPT素材下載： PPT圖表下載： 優秀PPT下載： PPT教程： Word教程： Excel教程： 資料下載： PPT課件下載： 范文下載： 試卷下載： 教案下載： 樣品前處理 重金屬在實際樣品中往往以化合物的形態存在，一般不能直接進行檢測。 檢測前進行樣品前處理來除去干擾因素，并使金屬離子釋放到液相檢測環境中，以便后續檢測。 基本原則： 盡量完整地保留被測組分 使被測組分得到有效濃縮常用樣品前處理方法濕式消解法干式消解法（灰化法）微波消解法 硝酸 硝酸-過氧化氫 硝酸-高氯酸 利用微波的穿透性和

2、激活反應能力，在密封裝置內，使樣品溫度迅速升高，加入一定量的酸溶液，使樣品中有機物質分解。Cu、As、Cd、PbHg究竟選用哪種方法,主要是根據分析元素及樣品基體的性質而定。重金屬檢測技術ThemeGallery is a Design Digital Content & Contents mall developed by Guild Design Inc.常規檢測技術新型檢測技術 比色法 原子吸收光譜法（AAS） 原子熒光光譜法（AFS） 紫外分光光度法 高效液相色譜法（HPLC）重金屬檢測技術ThemeGallery is a Design Digital Content &am

3、p; Contents mall developed by Guild Design Inc.常規檢測技術新型檢測技術 比色法 原子吸收光譜法（AAS） 原子熒光光譜法（AFS） 紫外分光光度法 高效液相色譜法（HPLC） 中國藥典 2010 年版一部中采用AAS或ICP-MS對甘草、丹參、黃芪、金銀花、西洋參、白芍、阿膠及枸杞子這8種藥材中的重金屬量進行測定。 硫代乙酰胺法、砷斑法、銀鹽法 操作簡便 準確度和選擇性差紫外可見光分光光度法高效液相色譜法比色法 重金屬+試劑= 顯色在紫外可見光下有吸收 快速、簡便、重現性好 干擾多、選擇性差 多用于鉛、汞測定 痕量金屬離子+有機試劑=穩定的有色絡

4、合物 多元素同時測定 絡合試劑的選擇有限原子熒光光譜法（AFS） 檢測限低于AAS 線性范圍寬 干擾少 操作簡便 靈敏度高 應用元素有限原子吸收光譜法（AAS）1.火焰原子吸收分光光度法2.石墨爐原子吸收分光度法 二者常配合使用，前者檢測速度快，后者靈敏度高3.氫化物原子吸收法 檢測限低、干擾小，但需專門的氫化物發生器，可檢測元素較少4.冷原子吸收法 只用于含汞元素的測定電感耦合等離子體原子發射光譜法（ICP-AES） 高頻感應電流產生高溫，將反應氣加熱、電離，利用元素發出的特征譜線進行測定 靈敏度高， 檢測限低， 精密度高，線性范圍寬及抗干擾能力強 能將多種金屬元素同時或順序測定， 測定速度

5、快 適用于絕大部分金屬元素的測定 彌補了原子吸收法等不能同時測定多種元素的不足， 在痕量元素分析中占有很大的優勢 應用較多的是用其檢測各類中藥材或中藥復方中各重金屬含量 電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS） 利用電感耦合等離子體將樣品汽化，使待測金屬元素分離出來，再進行質譜測定 綜合ICP較高的離子化能力和MS的高分辨 、 高靈敏度及連續測定多種元素等的優點， 只需一次處理樣品， 一次上機就可以同時給出測試結果， 可與多種進樣或分離技術聯用 更低的檢出限， 更寬的線性范圍， 更強的抗干擾能力， 更高的精密度及分析速度， 可以提供精確的同位素信息， 是目前痕量分析領域最先進的方法 其價格較為昂

6、貴 ，應用最多的仍然是對中藥重金屬的含量測定高效液相-電感耦合等離子體質譜聯用技術（HPLC-ICP-MS） 中藥中重金屬檢測大部分是測定中藥樣品中待測元素的總量， 但僅依靠測定元素總量來評價毒理作用是片面的， 關鍵是要分析元素的形態 用HPLC將樣品中各元素形態進行有效分離，再用ICP-MS進行測定 融合HPLC高效分離及ICP-MS低檢出限、寬線性范圍、能跟蹤多種元素及同位素信號等優點 目前多用于中藥中砷形態的分析和鎘含量的測定免疫法檢測技術 一種輔助檢測方法 用于現場抽檢， 批量樣品快速掃描等檢驗 省時、 省力、 便于攜帶、 易于操作、 費用低廉，靈敏度高和選擇性強 重金屬離子本身為小分

7、子物質，不具備免疫原性和反應原性，不能直接免疫動物產生特異性抗體 金屬離子帶有電荷，能與生物分子發生不可逆反應導致動物中毒 免疫原性：刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞的能力 反應原性：與抗體或致敏淋巴細胞發生特異性反應的能力 既有免疫原性，又有反應原性的物質稱為完全抗原 只有免疫原性，沒有反應原性的物質稱為半抗原 只有設計金屬離子成為完全抗原，才能制備出單克隆抗體，進而建立重金屬離子的免疫檢測方法前提工作 選擇適當的絡合物跟重金屬離子特異性結合，讓其具有一定的空間結構，然后產生反應原性，進而能與相應抗體產生特異性結合； 將結合了金屬離子的化合物連接于載體蛋白上，產生免疫原性，便能制備出相應抗體重

8、金屬離子絡合物載體蛋白反應原性（與抗體結合）免疫原性(產生抗體) 關鍵：尋找合適的絡合物，即雙功能螯合劑 目前常用的雙功能螯合劑： 乙二胺四乙酸 （EDTA） 二乙烯三胺五乙酸 （DTPA） 載體蛋白： 血藍蛋白（KLH） 牛血清白蛋白（BSA）由于載體蛋白會刺激機體產針對其自身的抗體，為了減少干擾，篩選出重金屬-螯合物特異性的抗體，需合成與其他載體蛋白（如卵清蛋白（OVA）偶聯的復合物作為篩選用的檢測抗原。 Cu(II)-DTPA-BSA：免疫抗原，刺激機體產生抗體 Cu(II)-DTPA-OVA：檢測抗原，也成包被抗原，固定在板上，用于篩選檢測重金屬離子的免疫檢測 采用抗原抑制檢測的方法，

9、 按照抗體的種類分類：1. 單克隆抗體免疫檢測 間接競爭性酶聯免疫吸附檢測(ELISA) 一步法免疫檢測 KinExA 免疫檢測等2. 多克隆抗體免疫檢測 熒光偏振免疫檢測 (FPIA) 膠體金快速免疫層析檢測法 (CGEIA) 目前應用較多的是 ELISA 檢測法。酶聯免疫吸附法 (ELISA)技術 較為成熟 樣本前處理簡單，便于大批量樣本快速檢測 可以適應重金屬殘留含量的微、痕量分析 直接法 間接法 競爭法 主要步驟1. 單克隆抗體的制備2. 單抗的鑒定3. Cu(II)間接競爭ELISA檢測方法的建立4.間接競爭 ELISA 法與 ICP-AES 法的比較1. 單克隆抗體的制備 制備完全

10、抗原：通過雙功能螯合劑 DTPA（p-SCN-Bn-DTPA）螯合 Cu（），再分別與 BSA、OVA偶聯，制備免疫完全抗原和檢測完全抗原 動物免疫： BALB c 小鼠a.首次免疫：Cu（） -DTPA-BSA +等量弗氏完全佐劑b. 間隔 14 d，Cu（） -DTPA-BSA+弗氏不完全佐劑c.融合前 3 d， Cu（） -DTPA-BSA，直接腹腔注射加強免疫。 Cu(II)-DTPA-BSA：免疫抗原 Cu(II)-DTPA-OVA：檢測抗原，包被抗原 細胞融合及篩選： 免疫小鼠脾細胞+SP2/0 細胞(小鼠骨髓瘤細胞) 篩選陽性雜交瘤細胞株（即可產生抗體，又可在體外無限繁殖，但效價

11、低） 腹水單抗的制備： 注射陽性細胞株細胞 ，10 d 后根據小鼠生長狀況采集腹水。 離心取上清，得腹水單抗2.單抗的鑒定 腹水效價的測定 單抗亞型的鑒定 單抗特異性的檢測：間接競爭 ELISA 法。 用 Cu（）-DTPA-OVA 包被酶標板 加入 DTPA（pH 8. 0）， 10 l 孔； 加入不同濃度的金屬離子 Co（） 、Pb（） 、Hg（） 、Fe（） 、Mn（） 、Mg（） 、Zn（） 、Al（） 、Ca（） 、Cr（）， 80 l 孔； 加入 10 l 單抗腹水 計算交叉反應率（CR） 3.Cu(II)間接競爭ELISA檢測方法的建立 最佳包被抗原（ Cu(II)-DTPA-O

12、VA ）濃度及抗體工作濃度的確定用不同濃度的 Cu(II)-DTPA-OVA作為包被抗原，加入梯度稀釋的腹水單抗，測定A450 值 。 以抗體稀釋倍數為橫坐標，A450值為縱坐標，繪制曲線，選擇斜率良好 ，A450值在 1. 0 左右的抗原抗體濃度作為反應濃度 。 標準曲線的繪制及最低檢測限的確定a.最佳抗原濃度包被酶標板，b.加入DTPA， 10 l 孔c.加入不同濃度的Cu（）（0、10、50、125、250、500、2 000 和 5 000 ng ml），80 l 孔，混勻d.加入最佳工作濃度的腹水單抗，10 l 孔e.測定 A450值 。Cu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVACu(II)DTPACu(II)DTPACu(II)DTPACu(II)Cu(II)DTPADTPA37孵育 1 h；洗滌 3 次Cu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVAYHRPTMB測定 A450值 4.間接競爭 ELISA 法與 ICP-AES