1、蛋白質組學及其研究方法2009年11月6日湖南農業大學 蛋白質組蛋白質組 澳大利亞學者澳大利亞學者Williams和和Wilkins于于19941994年首先提出年首先提出protein + genome = proteome 一個基因組所表達的全套蛋白質一個基因組所表達的全套蛋白質 一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質蛋白質組是：蛋白質組是： 對應于基因組的所有蛋白質構成的整體，不是局限對應于基因組的所有蛋白質構成的整體，不是局限于一個或幾個蛋白質。于一個或幾個蛋白質。 同一基因組在不同細胞、不同組織中的表達情況各同一基因組在不同細胞、不同組織

2、中的表達情況各不相同不相同 。 在空間和時間上動態變化著的整體。在空間和時間上動態變化著的整體。蛋白質組學蛋白質組學 旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式與功能模式旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式與功能模式 從整體的角度分析、鑒定細胞內動態變化的蛋白質從整體的角度分析、鑒定細胞內動態變化的蛋白質的組成、結構、性質、表達水平與修飾狀態的組成、結構、性質、表達水平與修飾狀態, ,了解了解蛋白質之間、蛋白質與大分子之間的相互作用與蛋白質之間、蛋白質與大分子之間的相互作用與聯系聯系, ,揭示蛋白質的功能與細胞生命活動的規律揭示蛋白質的功能與細胞生命活動的規律 蛋白質組學的研究內容主要有兩個方面：蛋白質

3、組學的研究內容主要有兩個方面： 結構蛋白質組學結構蛋白質組學和和功能蛋白質組學功能蛋白質組學 結構蛋白質組學結構蛋白質組學(Structural proteomics)主要是蛋主要是蛋白質表達模式的研究，包括蛋白質氨基酸序列分白質表達模式的研究，包括蛋白質氨基酸序列分析及空間結構的解析、種類分析及數量確定；析及空間結構的解析、種類分析及數量確定； 功能蛋白質組學功能蛋白質組學(functional proteomics)主要是蛋主要是蛋白質功能模式的研究，白質功能模式的研究， 包括蛋白質的功能及蛋白包括蛋白質的功能及蛋白質間的相互作用。質間的相互作用。蛋白質的各級結構0.50nm0.54nm氫

4、鍵-碳原子側鏈反平行俯視側視 所以，蛋白質組學研究是對不同時間和空間所以，蛋白質組學研究是對不同時間和空間發揮發揮功能的特定蛋白質功能的特定蛋白質群體的研究群體的研究, , 從蛋白質水平上從蛋白質水平上探索蛋白質探索蛋白質作用模式、功能機理、調節控制作用模式、功能機理、調節控制以及以及蛋白質群體內相互作用蛋白質群體內相互作用, , 為臨床診斷、病理研究、為臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開發、新陳代謝途徑研究等提供藥物篩選、新藥開發、新陳代謝途徑研究等提供理論依據和基礎理論依據和基礎. . 從從mRNA mRNA 表達水平并不能預測蛋白表達水平。表達水平并不能預測蛋白表達水平。用基用基因表達

5、連續分析法因表達連續分析法( SAGE) ( SAGE) 研究對數生長期啤酒研究對數生長期啤酒酵母的酵母的80 80 個基因，結果沒有發現翻譯和轉錄豐度個基因，結果沒有發現翻譯和轉錄豐度有明顯相關；對某些基因，相同的有明顯相關；對某些基因，相同的mRNA mRNA 豐度翻譯豐度翻譯成蛋白的量的差異可達成蛋白的量的差異可達50 50 倍；而相等的蛋白量可倍；而相等的蛋白量可由豐度相差由豐度相差40 40 倍的倍的mRNA mRNA 轉錄而來。這說明轉錄轉錄而來。這說明轉錄和翻譯水平對蛋白的含量有幾乎相同的重要性。和翻譯水平對蛋白的含量有幾乎相同的重要性。 蛋白質的動態修飾和加工并非必須來自基因序

6、列。蛋白質的動態修飾和加工并非必須來自基因序列。蛋白質在翻譯后可有多種調節方式，如糖基化、蛋白質在翻譯后可有多種調節方式，如糖基化、磷酸化、異戊二烯化、?；饔玫?。此外，許多磷酸化、異戊二烯化、?；饔玫?。此外，許多蛋白質只有與其它分子結合后才有功能，這種修蛋白質只有與其它分子結合后才有功能，這種修飾是動態的、可逆的。飾是動態的、可逆的。 蛋白質組動態地反映生物系統所處的狀態。蛋白質組動態地反映生物系統所處的狀態。細胞細胞周期的特定時期、分化的不同階段、對應的生長周期的特定時期、分化的不同階段、對應的生長和營養狀況、溫度、應激和病理狀態等其相應的和營養狀況、溫度、應激和病理狀態等其相應的蛋白質

7、組之間存在差異。對其中蛋白質合成、降蛋白質組之間存在差異。對其中蛋白質合成、降解、加工、修飾的調控過程解、加工、修飾的調控過程, ,只有通過蛋白質的直只有通過蛋白質的直接分析才能提示。接分析才能提示。蛋白質組研究的理論基礎DNAmRNA蛋白質轉錄翻譯基因蛋白質細胞特異性基因表達生理狀態溫度應激狀態培養條件藥物作用數量有限結構相對穩定復雜性多變性直接反應生命現象復雜的調控蛋白質組表達模式蛋白質組表達模式（expression profile）： 研究蛋白質組的組成成分研究蛋白質組的組成成分 支 撐 技 術 主 要 有 ：支 撐 技 術 主 要 有 ： 雙 向 凝 膠 電 泳雙 向 凝 膠 電 泳

8、 ( ( 2 D electrophoresis) )、以以質譜質譜( (mass spectrograph) )為為代 表 的 蛋 白 質 鑒 定 技 術代 表 的 蛋 白 質 鑒 定 技 術 , , 以 及以 及 生 物 信 息 學生 物 信 息 學( (Bioinformatics) )分析。分析。Protein sampleImage analysisProtein in gelProtein on membraneProtein in solution2-D PAGEExcisionBlottingElutionPartial degradationPeptide mixtureMa

9、ss of proteinN-terminalsequenceMSEdman degradation Peptide mass fingerprintPeptide sequence MS/MS dataDatabase searchingNovel or previously studied proteinCharacterization of post-translocation modifications蛋蛋 白白 質質 組組 的的 分分 析析 流流 程程（一）蛋白質組研究中的樣品制備 通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質組分進行蛋通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質組分進行蛋白質組分析。白質組

10、分析。 也可以進行樣品預分級，即將細胞或組織中的全也可以進行樣品預分級，即將細胞或組織中的全體蛋白質分成不同部分，分別進行研究。體蛋白質分成不同部分，分別進行研究。 樣品預分級主要作用在于提高低豐度蛋白質的上樣品預分級主要作用在于提高低豐度蛋白質的上樣量和檢測靈敏度。樣量和檢測靈敏度。 樣品預分級的主要方法樣品預分級的主要方法 蛋白質溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白質定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白質細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體蛋白質細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等等三三種種常常用用的的植植物物蛋蛋白白提提取取方

11、方法法（二）蛋白質組研究中的樣品分離 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳( (two-dimensional electrophoresis，2-DE) )，是目前蛋白質組研究中最有效的分析鑒，是目前蛋白質組研究中最有效的分析鑒定技術之一。定技術之一。 由兩相組成：由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳第一相：等電聚焦凝膠電泳 根據蛋白質電荷差異根據蛋白質電荷差異 第二相：第二相：SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據蛋白質分子量差異根據蛋白質分子量差異二維雙向電泳(2D electrophoresis) 基本原理第一向在高壓電場下對蛋白質進行等電聚焦第一向在高壓電場下對蛋白質進行等電聚

12、焦(IEF), 再在第再在第一向垂直方向上進行第二向一向垂直方向上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。IEF-focused proteinsSDS-charged proteins in IPG stripSDS-charged proteinsresolved according to sizes in SDS-PAGE gel2-DE原理示意圖2-DE分析的基本步驟蛋白質溶解變性還原去除蛋白質雜志利用不同pK固定化電解質可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業化軟件設計 第一相電泳：IPGIFE平衡 第二相電泳：SDSPAGE考馬斯亮藍染色、銀染色、銅染

13、色樣品制備IPG膠制備雙相電泳 染色2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresisSDSSDS帶負電荷，破壞蛋白質的氫帶負電荷，破壞蛋白質的氫鍵、疏水鍵，使之形成單個亞基。鍵、疏水鍵，使之形成單個亞基。SDS-SDS-蛋白質復合物為雪茄形的蛋白質復合物為雪茄形的長橢圓棒長橢圓棒，消除或掩蓋了不同種消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異類蛋白質間原有電荷的差異。SDSSDS - -蛋白質復合物在凝膠電泳蛋白質復合物在凝膠電泳中的中的遷移遷移率只是蛋白質分子量的率只是蛋白質分子量的函數有關

14、函數有關。 制膠：制膠： 試劑試劑 分離膠（分離膠（ml） 濃縮膠（濃縮膠（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%單體單體 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸餾水蒸餾水 3.84 6.340.5M Tris-HCl （pH 6.8） 2.5010%過硫酸銨過硫酸銨AP 0.05 0.05四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.01 樣品處理：樣品處理：Loading buffer40%甘油甘油溴酚蘭溴酚蘭SDS-巰基乙醇巰基乙醇0.5M Tris-HCl（pH 6.8）50ul樣品樣品50ul(2)Loading buffer M

15、ix950C/5min 電泳槽電泳槽上電極緩沖液上電極緩沖液下電極緩沖液下電極緩沖液樣品槽樣品槽上樣器上樣器陰極陰極陽極陽極電泳電泳方向方向聚丙烯酰胺凝膠板聚丙烯酰胺凝膠板蛋白質點的染色蛋白質點的染色 凝膠上的蛋白質點染色常用方法有銀染法、考馬凝膠上的蛋白質點染色常用方法有銀染法、考馬斯亮藍染色法斯亮藍染色法, , 另外還采用以下染色試劑另外還采用以下染色試劑: :麗春紅麗春紅S S、氨基黑、印度墨、氨基黑、印度墨、3535S S 硫脲銀、膠態金、咪唑硫脲銀、膠態金、咪唑鋅等鋅等. . 銀染法廣泛用于雙向凝膠電泳分離后蛋白質點的銀染法廣泛用于雙向凝膠電泳分離后蛋白質點的染色染色, , 該法靈敏

16、度為該法靈敏度為4 ng , 4 ng , 但對質譜測定有干擾但對質譜測定有干擾, , 必須先脫銀必須先脫銀. . 考馬斯亮藍染色法可用于膠上或膜上蛋白質點染考馬斯亮藍染色法可用于膠上或膜上蛋白質點染色色, , 該法操作方便、重現性好該法操作方便、重現性好, , 同銀染法一樣同銀染法一樣, , 質譜測定時也必須先脫色質譜測定時也必須先脫色. .2-DE2-DE圖像分析技術圖像分析技術通過通過2-DE2-DE得到的蛋白質分離圖譜，需要經過攝像或得到的蛋白質分離圖譜，需要經過攝像或掃描轉換為以像素為基礎的、具有不同灰度強弱和掃描轉換為以像素為基礎的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。一

17、定邊界方向的斑點電腦信號。2-DE獲得的蛋白質圖譜圖像采集斑點檢測背景消減獲得蛋白質相關信息圖像內及圖像間的比較2-DE2-DE圖像分析軟件包操作過程：圖像分析軟件包操作過程：2-DE2-DE技術的優缺點技術的優缺點 優點：可以同時直觀顯示數千個蛋白質點；優點：可以同時直觀顯示數千個蛋白質點； 缺點：缺點： 極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質，極極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質，極大蛋白質、極小蛋白質以及低豐度蛋白質用此種大蛋白質、極小蛋白質以及低豐度蛋白質用此種技術難于有效分離；技術難于有效分離； 膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜聯用實現膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜聯用實現自動化；自動

18、化； 丙烯酰胺有神經毒作用。丙烯酰胺有神經毒作用。新型非凝膠技術新型非凝膠技術 液相色譜法液相色譜法(liquid chromatography，LC) 毛細管電泳毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE) 液質聯用技術（液質聯用技術（LC-MS/MS） 蛋白質混合物直接通過液相色譜分離以代替蛋白質混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分的分離，然后進入離，然后進入MS系統獲得肽段分子量，再通過串聯系統獲得肽段分子量，再通過串聯MS技技術，得到部分序列信息，最后通過計算機聯網查詢、鑒定術，得到部分序列信息，最后通過計算機聯網查詢、鑒定蛋白質。蛋白質。 多維色譜技

19、術（多維色譜技術（LC/LC-MS/MS） 多維蛋白質鑒定技術多維蛋白質鑒定技術（三）蛋白質組研究中的樣品分析鑒定（三）蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 傳統方法：蛋白質微量測序傳統方法：蛋白質微量測序 氨基酸組成分析氨基酸組成分析 新型蛋白質鑒定技術新型蛋白質鑒定技術 質譜（質譜（MSMS）法）法 基本原理基本原理：樣品分子離子化后，根據離子間質荷比：樣品分子離子化后，根據離子間質荷比（m/zm/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。）的差異來分離并確定樣品的分子量。 主要質譜類型主要質譜類型 基質輔助激光解吸基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（電離飛行時間質譜（matrix-assisted l

20、aser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 電噴霧質譜（電噴霧質譜（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 質譜分析目前是經質譜分析目前是經2D -PAGE 分離的蛋白質鑒定分離的蛋白質鑒定的核心技術的核心技術（四）蛋白質組學研究的生物信息學（四）蛋白質組學研究的生物信息學 2D - PAGE分離的蛋白質經過識別與鑒定后，用分離的蛋白質經過識別與鑒定后，用圖像掃描儀數字化圖像掃描儀數字化2D - PAGE 膠上分離的蛋白質膠上分離

21、的蛋白質，在蛋白圖形工作站上，應用軟件，對數字化的，在蛋白圖形工作站上，應用軟件，對數字化的蛋白點的分布部位，斑點面積和灰階、背景過濾蛋白點的分布部位，斑點面積和灰階、背景過濾、2 - DE 匹配與比較，建立參考圖譜；匹配與比較，建立參考圖譜； 對蛋白質鑒定的數據庫的搜索是蛋白質組信息學對蛋白質鑒定的數據庫的搜索是蛋白質組信息學的一大特點；的一大特點； 當用當用2D - PAGE 分離一個蛋白質組后分離一個蛋白質組后,應用質譜技應用質譜技術測定能夠刻劃蛋白質屬性的各種屬性參數術測定能夠刻劃蛋白質屬性的各種屬性參數(attribute parameter) ,同時把已有數據庫同時把已有數據庫(如如OWL 或或dbEST) 中的每一個序列轉換成相應屬性參數中的每一個序列轉換成相應屬性參數,形成屬性化的數據庫。然后以此屬性參數形成屬性化的數據庫。然后以此屬性參數,形成屬形成屬性化的蛋白質或核酸數據庫。若搜索不到性化的蛋白質或核酸數據庫。若搜索不到,那可能那可能是新的蛋白質是新的蛋白質,就須采用傳統的生化鑒定。就須采用傳統的生化鑒定。蛋白質數據庫蛋白質數據庫 （一）蛋白質序列數據庫（一）蛋白質序列數據庫 （二）蛋白質結構數據庫（二）蛋白質結構數據庫 （三）蛋白質直系同源簇數據庫（三）蛋白質直系同源簇數據庫 （四）（四