1、    1株鏈格孢屬真菌生物堿類代謝產(chǎn)物的研究    苗智+馬養(yǎng)民+孔陽+閆夢茹+王健摘要： 為進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃的內(nèi)生真菌，對1株分離自夾竹桃莖部鏈格孢屬內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。利用硅膠柱色譜、sephadex lh-20柱色譜等方法對該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，得到5個生物堿類化合物。對所得化合物的理化性質(zhì)和 1h-nmr、13c-nmr數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定這5個化合物的結(jié)構(gòu)。采用最小抑菌濃度法和dpph自由基法對所得化合物進(jìn)行抑菌活性和抗氧化活性測試。結(jié)果表明，這5個化合物分別為次黃嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺

2、嘧啶脫氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）。其中，化合物1、3、4、5 為首次從鏈格孢屬真菌的發(fā)酵物中分離得到。化合物3（尿囊素）具有一定的抑菌活性和抗氧化活性，化合物2（腺嘌呤）具有一定的抗氧化活性。夾竹桃鏈格孢屬內(nèi)生真菌具有一定的開發(fā)和利用價值。關(guān)鍵詞： 夾竹桃；鏈格孢屬；內(nèi)生真菌；重結(jié)晶；生物堿類；抑菌活性；抗氧化活性： s182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a：1002-1302（2017）22-0314-03生物堿類化合物是指生物體內(nèi)一類除了氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)和維生素b以外含氮原子的有機(jī)化合物的總稱1。自19世紀(jì)初期出現(xiàn)關(guān)于生物堿的報道，至今已有200多年的歷史。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1萬多種生物堿類化合物，它們具

3、有抗菌2-3、抗氧化4、抗腫瘤5-6等生物活性。內(nèi)生真菌是指全部階段或一定階段生活在健康植物組織內(nèi)，對植物組織沒有造成明顯病害的真菌7，它們能夠產(chǎn)生生物堿類、黃酮類、萜類、甾體類、醌類、苯丙素類、肽類等多種類別的次生代謝產(chǎn)物，具有多種多樣的生物活性8，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)中具有重大的應(yīng)用價值。因此，研究植物內(nèi)生真菌的活性成分具有十分重要的意義。夾竹桃（nerium indicum）是夾竹桃科夾竹桃屬植物9，是強(qiáng)心類中藥，主要有強(qiáng)心利尿、鎮(zhèn)痛、祛痰定喘、祛瘀等功效10。 目前，國內(nèi)外對夾竹桃的研究多集中于其植株的化學(xué)成分，對其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的報道甚少。筆者所在課題組從夾竹桃植物中分離得到35株內(nèi)

4、生真菌，并對1株分離自莖部的內(nèi)生真菌j14菌株進(jìn)行研究，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個化合物，其中含有3個生物堿類化合物，分別為胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤11。因此，本試驗繼續(xù)對該菌株的生物堿類代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以豐富國內(nèi)外對夾竹桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究，為進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃內(nèi)生真菌奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗菌株內(nèi)生真菌j14菌株，分離自秦嶺地區(qū)夾竹桃的莖部，經(jīng)鑒定為鏈格孢屬真菌，4 條件下保存于筆者所在實(shí)驗室。1.2 試驗儀器和試劑sw-cj-1fd 超凈工作臺，購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；yx280b 手提式壓力蒸汽滅菌鍋，購自上海三申醫(yī)療器械有限公司；dh5000b 電熱

5、恒溫培養(yǎng)箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司；hzq-q 全溫數(shù)顯振蕩器，購自江蘇省金壇市瑞華儀器廠；bs224s 電子天平，購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；re52cs-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；bruker avance -400 hz 超導(dǎo)核磁共振儀，購自布魯克（北京）科技有限公司；xt-5 顯微熔點(diǎn)測定儀，購自北京市科儀電光儀器廠；柱色譜硅膠200 300目，購自青島海洋化工廠分廠；柱色譜凝膠sephadex lh-20，購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；薄層色譜硅膠g，購自青島海浪硅膠干燥劑廠；試驗所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.3 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：20

6、 g葡萄糖、1 000 ml 20%馬鈴薯浸汁，ph值自然；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g nacl、1 000 ml h2o，ph值自然；大米培養(yǎng)基：75 g大米+無糖察氏液體培養(yǎng)基（0.3 g nano3、0.1 g k2hpo4、0.05 g kcl、0.05 g mgso4·7h2o、0.001 g feso4、1 00 ml h2o，ph值自然）。1.4 測試菌細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）、乳酸鏈球菌（streptococcus lactis）、大腸桿菌（escherichia coli）、綠膿桿菌（pse

7、udomonas aeruginosa）；植物病原菌真菌：小麥赤霉病病菌（fusarium graminearum）、番茄灰霉病病菌（botrytis cinerea）、煙草赤星病病菌（alternaria alternata）、白菜黑斑病病菌（alternaria brassicae）、辣椒疫霉病病菌（phytophthora capsic）、蘋果樹腐爛病病菌（valsa mali）、葡萄炭疽病病菌（colletotrichum gloeosporioides）、芍藥炭疽病病菌（peony anthracnose）、玉米大斑病病菌（setosphaeria turcica）、油菜菌核病病菌（

8、sclerotinia sclerotiorum）；均保存于 4 備用。1.5 菌株發(fā)酵和代謝產(chǎn)物的提取分離試驗菌株經(jīng)過活化后，采用大米培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵，于28 靜置培養(yǎng)30 d。將發(fā)酵物陰干粉碎后分別用乙酸乙酯、甲醇溶液提取，提取液經(jīng)減壓濃縮后得到460 g浸膏。采用硅膠柱色譜對浸膏進(jìn)行分離，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個組分。組分2（96.93 g）經(jīng)過多次硅膠柱色譜、sephadex lh-20柱色譜分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，依次得到30 mg化合物1、63 mg化合物2。組分3（133.83 g）經(jīng)過多次硅膠柱色譜、sephadex lh-20柱色譜分離，再經(jīng)過重

9、結(jié)晶純化，依次得到53 mg化合物3、136 mg化合物4、161 mg化合物5。endprint1.6 代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定對所得化合物的形狀、顏色等理化性質(zhì)進(jìn)行觀察，并測量其熔點(diǎn)，再采用核磁共振（1h-nmr、13c-nmr等）對所得化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，最后與相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行對照，確定所得化合物的結(jié)構(gòu)。1.7 抑菌活性測試對所得化合物進(jìn)行抑菌活性測試，它們對微生物生長的抑制作用可通過最小抑菌濃度來判斷，具體操作12如下：（1）將斜面培養(yǎng)基上已活化的測試菌用無菌水沖洗下來，再用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（細(xì)菌）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（真菌）將其配制成濃度為106 cfu/ml的菌懸液；（2）用

10、二甲基亞砜將待測化合物溶解，使其濃度為 1 mg/ml；（3）在96孔板的第1孔至第12孔中均加入100 l液體培養(yǎng)基，再向第1孔中加入100 l待測化合物溶液，利用二倍稀釋法連續(xù)稀釋至第10孔，第11、第12孔分別留作液體培養(yǎng)基和二甲基亞砜的空白對照；（4）向上述96孔板中的每個孔中均加入 100 l 測試菌菌懸液。重復(fù)上述試驗操作，每組進(jìn)行3次平行試驗。以青霉素鈉作為革蘭氏陽性菌的陽性對照，硫酸鏈霉素作為革蘭氏陰性菌的陽性對照，多菌靈作為植物病原真菌的陽性對照。將細(xì)菌試驗組的96孔板在37 下恒溫培養(yǎng)24 h、植物病原真菌試驗組的96孔板在28 下恒溫培養(yǎng) 48 h 后觀察并記錄試驗結(jié)果。

11、1.8 抗氧化活性測試對所得化合物進(jìn)行清除dpph自由基的抗氧化活性測試，具體操作13如下：（1）將待測化合物溶解于甲醇溶液中，使其濃度為2 mg/ml；（2）在酶標(biāo)板的第1、第2排的每個孔中均加入100 l甲醇溶液，再向每排的第1孔中均加入 100 l 待測化合物溶液，利用二倍稀釋法連續(xù)稀釋至第11孔，第12孔留作甲醇的空白對照；（3）向第1排的每個孔中均加入100 l新配制的含0.2 mg/ml dpph·的甲醇溶液，向第2排的每個孔中均加入100 l甲醇。選用維生素c作為陽性對照，進(jìn)行3次平行試驗。將上述酶標(biāo)板于室溫下遮光放置30 min后，在波長為517 nm的酶標(biāo)儀中測定每

12、個孔的吸光度。抗氧化性能可以根據(jù)待測化合物對dpph自由基的清除率來判斷，其計算公式如下：式中：e為dpph自由基清除率；d0為dpph·溶液和甲醇溶液（第1排第12孔）的吸光度；d1為待測化合物溶液、dpph·溶液和甲醇溶液（第1排前11個孔）的吸光度；d2為待測化合物溶液和甲醇溶液（第2排前11個孔）的吸光度。根據(jù)公式（1）計算出不同濃度下化合物的自由基清除率。以化合物濃度為橫坐標(biāo)（x），自由基清除率為縱坐標(biāo)（y），繪制自由基清除率曲線圖，并對其進(jìn)行線性擬合。按照擬合方程計算出當(dāng)y=50時x的值，此時x的值就是化合物的半抑制濃度ic50。2 結(jié)果與分析2.1 代謝產(chǎn)物的

13、結(jié)構(gòu)鑒定從試驗菌株的發(fā)酵物中分離得到5個生物堿類化合物，分別為次黃嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脫氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。化合物1，米黃色粉末，熔點(diǎn)> 350 。1h-nmr（400 mhz，氘代二甲亞砜）：13.36單峰（s），1h，7-h，12.25（s，1h，1-h），8.13（s，1h，2-h），7.99（s，1h，8-h）。13c-nmr（100 mhz，氘代二甲亞砜）：155.34（6-c），153.15（4-c），144.65（2-c），140.16（8-c），119.07（5-c）。化合物 1 的核磁共振試驗數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)14報

14、道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物1為次黃嘌呤（hypoxanthine）。化合物2，米黃色粉末，熔點(diǎn)> 350 。1h-nmr（400 mhz，氘代二甲亞砜）：12.84（s，1h，7-h），8.11（s，1h，2-h），8.10（s，1h，8-h），7.09（s，1h，6-nh2）。13c-nmr（100 mhz，氘代二甲亞砜）：155.14（6-c），152.39（2-c），150.91（4-c），139.53（8-c），117.35（5-c）。化合物 2 的核磁共振試驗數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)15報道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物2為腺嘌呤（adenine）。化合物3，淡黃色粉末，熔點(diǎn)23924

15、0 。1h-nmr（400 mhz，氘代二甲亞砜）：10.55（s，1h，1-h），8.07（s，1h，3-h），6.90d，耦合常數(shù)（j） = 8.2 hz，1h，6-h，581（s，2h，8-h），5.25雙二重峰（dd），j=8.2，1.0 hz，1h，4-h。13c-nmr（100 mhz，氘代二甲亞砜）：173.57（5-c），15730（7-c），156.72（2-c），62.36（4-c）。化合物 3 的核磁共振試驗數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)16報道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物3為尿囊素（allantoin）。化合物4，白色粉末，熔點(diǎn)為185 187 。 1h-nmr（400 mhz，氘代二甲

16、亞砜）：11.28（s，1h，3-h），7.71雙峰（d），j=1.0 hz，1h，6-h，6.17三重峰（t），j=6.9 hz，1h，1-h，5.26（d），j=4.1 hz，1h，3-oh），5.06（t，j=5.1 hz，1h，5-oh），4.25多重峰（m），1h，3-h，3.76（dd，j=6.6，3.6 hz，1h，4-h），3.57（m，2h，5-h），2.07（m，2h，2-h），1.77（s，3h，5-ch3）。13c-nmr（100 mhz，氘代二甲亞砜）：163.72（4-c），150.43（2-c），136.10（6-c），109.32（5-c），8721（1-c），

17、83.69（4-c），7039（3-c），61.28（5-c），39.36（2-c），12.22（5-ch3）。化合物 4 的核磁共振試驗數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)17報道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物4為胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine）。endprint化合物5，白色粉末，熔點(diǎn)為164 165 。1h-nmr（400 mhz，氘代二甲亞砜）：11.32（s，1h，3-h），7.89（d，j=8.1 hz，1h，6-h），5.78（d，j=5.4 hz，1h，1-h），565（d，j=8.2 hz，1h，5-h），5.40（d，j=4.6 hz，1h，2-oh），5.12（s，2h，3，5-oh），4.

18、02（d，j=4.5 hz，1h，2-h），397（d，j=4.6 hz，1h，3-h），3.84（dd，j=6.7，3.2 hz，1h，4-h），3.59（m，2h，5-h）。13c-nmr（100 mhz，氘代二甲亞砜）：163.10（4-c），150.72（2-c），140.70（6-c），101.71（5-c），87.62（1-c），84.79（4-c），73.50（3-c），69.84（2-c），60.80（5-c）。化合物 5 的核磁共振試驗數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)18報道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物5為尿嘧啶核苷（uridine）。2.2 抑菌活性的測試結(jié)果以4株細(xì)菌和10株植物病原真菌作為

19、測試菌，分別選用青霉素鈉、硫酸鏈霉素、多菌靈作為陽性對照，對所得化合物進(jìn)行抑菌活性測試。由表1可知，化合物 3（尿囊素）對這4株細(xì)菌和10株植物病原真菌均有一定的抑制作用；化合物 1（次黃嘌呤）、化合物 2（腺嘌呤）分別對辣椒疫霉病病菌、煙草赤星病病菌具有一定的選擇性抑制作用。2.3 抗氧化活性測試結(jié)果對所得化合物進(jìn)行清除dpph自由基的抗氧化活性測試，其擬合方程和ic50值如表2所示，與對照維生素c的測試結(jié)果相比，化合物1化合物5均沒有較強(qiáng)的抗 氧化活性，但化合物 2（腺嘌呤）和化合物 3（尿囊素）具有一定的抗氧化活性。3 結(jié)論與展望對1株分離自夾竹桃莖部的鏈格孢屬內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究

20、，從中分離得到5個生物堿類化合物，分別為次黃嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脫氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）。其中，化合物1、3、4、5 為首次從鏈格孢屬真菌的發(fā)酵物中分離得到。化合物3（尿囊素）具有一定的抑菌活性和抗氧化活性，化合物2（腺嘌呤）具有一定的抗氧化活性。因此，該菌株具有一定的開發(fā)利用價值。因此，可以對分離自夾竹桃植物中的其他內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以豐富國內(nèi)外對夾竹桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究報道，從而進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃內(nèi)生真菌。參考文獻(xiàn)：1 李 楊，左國營. 生物堿類化合物抗菌活性研究進(jìn)展j. 中草藥，2010，41（6）：1006-1014.2pinhei

21、ro e a，carvalho j m，dos santos d c，et al. antibacterial activity of alkaloids produced by endophytic fungus aspergillus sp. ejc08 isolated from medical plant bauhinia guianensisj. natural product research，2013，27（18）：1633-1638.3邵志宇，馮永紅，鄧云霞，等. 互花米草內(nèi)生真菌fusarium sp. f4中的活性代謝物j. 中國天然藥物，2007，5（2）：108-111

22、.4王 巍，陳 超，楊 君，等. 植物內(nèi)生真菌代謝物吲哚生物堿neoechinulin aj. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（1）：48-50.5ding l，dahse h m，hertweck c. cytotoxic alkaloids from fusarium incarnatum associated with the mangrove tree aaegiceras corniculatumj. journal of natural products，2012，75（4）：617-621.6li x，tian y，yang s x，et al. cytotoxic azaphilone alkaloids from chaetomium globosum ty1j. bioorganic & medicinal chemist