1、基因組改造新技術(shù)CRISPRCas系統(tǒng) 有一種細(xì)菌編碼的酶能夠利用向?qū)NA（guide RNA）分子對特定的DNA片段進(jìn)行定向切割，科學(xué)家們利用這種特點(diǎn)開發(fā)出了一種能夠?qū)蚪M進(jìn)行特異性定點(diǎn)改造的工具，對細(xì)胞乃至整個生物體進(jìn)行基因組改造。目前已經(jīng)利用這種技術(shù)對細(xì)菌、人體細(xì)胞以及斑馬魚進(jìn)行過成功的遺傳學(xué)改造工作。日本大阪大學(xué)（Osaka University）的科研人員們曾經(jīng)在1987年發(fā)表過一篇論文，不過這篇論文在當(dāng)時并沒有引起太多人的注意，只不過是一篇普普通通的小文章。這幫大阪大學(xué)的科學(xué)家當(dāng)時正在對一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究，不過他們在

2、工作中發(fā)現(xiàn)，在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。關(guān)于這樣一個重復(fù)序列他們當(dāng)時在論文中是這樣評價的“我們目前也不太清楚這些序列的生物學(xué)意義。”不過這個在差不多三十年之前取得的不起眼的“小發(fā)現(xiàn)”在今天卻綻放出了耀眼的光芒，因?yàn)槿缃窨茖W(xué)家們正是利用這個小片段找到了一種可以對多種生物的基因組進(jìn)行遺傳改造的工具，而且這種方法操作起來還非常地簡單。就在短短的一個月之內(nèi)，在包括科學(xué)（Science）和自然 生物技術(shù)（Nature Biotechnology）等雜志上就已經(jīng)發(fā)表了5篇相關(guān)的論文介紹這個現(xiàn)在被稱作

3、CRISPRCas系統(tǒng)（CRISPRCas systems）、簡便而又實(shí)用的基因組改造新技術(shù)。近幾十年來，隨著全基因組測序技術(shù)的不斷成熟，我們在各種細(xì)菌和古細(xì)菌（archaea）中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，這就是二十多年前日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的那個序列）和CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。研究發(fā)現(xiàn)，這些CRISPR序列與很多病毒或者質(zhì)粒的DNA序列是互補(bǔ)的，說明這套C

4、RISPRCas系統(tǒng)很有可能是生物體抵御病毒等外來入侵者的一套特異性防御機(jī)制，就好像是另外一套適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)（adaptive immune system）。后續(xù)的遺傳學(xué)試驗(yàn)和生物化學(xué)試驗(yàn)也證實(shí)了這種猜測。雖然有很多CRISPRCas系統(tǒng)需要多種蛋白的參與，但是在很多細(xì)菌的胞內(nèi)都只需要一種內(nèi)切酶（endonuclease）Cas9就足夠了，我們將這種CRISPRCas系統(tǒng)也稱作2型系統(tǒng)（type II systems），如圖1所示。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA的指引下能夠?qū)Ω鞣N入侵的外源DNA分子進(jìn)行定點(diǎn)切割，不過主要識別的還是保守的間隔相鄰基序（proto-spacer adjacent

5、motifs，PAM基序）。如果要形成一個有功能的DNA切割復(fù)合體，還需要另外兩個RNA分子的幫助，它們就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。不過最近有研究發(fā)現(xiàn)，這兩種RNA可以被“改裝”成一個向?qū)NA（single-guide RNA, sgRNA）。這個sgRNA足以幫助Cas9內(nèi)切酶對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。最新的報道稱，在多種類型的細(xì)胞和生物體內(nèi)，這種RNA介導(dǎo)的Cas9酶切作用能夠正常地行使功能，在完整基因組上的特定位點(diǎn)完成切割反應(yīng)。這樣就可以方便地進(jìn)行后續(xù)的基因組改造工作了。細(xì)胞

6、通常會通過兩種方式對發(fā)生雙鏈斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，這兩種方式分別是同源重組修復(fù)機(jī)制（homologous recombination, HR）和非同源末端連接修復(fù)機(jī)制（non-homologous end joining, NHEJ），不過在修復(fù)的過程中細(xì)胞有可能會對修復(fù)位點(diǎn)進(jìn)行修飾，或者插入新的遺傳信息。圖1 RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)定向基因組修飾作用機(jī)制示意圖。Cas9內(nèi)切酶是一種DNA內(nèi)切酶，很多細(xì)菌都可以表達(dá)這種蛋白，Cas9內(nèi)切酶能夠?yàn)榧?xì)菌提供一種防御機(jī)制，避免病毒或者質(zhì)粒等外源DNA的侵入。Cas9內(nèi)切酶必須在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對DNA進(jìn)行切割，這是因?yàn)檫@些向?qū)NA分子含有與

7、靶DNA序列互補(bǔ)的序列，我們稱之為PAM序列。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對特定位點(diǎn)的DNA進(jìn)行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細(xì)胞會借助同源重組機(jī)制（homologous recombination）或者非同源末端連接機(jī)制（non-homologous end joining）對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。如果細(xì)胞通過同源重組機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，會用另外一段DNA片段填補(bǔ)斷裂的DNA缺口，因而會引入一段“新的”遺傳信息。最近有多項(xiàng)研究都表明，RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)可以被用于對人類和小鼠細(xì)胞，以及細(xì)菌或斑馬魚胚胎進(jìn)行基因組改造的工作當(dāng)中。Cong、Mali和Cho這三個課題組開展的多項(xiàng)研究都表明

8、這種RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)在人類細(xì)胞當(dāng)中同樣能夠正常的發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，對化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）編碼的Cas9內(nèi)切酶進(jìn)行改造之后也可以讓它們在人類細(xì)胞的細(xì)胞核中被活化，然后再搭配針對人體DNA序列設(shè)計的大約20bp長的雙RNA復(fù)合體或者sgRNA，就可以對人體基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割和改造。科研人員們在多種人體細(xì)胞（其中還包括了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）內(nèi)共表達(dá)了這種專用于人體的Cas9內(nèi)切酶和向?qū)NA，結(jié)果都在預(yù)定的DNA位點(diǎn)觀察到了基因組雙鏈DNA切割，以及后續(xù)的修復(fù)現(xiàn)象，成功率高達(dá)38%，而且還發(fā)現(xiàn)這種Cas9內(nèi)切酶對細(xì)胞幾乎沒有毒性。這套Cas9系統(tǒng)還能夠在

9、人體細(xì)胞內(nèi)以非常高的效率對普通的基因組位點(diǎn)進(jìn)行定向基因替換（targeted gene replacement）的操作。在Jinek等人于同期發(fā)表的另外一篇論文中，他們發(fā)現(xiàn)這套RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)還能夠在人體細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)位點(diǎn)特異性的基因組修飾動作（site-specific genome modifications），而且他們還發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合、組裝的動作是這套位點(diǎn)特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。之前的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞更傾向于使用同源重組機(jī)制對單鏈DNA損傷（single-stranded DNA breaks）進(jìn)行修復(fù)，因此引入的突變也會更少，Mali和Cong等人也對各

10、種不同的、只能夠形成單鏈DNA斷裂的Cas9內(nèi)切酶進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些突變的Cas9內(nèi)切酶在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)NHEJ修復(fù)的機(jī)率的確更低，但是它們在引發(fā)基因替換（這主要是借助同源重組修復(fù)機(jī)制）的效率方面與野生型的Cas9內(nèi)切酶不相上下。Mali和Cong這兩個課題組還發(fā)現(xiàn)這套Cas9系統(tǒng)具有多重靶向功能（multiplexed targeting），這些Cas9內(nèi)切酶能夠與基因組中兩個不同的序列（位點(diǎn)）結(jié)合，形成多處斷裂。此外，Cong等人還發(fā)現(xiàn)如果分別表達(dá)tracrRNA和crRNA，還可以進(jìn)一步提高切割的效率。這一發(fā)現(xiàn)表明，如果進(jìn)一步改進(jìn)sgRNA的設(shè)計方案，使其更接近雙RNA復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，將

11、會進(jìn)一步提高Cas9系統(tǒng)的基因組編輯效率。除了這些細(xì)胞學(xué)的研究成果之外，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)這套Cas9系統(tǒng)對于生物體同樣有效，一樣可以對生物體進(jìn)行基因組改造的操作。Jiang等人發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)多種向?qū)NA之后，Cas9內(nèi)切酶可以對細(xì)菌基因組的多個位點(diǎn)進(jìn)行修飾操作。借助這一技術(shù)可以對各種微生物進(jìn)行遺傳學(xué)改造，打造出符合我們?nèi)祟愋枰墓こ涛⑸铮蛊湓旄Ｈ祟悾谏锬茉椿蛘呱镏扑幍戎T多領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。Hwang等人則使用單細(xì)胞斑馬魚胚胎（one-cell-stage embryos）進(jìn)行了試驗(yàn)，他們將編碼Cas9蛋白的mRNA和特定的向?qū)NA（與斑馬魚基因組DNA的匹配機(jī)率高達(dá)245

12、9%）注射到斑馬魚胚胎內(nèi)，結(jié)果取得了成功，在所有被注射的斑馬魚胚胎內(nèi)，10個切割位點(diǎn)中有8個位點(diǎn)都發(fā)生了切割，并且引入了插入或者缺失突變。這一試驗(yàn)結(jié)果表明，RNA介導(dǎo)的Cas9切割活性完全可以應(yīng)用于生物體水平，哺乳動物和植物都可以使用這種技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)改造。目前最有價值的應(yīng)用應(yīng)該就是使用這種技術(shù)為各種人類疾病構(gòu)建出動物模型。這種基因組改造技術(shù)還可以被應(yīng)用于合成生物學(xué)（synthetic biology）、基因定向干擾或者多重基因干擾（即基因網(wǎng)絡(luò)干擾）和基因治療等領(lǐng)域。接下來的研究難點(diǎn)應(yīng)該就是如何克服脫靶效應(yīng)（off-target effect），如何提高基因組改造的效率和特異性，以及如何將這項(xiàng)

13、技術(shù)應(yīng)用于更多的物種等方面。所以我們也需要對這種Cas9平臺與其它的基因組改造技術(shù)，比如巨核酶技術(shù)（meganucleases）、鋅指核酶技術(shù)（zinc-finger nucleases）以及TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技術(shù)等進(jìn)行深入和全面的對比。除了在基因組改造方面的應(yīng)用之外，使用Cas9平臺還可以進(jìn)行基因沉默等方面的操作（比如使Cas9蛋白失活），或者賦予Cas9蛋白更多新的功能（比如使其具有轉(zhuǎn)錄因子樣的轉(zhuǎn)錄活性等）。其實(shí)除了這種Cas9系統(tǒng)之外，細(xì)菌還為我們貢獻(xiàn)了很多其它的工具，比如限制性內(nèi)切酶（restric

14、tion enzymes）、熱穩(wěn)定的聚合酶（thermostable polymerase）等，極大促進(jìn)了分子生物學(xué)的發(fā)展。下面，讓我們一起期待Cas9技術(shù)在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)等諸多生物學(xué)領(lǐng)域里創(chuàng)造出更多的奇跡吧。作為一種 RNA 導(dǎo)向的 dsDNA 結(jié)合蛋白，Cas9 效應(yīng)物核酸酶是已知的第一個統(tǒng)一因子（unifying factor），能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表達(dá)適當(dāng)?shù)?sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可連接到目標(biāo)DNA，不影響 Cas9 的結(jié)合。

15、因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列處帶來任何融合蛋白及 RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。1 CRISPR/Cas (CRISPR associated) systems： CRISPR/Cas系統(tǒng)（CRISPR相關(guān)系統(tǒng)）， CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat）即成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是基因組中一個含有多個短重復(fù)序列的位點(diǎn)，這種位點(diǎn)在細(xì)菌和古細(xì)菌（archaea）胞內(nèi)起到了一種獲得性免疫（acquired immunity）的作用。CRISPR系統(tǒng)主要依賴crRNA和tr

16、acrRNA來對外源DNA進(jìn)行序列特異性降解。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中在2型系統(tǒng)（type II systems）中依賴的是Cas9蛋白。在RNA的介導(dǎo)下，Cas9蛋白能夠?qū)rRNAtracrRNA識別的靶序列進(jìn)行切割。 crRNA：CRISPR RNA能夠與tracrRNA配對，形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，這種雙鏈RNA分子能夠介導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶對與雙鏈RNA分子互補(bǔ)結(jié)合的DNA序列進(jìn)行切割。 此系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRN

17、A/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過人工設(shè)計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引導(dǎo) Cas9 對 DNA 的定點(diǎn)切割。基因敲除動物模型一直以來是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標(biāo)的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術(shù)的要求很高，而且費(fèi)用大，耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術(shù)比較成熟的實(shí)驗(yàn)室，利用傳統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以

18、上。2 2013 年 1 月份，美國兩個實(shí)驗(yàn)室在Science雜志發(fā)表了基于 CRISPR-Cas9 技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，該技術(shù)與以往的技術(shù)不同，是利用靶點(diǎn)特異性的 RNA 將 Cas9 核酸酶帶到基因組上的具體靶點(diǎn)，從而對特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割導(dǎo)致突變。該技術(shù)迅速被運(yùn)用到基因敲除小鼠和大鼠動物模型的構(gòu)建之中。通過一系列研究，首先證明了通過 RNA 注射的方式將 CRISPR-Cas 系統(tǒng)導(dǎo)入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中產(chǎn)生定點(diǎn)突變。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)現(xiàn)了該方法沒有小鼠遺傳品系的限制，能夠?qū)Υ笃蔚幕蚪M DNA 進(jìn)行刪除，也可以通過同時注射針對不同基因的 RNA 序列達(dá)到在同一只小鼠或大鼠中產(chǎn)生多個基因突變的效果。此外，還證明了利用 CRISPR-Cas 技術(shù)構(gòu)建的基因敲除大鼠模型與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的同一基因（肥胖相關(guān) G 蛋白偶聯(lián)受體 Mc4R）突變大鼠相比具有一致的表型。該方法構(gòu)建的基因突變動物具有顯著高于傳統(tǒng)方法的生殖系轉(zhuǎn)移能力，是一種可靠、高效、快速的構(gòu)建敲除動物模型的新方法。2 CRISPR-Cas 技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細(xì)胞打