1、食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)introduction l產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium perfringens)又稱魏又稱魏氏梭菌氏梭菌(cwelchii)，為厭氧芽孢桿菌屬成員。，為厭氧芽孢桿菌屬成員。廣泛存在于自然界的水源、土壤及人和動(dòng)物腸廣泛存在于自然界的水源、土壤及人和動(dòng)物腸道之中。道之中。l條件致病菌，主要引起人的食物中毒、氣性壞條件致病菌，主要引起人的食物中毒、氣性壞疽和動(dòng)物猝死癥等疾病。毒性作用較肉毒梭菌疽和動(dòng)物猝死癥等疾病。毒性作用較肉毒梭菌和破傷風(fēng)梭菌要弱，和破傷風(fēng)梭菌要弱， 但產(chǎn)生毒素種類繁多。但產(chǎn)生毒素種類繁多

2、。contentsl產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)性狀生物學(xué)性狀l產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性致病性l產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行病學(xué)流行病學(xué)l產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)檢驗(yàn)l產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測(cè)方法快速檢測(cè)方法l產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染及控制污染及控制1.形態(tài)與染色形態(tài)與染色l革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，專性厭氧。革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，專性厭氧。l無(wú)鞭毛，體內(nèi)有明顯莢膜。無(wú)鞭毛，體內(nèi)有明顯莢膜。l芽孢橢圓形，不大于菌體，位于次極端。芽孢橢圓形，不大于菌體，位于次極端。l單獨(dú)或成雙排列，有時(shí)也呈短鏈排列。單獨(dú)或成雙排列，有時(shí)也呈短鏈排列。一、產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物

3、學(xué)性狀一、產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)性狀產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)電鏡下的產(chǎn)氣莢膜梭菌（電鏡下的產(chǎn)氣莢膜梭菌（c.perfringens）產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)性狀產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)性狀2.培養(yǎng)特性培養(yǎng)特性l生長(zhǎng)活躍，代謝迅速。生長(zhǎng)活躍，代謝迅速。l血瓊脂平板：雙層溶血環(huán)（靶形溶血）血瓊脂平板：雙層溶血環(huán)（靶形溶血） 內(nèi)環(huán)完全溶血內(nèi)環(huán)完全溶血 外環(huán)不完全溶血外環(huán)不完全溶血l含鐵牛奶培養(yǎng)基：含鐵牛奶培養(yǎng)基： “洶涌發(fā)酵洶涌發(fā)酵” （stormy fermentation）皰肉培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣莢膜梭菌皰肉培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣莢膜梭菌血瓊脂平板上的菌落形態(tài)血瓊脂平板上的菌落形態(tài)含鐵牛

4、奶中的產(chǎn)氣莢膜梭菌含鐵牛奶中的產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)性狀產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)性狀3.生化特性生化特性l能發(fā)酵多種糖類，如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和能發(fā)酵多種糖類，如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；l不發(fā)酵甘露糖或水楊酸。不發(fā)酵甘露糖或水楊酸。l能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，不能消化已凝固的能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，不能消化已凝固的蛋白質(zhì)和血清。蛋白質(zhì)和血清。返回二、產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性二、產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性l多種外毒素、腸毒素；多種外毒素、腸毒素；l侵襲性酶：卵磷脂酶、纖維蛋白酶、透明質(zhì)侵襲性酶：卵磷脂酶、纖維蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和膠原酶等。酸酶和膠原酶等。 l分成分成a、

5、b、c、d、e5個(gè)毒素型。個(gè)毒素型。la型主要引起氣性壞疽和食物中毒。型主要引起氣性壞疽和食物中毒。c型則型則引起壞死性腸炎。引起壞死性腸炎。 所致疾病所致疾病1.氣性壞疽氣性壞疽l致病條件與破傷風(fēng)梭菌相同致病條件與破傷風(fēng)梭菌相同l潛伏期短，發(fā)病迅速，病情險(xiǎn)惡，死亡率高。潛伏期短，發(fā)病迅速，病情險(xiǎn)惡，死亡率高。以組織壞死、氣腫和全身中毒為特征。以組織壞死、氣腫和全身中毒為特征。2.食物中毒食物中毒l食入被大量細(xì)菌污染的食物（肉類）食入被大量細(xì)菌污染的食物（肉類）l臨床表現(xiàn)：劇烈腹絞痛、腹瀉；可自愈臨床表現(xiàn)：劇烈腹絞痛、腹瀉；可自愈3.壞死性腸炎壞死性腸炎返回三、產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行病學(xué)三、產(chǎn)氣莢

6、膜梭菌的流行病學(xué)l在世界各地出現(xiàn)，但血清型分布不同。在世界各地出現(xiàn)，但血清型分布不同。l可以引起地區(qū)性流行，也有散發(fā)性報(bào)道。可以引起地區(qū)性流行，也有散發(fā)性報(bào)道。l中毒最常發(fā)生于兒童和老人。中毒最常發(fā)生于兒童和老人。l多發(fā)生在夏、秋季。多發(fā)生在夏、秋季。 返回四、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)四、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)l設(shè)備和材料設(shè)備和材料冰箱：冰箱：0 -4。恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱：36士士1恒溫水浴鍋：恒溫水浴鍋：46士士1顯微鏡：顯微鏡：10100 均質(zhì)器或滅菌乳缽均質(zhì)器或滅菌乳缽厭氧培養(yǎng)裝置：常溫催化除氧式或堿性焦性沒石子酸除氧式厭氧培養(yǎng)裝置：常溫催化除氧式或堿性焦性沒石子酸除氧式滅菌吸管：滅菌吸管：1

7、ml（具（具0.01ml刻度），刻度），10ml（具（具0.1ml刻度）刻度）滅菌試管：滅菌試管：16mmx160mm滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm滅菌錐形瓶：滅菌錐形瓶：500ml產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)l培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑1.皰肉培養(yǎng)基：皰肉培養(yǎng)基：gb/t4789.28-2003中中4.672.亞硫酸鹽一多粘菌素一磺胺嘧啶瓊脂亞硫酸鹽一多粘菌素一磺胺嘧啶瓊脂(sps) ： gb/t4789.28-2003中中4.693.液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(ft) ： gb/t4789.28-2003中中4.704.動(dòng)力一硝酸鹽培養(yǎng)基：動(dòng)力一硝酸鹽培養(yǎng)基：gb

8、/t4789.28-2003中中4.725.含鐵牛奶培養(yǎng)基：含鐵牛奶培養(yǎng)基：gb/t4789.28-2003中中4.716.卵黃瓊脂培養(yǎng)基：卵黃瓊脂培養(yǎng)基：gb/t4789.28-2003中中4.687. 0.1蛋白陳水：蛋白陳水：gb/t4789.28-2003中中4.858.硝酸鹽還原試劑：硝酸鹽還原試劑：gb/t4789.28-2003中中3.179.革蘭氏染色液：革蘭氏染色液：gb/t4789.28-2003中中2.2產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)l活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)檢驗(yàn)程序產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)l確證試驗(yàn)檢驗(yàn)程序確證實(shí)驗(yàn)確證實(shí)驗(yàn)l1.革蘭氏染色鏡檢：產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，其耐

9、熱株可能形成卵形芽孢，位于菌體中央或近末端，其寬度一般不大于菌體。l2.動(dòng)力-硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn) 用接種環(huán)（針）穿刺接種動(dòng)力一硝酸鹽培養(yǎng)基，于36士1培養(yǎng)24h，觀察接種線的生長(zhǎng)情況，判斷有無(wú)動(dòng)力。然后，滴加甲萘胺液和對(duì)氨基苯磺酸液各0.5ml，觀察硝酸鹽是否被還原。產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)動(dòng)力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。確證實(shí)驗(yàn)確證實(shí)驗(yàn)l3.取生長(zhǎng)旺盛的ft培養(yǎng)液1ml接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，46水浴中培養(yǎng)2h，觀察有無(wú)“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，5h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，但培養(yǎng)基不變黑。l4.用接種環(huán)取ft培養(yǎng)液點(diǎn)種于卵黃瓊脂平板（每張平板至少可接種10點(diǎn)

10、），于36士1厭氧培養(yǎng)24h，觀察接種點(diǎn)的變化。產(chǎn)氣英膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，接種點(diǎn)的底部及周圍形成乳白色的混濁帶。產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)l菌數(shù)計(jì)算菌數(shù)計(jì)算 根據(jù)黑色菌落的計(jì)數(shù)和確證試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)黑色菌落的計(jì)數(shù)和確證試驗(yàn)的結(jié)果，計(jì)算每克（毫升）食品檢樣的含菌數(shù)。計(jì)算每克（毫升）食品檢樣的含菌數(shù)。l例如：10-4稀釋液的平板長(zhǎng)有黑色菌落100個(gè)，而供做確證試驗(yàn)的10個(gè)菌落中有7個(gè)被確證為產(chǎn)氣莢膜梭菌，則每克（毫升）食品檢樣所含產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)為： 100x0.7x1047x105返回五、產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)方法五、產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)方法 隨著產(chǎn)氣莢膜梭菌分子生物學(xué)研究的深入，隨著產(chǎn)氣莢膜梭菌分子生物學(xué)研究的深入，該菌的毒素基因相繼被克隆測(cè)序，在此基礎(chǔ)上該菌的毒素基因相繼被克隆測(cè)序，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了許多鑒定菌型和判斷致病性的方法。出現(xiàn)了許多鑒定菌型和判斷致病性的方法。l縮短了時(shí)間，能夠較快得到結(jié)果，操作簡(jiǎn)單縮短了時(shí)間，能夠較快得到結(jié)果，操作簡(jiǎn)單l比如比如pcr、lamp等。等。返回六、產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染及控制六、產(chǎn)氣莢膜梭