1、【干貨收藏貼】WB常見問題精品全集錦做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結WB實驗中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應的解決方案，這就是實驗成功的基石。以下，我們先解決很多技術菌的疑惑，然后再著手匯總實驗中常見問題和可能原因分析以及給出建議解決方案。WB常見問題分析1.為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？原因有很多：a) 細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；b) 細胞中的蛋白質被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；c) 抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間

2、過長。2.我做的蛋白質分子量很小（10KDa），請問怎么做WB？a)可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可；b)也可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。3.我的目的帶很弱，如何加強？a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；b)也可以將一抗稀釋比例降低；c)還可以延長曝光時間。4.DAB好還是ECL好？DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。5.膠片是一片空白，是怎么回事？如果能

3、夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不穩定，失活；c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；d)一抗選擇不當二抗失活；e)二抗失活。6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。7.細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB？一般5106就足夠。8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？可以濃縮樣品，也可以根據目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以

4、考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？a)做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時要小心；b)轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。c)轉膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉膜效率更高哦!10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那

5、么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。11.WB中抗體的可以重復應用嗎？抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用23次。稀釋后應在23天內使用，4度保存，避免反復凍融。12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果？無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。WB 實驗中常會出現各種問題，也跟技術菌們一起分享下 WB 實驗中各種問題及應用對策，希望給您的實驗帶來實實在在的幫助WB問題匯總及解決建議問題原因解決方案條帶形狀不好看膠凝的不均勻，聚合不好灌膠前將溶液充分混勻某些樣品鹽濃度較高除鹽或

6、將樣品鹽濃度調成一致緩沖液陳舊，成分改變重配凝膠下面有氣泡電泳前先將氣泡趕走電泳時溫度過高降低電流或電壓樣品中含有不溶性顆粒樣品充分攪拌混勻電極不平衡或者加樣位置偏斜調整電極和加樣蛋白條帶信號弱樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低加大上樣量或濃縮樣品轉移不完全或過轉移可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流抗體濃度低增加抗體濃度或延長孵育時間封閉過度減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型顯色劑失效更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用）顯色或曝光時間不足延長顯色或曝光時間HRP 抑制劑所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉轉膜效率低轉膜緩沖

7、液pH值與目的蛋白等電點相近提高轉膜緩沖液pH值凝膠與膜之間存在氣泡轉膜前要排盡氣泡轉印膜種類選擇不當使用質量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜電壓或電流過小濕轉時20mA恒流，半干轉時25V左右恒壓轉印時間過長或過短根據蛋白大小及轉印裝置選擇合適的轉印時間濕轉過程中環境溫度過高使用預冷的轉膜緩沖液或將裝置至于4度顯色或曝光后無條帶選用的一抗、二抗及顯色方法不合適選擇合適的一抗、二抗和顯色方法目的蛋白含量低于檢測下限加大上樣量或濃縮樣品抗體效價過低增加抗體濃度抗體孵育時間不足延長孵育時間，37C孵育1小時以上抗體過度洗滌減少洗滌時間及次數，加入的去垢劑不宜過強或過多加入HRP底物反應與曝光檢測之間

8、間隔時間過長反應3到5分鐘及時檢測背景高膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數封閉物用量不足提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜封閉物使用不當檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉封閉時間不夠室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜抗體非特異性結合降低抗體濃度，減少孵育時間一抗稀釋度不適宜對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度一抗孵育的溫度偏高建議4結合過夜抗體濃度過高或洗滌不夠降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間化學顯色底物過多按說明書加入適量的顯色底物蛋白條帶位置 （大小）不對相對電荷氨基酸電荷的組成膠濃度不同濃度的膠跑出的蛋白條帶

9、的位置可能有所偏差，調整濃度抗體孵育不充分增加抗體濃度，延長孵育時間酶失活直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體查詢相關文獻確定標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低設置陽性對照比對結果，增加標本上樣量雜帶多目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小樣本處理過程中目的蛋白發生降解加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作雜蛋白多處理目的蛋白抗體特異性不強使用特異性強的抗體抗體孵育時間過久減少抗體孵育時間二抗與抗原有交叉反應選擇合適的封閉物二聚體或多聚體存在增加蛋白質變性過程及強度底物顯色與曝光時間過長縮短顯色及曝光的時間大分子量WB膜孔徑太小更換孔徑較大的膜轉膜電壓電流低提高電壓/電流轉膜時間短延長轉膜時間膠濃度太大使用低濃