1、趙 世 光現代生化分離技術現代生化分離技術Separation Methods in Biochemistry Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering2生物樣品前處理生物樣品前處理第二章第二章 生物樣品前處理生物樣品前處理Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical E

2、ngineering3生物樣品前處理生物樣品前處理第一節 樣品分離的預提取第二節 細胞的破碎與分離 第一章 緒論Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering4生物樣品前處理生物樣品前處理第一節 樣品分離的預提?。ㄇ疤幚恚?前處理的目的：對目標組分進行初步富集，前處理的目的：對目標組分進行初步富集，對干擾成分對干擾成分進行去除；進行去除； 2.1.1 2.1.1 概述概述預處理材料的種類和特點預處理材料的種類和特點 動物細胞

3、反應液動物細胞反應液植物細胞反應液植物細胞反應液微生物細胞反應液微生物細胞反應液植物組織提取液植物組織提取液動物組織提取液動物組織提取液“發酵液發酵液” “” “產物產物”，胞內，胞內oror胞外？胞外？組織組織Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering5生物樣品前處理生物樣品前處理2.1.2 2.1.2 植物組織提取物的制備植物組織提取物的制備Anhui University of Technology and Sci

4、enceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering6生物樣品前處理生物樣品前處理一些酶必須從富含酚、多酚的綠葉、水果和其它組織中一些酶必須從富含酚、多酚的綠葉、水果和其它組織中提取，大量的分類化合物給提取帶來困難。在完整的細胞提取，大量的分類化合物給提取帶來困難。在完整的細胞組織中，酶和酚類物質處于彼此隔離的狀態，細胞組織被組織中，酶和酚類物質處于彼此隔離的狀態，細胞組織被破壞后，彼此接觸，很容易發生酶促反應，反應產物苯醌破壞后，彼此接觸，很容易發生酶促反應，反應產物苯醌和單寧類還會繼續和酶蛋白質反應，

5、破壞目的酶的活性。和單寧類還會繼續和酶蛋白質反應，破壞目的酶的活性。所以要在預處理階段去除酚類化合物。所以要在預處理階段去除酚類化合物。 2.1.2.1 2.1.2.1 植物組織中酶的提取植物組織中酶的提取Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering7生物樣品前處理生物樣品前處理例子：植物組織中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取例子：植物組織中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1. 步驟：步驟：100g100g新鮮葉片新鮮葉片切成小片（打孔器

6、、切片）切成小片（打孔器、切片）置入提取置入提取液中（穩定酶活性）液中（穩定酶活性）PVPPPVPP預浸泡（預浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性酮，可溶性PVPPVP聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮，），）間歇高速攪拌（充分接間歇高速攪拌（充分接觸混勻）觸混勻）紗布過濾紗布過濾濾液加入濾液加入PVPPPVPP重復輕攪（重復一重復輕攪（重復一次）次）離心去除離心去除PVPPPVPP酶粗提液。酶粗提液。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Bioc

7、hemical Engineering8生物樣品前處理生物樣品前處理2. 條件討論條件討論低溫（低溫（45度），器皿、溶液預冷、操作要快；度），器皿、溶液預冷、操作要快；57倍于固形材料的提取液，攪拌不產生氣泡（氣泡不倍于固形材料的提取液，攪拌不產生氣泡（氣泡不利于酶活穩定）；利于酶活穩定）；PH6.57.0，中性，未知蛋白酶要遠離等電點；，中性，未知蛋白酶要遠離等電點；PVPP優良，不溶性；優良，不溶性；PPO抑制劑，抑制劑，DTT、2-ME；蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，劇毒。（苯甲磺酰氟）酒精溶解，劇毒。Anhui University of Technolog

8、y and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering9生物樣品前處理生物樣品前處理2.1.2.2 2.1.2.2 多糖提取多糖提取重要活性多糖重要活性多糖步驟：原料步驟：原料粉碎粉碎醇醚回流脫脂醇醚回流脫脂水提取水提取粗提液粗提液去蛋白策略：去蛋白策略：SevagSevag法，蛋白質在氯仿等有機溶劑中變法，蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性性TCATCA法，低濃度的法，低濃度的TCATCA可沉淀蛋白質，離心后即可除去可沉淀蛋白質，離心后即可除去蛋白質。蛋白質。Anhui University

9、of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering10生物樣品前處理生物樣品前處理2.1.2.3 2.1.2.3 細菌重組蛋白的提取細菌重組蛋白的提取重組蛋白：工程菌可表達大量的重組目的蛋白，重組蛋白：工程菌可表達大量的重組目的蛋白，40%40%總蛋總蛋白含量，但易形成包涵體（蛋白質以不溶形式包涵在細白含量，但易形成包涵體（蛋白質以不溶形式包涵在細胞質中）。胞質中）。Anhui University of Technology and ScienceTeachi

10、ng and Research Section Department of Biochemical Engineering11生物樣品前處理生物樣品前處理例：例：E. coli.E. coli.中提取重組蛋白中提取重組蛋白1. 步驟：步驟：酶解菌體細胞：離心收集菌體酶解菌體細胞：離心收集菌體溶菌酶溶菌酶去核酸（去核酸（DNaseDNase）電泳檢測；電泳檢測；清洗包涵體：去除雜蛋白，保證包涵體蛋白不被溶清洗包涵體：去除雜蛋白，保證包涵體蛋白不被溶解；解；溶解包涵體：釋放目的蛋白；溶解包涵體：釋放目的蛋白；目的蛋白再折疊：恢復活性目的蛋白再折疊：恢復活性Anhui University of T

11、echnology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering12生物樣品前處理生物樣品前處理第二節 細胞的破碎與分離微生物代謝產物：微生物代謝產物： 胞外產物（氨基酸、細菌堿性蛋白酶、糖化酶等）胞外產物（氨基酸、細菌堿性蛋白酶、糖化酶等） 胞內產物（大多數蛋白質、類脂）胞內產物（大多數蛋白質、類脂） 微生物代謝產物大多數分泌到胞外，但有些目標產物微生物代謝產物大多數分泌到胞外，但有些目標產物存在細胞內部。目前重組存在細胞內部。目前重組DNADNA技術，表達的產品（如胰技術，表達的

12、產品（如胰島素、干擾素、白細胞介素等），都是胞內產物。首島素、干擾素、白細胞介素等），都是胞內產物。首先必須將細胞破碎，使產物得以釋放，才能進一步提先必須將細胞破碎，使產物得以釋放，才能進一步提取。取。 2.2.1 概述概述Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering13生物樣品前處理生物樣品前處理2.2.2 2.2.2 常用破碎方法常用破碎方法機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破

13、碎法、X-X-presspress法等；對物料的擠壓和剪切作用法等；對物料的擠壓和剪切作用非機械法：酶溶法、化學滲透法、凍融法、干燥法等；非機械法：酶溶法、化學滲透法、凍融法、干燥法等；Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering14生物樣品前處理生物樣品前處理2.2.2.1 2.2.2.1 珠磨法珠磨法原理：原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的研磨劑（玻功小珠、進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的研磨劑（玻功小珠、石英砂、氧化

14、鋁石英砂、氧化鋁d1mmdG+G-G+酵母。酵母。易失活物質不宜用（超聲波可促使產生一些化學自由，易失活物質不宜用（超聲波可促使產生一些化學自由，基因使敏感活性物質失活），可加入保護劑基因使敏感活性物質失活），可加入保護劑N2N2、PMSFPMSF等等 特點：特點：Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering20生物樣品前處理生物樣品前處理溶菌酶（細菌），溶菌酶（細菌），-3-3，3-3-葡聚糖酶，葡聚糖酶，-1-1，6-

15、6-葡聚糖酶，葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鍵內切酶，殼多糖酶，細胞蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鍵內切酶，殼多糖酶，細胞壁溶解酶（復合酶），酵母。酶有專一性。壁溶解酶（復合酶），酵母。酶有專一性。特點：特點：條件溫和，核酸泄出量少，選擇性釋放產物（可從細胞不同條件溫和，核酸泄出量少，選擇性釋放產物（可從細胞不同位置）位置）價格高，限制了大規模應用價格高，限制了大規模應用通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，最佳條件不易確定；通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，最佳條件不易確定；產物抑制的存在：在溶酶系統中，甘露糖產物抑制的存在：在溶酶系統中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖酶葡聚糖酶

16、2.2.2.4 2.2.2.4 酶溶法酶溶法外加酶外加酶Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering21生物樣品前處理生物樣品前處理 將新鮮的生物材料存放于一定的將新鮮的生物材料存放于一定的pHpH和適當的溫度下和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放和酯酶等）的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來。出來。特點：特點：

17、 對不穩定的微生物，易引起所需蛋白質變性。對不穩定的微生物，易引起所需蛋白質變性。 自溶后，細胞懸浮液粘度上升，過濾速率下降。自溶后，細胞懸浮液粘度上升，過濾速率下降。自溶法自溶法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering22生物樣品前處理生物樣品前處理2.2.2.5 2.2.2.5 化學滲透法化學滲透法原理：原理：使用某些可以改變細胞壁或膜的通透性（滲使用某些可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性）的化學試劑，使胞內物質有

18、選擇地滲透出來透性）的化學試劑，使胞內物質有選擇地滲透出來，稱為化學滲透法。，稱為化學滲透法。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering23生物樣品前處理生物樣品前處理 表面活性物質：促使細胞某些組分溶解，其增溶作表面活性物質：促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞破碎用有助于細胞破碎 EDTAEDTA螯合劑：與結構中螯合劑：與結構中ca2+ca2+或或Mg2+Mg2+螯合，使其原有螯合，使其原有結構破壞而破裂結構破

19、壞而破裂 有機溶劑：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高級醇等，有機溶劑：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高級醇等，能被細胞壁中的類脂吸收，使胞壁膜溶脹，導致細能被細胞壁中的類脂吸收，使胞壁膜溶脹，導致細胞破碎；胞破碎； 變性劑：與水中氫鍵作用，減弱水的極性，使疏水變性劑：與水中氫鍵作用，減弱水的極性，使疏水性化合物溶于水性化合物溶于水Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering24生物樣品前處理生物樣品前處理特點特點選擇性釋放產物?？墒挂?/p>

20、些較小分子量的溶質，如多肽選擇性釋放產物?？墒挂恍┹^小分子量的溶質，如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內。在胞內。細胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分細胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。離和進一步提取。通用性差，某種試劑只能作用于某種特定類型細胞；通用性差，某種試劑只能作用于某種特定類型細胞；時間長、效率低，胞內物一般釋放率不超過時間長、效率低，胞內物一般釋放率不超過80%80%；有些化學試劑有毒，在其后產物提取精時，需分離除去有些化學試劑有毒，在其后產物提取精時，需分離除去。A

21、nhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering25生物樣品前處理生物樣品前處理 將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結構破裂，另一方面胞內水結晶，使胞膜的疏水鍵結構破裂，另一方面胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。

22、適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。性。 2.2.2.6 2.2.2.6 反復凍結反復凍結融化法融化法原理：原理：Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering26生物樣品前處理生物樣品前處理使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用

23、丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。，胞內物質就容易被抽提出來。熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥2.2.2.72.2.2.7干燥法干燥法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering27生物樣品前處理生物樣品前處理X-pressX-press法：將濃縮的菌體懸浮液冷卻至法：將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25-25形成形成冰晶體，利用冰晶體，利用500MPa500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，適應范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度實驗室，適應范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優點，但不