1、第一章第一章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 1教學(xué)運(yùn)用 第一章第一章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) u 本章內(nèi)容簡介本章內(nèi)容簡介 u 掌握內(nèi)容講授掌握內(nèi)容講授 u 本章要點(diǎn)回顧本章要點(diǎn)回顧 u 本章習(xí)題本章習(xí)題 2教學(xué)運(yùn)用 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（Protein，Pr）生活細(xì)胞生活細(xì)胞 內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜、參與內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜、參與 幾乎所有生命活動過程。即幾乎所有生命活動過程。即蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 是生命活動的體現(xiàn)者是生命活動的體現(xiàn)者催化功能、催化功能、 調(diào)節(jié)功能、轉(zhuǎn)運(yùn)功能、貯存功能、調(diào)節(jié)功能、轉(zhuǎn)運(yùn)功能、貯存功能、 運(yùn)動功能、結(jié)構(gòu)功能、支架功能、運(yùn)動功能、結(jié)構(gòu)功能、支架功能、 防御和進(jìn)攻異常功能防御和進(jìn)攻異常功能 3教學(xué)運(yùn)用

2、 本章主要介紹了氨基酸（本章主要介紹了氨基酸（AA）、）、 Pr的基礎(chǔ)知識。的基礎(chǔ)知識。重點(diǎn)掌握重點(diǎn)掌握AA、 Pr的結(jié)構(gòu)組成、性質(zhì)的特點(diǎn)及與的結(jié)構(gòu)組成、性質(zhì)的特點(diǎn)及與 功能之間的依存關(guān)系。功能之間的依存關(guān)系。了解了解常見常見 的活性肽；的活性肽；了解了解蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化 的常用方法。的常用方法。 4教學(xué)運(yùn)用 第一章第一章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) u1.11.1 氨基酸氨基酸 u1.21.2 肽鍵肽鍵 u1.3 1.3 生理活性肽生理活性肽 u1.41.4 Pr Pr的分離和純化的分離和純化 u1.51.5 Pr Pr的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能 5教學(xué)運(yùn)用 第一章第一章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 1.1

3、1.1 氨基酸氨基酸 u1.1.11.1.1 AA AA的構(gòu)型的構(gòu)型 u1.1.21.1.2 AA AA的酸堿性質(zhì)與的酸堿性質(zhì)與p pK K值值 u1.1.31.1.3 AA AA的茚三酮反應(yīng)的茚三酮反應(yīng) 6教學(xué)運(yùn)用 氨基酸（氨基酸（Amino acid,AAAmino acid,AA）是蛋）是蛋 白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位. .構(gòu)成構(gòu)成PrPr具具 有遺傳編碼的氨基酸殘基有有遺傳編碼的氨基酸殘基有2020 種種蛋白質(zhì)氨基酸蛋白質(zhì)氨基酸。P2P2圖圖1-11-1 7教學(xué)運(yùn)用 Amino acids are the building blocks of proteins 1919種氨基

4、酸具有種氨基酸具有一級一級氨基氨基(-NH3+)和羧基和羧基(-COO-) 結(jié)合到結(jié)合到C，同時(shí)結(jié)合到，同時(shí)結(jié)合到C上的是上的是H和各種側(cè)鏈和各種側(cè)鏈R； Pro具有具有二級二級氨基氨基(-NH2+,-亞氨基酸亞氨基酸) ) 8教學(xué)運(yùn)用 二十種常見蛋白質(zhì)二十種常見蛋白質(zhì)AAAA的分類與的分類與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 據(jù)營養(yǎng)據(jù)營養(yǎng) 學(xué)分類學(xué)分類 必需必需 非必需非必需 據(jù)據(jù)R基團(tuán)化基團(tuán)化 學(xué)結(jié)構(gòu)分類學(xué)結(jié)構(gòu)分類 脂肪族脂肪族AAAA【中性、含羥基或巰基中性、含羥基或巰基( (一氨基一羧基一氨基一羧基) )、酸性酸性( ( 一氨基二羧基一氨基二羧基) )、堿性堿性( (二氨基一羧基二氨基一羧基) )】 芳

5、香族芳香族AA (PheAA (Phe、TyrTyr、Trp)Trp) 雜環(huán)雜環(huán)AA (HisAA (His、Pro)Pro) 據(jù)據(jù)R基團(tuán)基團(tuán) 極性分類極性分類 極性極性R基團(tuán)基團(tuán)AA 非極性非極性R基團(tuán)基團(tuán)AA (種種 / 9種種) 不帶電荷不帶電荷（種種 / 6種種） 帶電荷帶電荷：正電荷：正電荷（種）負(fù)電荷種）負(fù)電荷（種）種） 人的必需氨基酸人的必需氨基酸 Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr 假假 設(shè)設(shè) 來來 借借 一一 兩兩 本本 書書 ArgArg、HisHis（半必需（半必需AAAA） 9教學(xué)運(yùn)用 甘氨酸甘氨酸 （Gly,G） 丙氨酸丙氨酸 （Ala,A

6、） 纈氨酸纈氨酸 （Val,V） 亮氨酸亮氨酸 （Leu,L） 異亮氨酸異亮氨酸 （Ile,I） 中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸 含羥基或硫含羥基或硫(巰基巰基)脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸 絲氨酸絲氨酸 （Ser,S） 蘇氨酸蘇氨酸 （Thr,T） 半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C） 甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M） 10教學(xué)運(yùn)用 酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺 天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D） 谷氨酸谷氨酸 （Glu,E） 天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,N） 谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q） 11教學(xué)運(yùn)用 堿性氨基酸堿性氨基酸 賴氨酸賴氨酸 （Lys,K） 精氨酸精氨酸 （Arg,R） 組氨酸

7、組氨酸 （His,H） 雜環(huán)雜環(huán) 12教學(xué)運(yùn)用 雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸 組氨酸組氨酸 （His,H） 脯氨酸脯氨酸 （Pro,P） 13教學(xué)運(yùn)用 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F） 酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y） 色氨酸色氨酸 （Trp,W） 14教學(xué)運(yùn)用 非極性非極性R R基團(tuán)氨基酸基團(tuán)氨基酸(Gly-Ala-Val-Leu-Ile-Phe-Met-Pro- Trp疏水性逐漸增大疏水性逐漸增大) ) 15教學(xué)運(yùn)用 極性不帶電荷極性不帶電荷R基團(tuán)氨基酸基團(tuán)氨基酸 16教學(xué)運(yùn)用 帶電荷帶電荷R基團(tuán)氨基酸基團(tuán)氨基酸 Ser-Thr-Asn-Gln-Tyr-Cys-Asp-Glu

8、-His-Lys-Arg極極 性性AAAA的的R R基團(tuán)親水性逐漸增強(qiáng)基團(tuán)親水性逐漸增強(qiáng) 17教學(xué)運(yùn)用 二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 含支鏈含支鏈AA：Val、Leu，Ile 含羥基的含羥基的AA：Ser、Thr 含硫的含硫的AA：Cys(含巰基含巰基)、Met(含硫甲基含硫甲基) 含苯環(huán)的含苯環(huán)的AA：Phe、Trp、Tyr 含胍基的含胍基的AA：Arg 含咪唑基的含咪唑基的AA：His 亞氨基酸：亞氨基酸：Pro 含酰胺的含酰胺的AA：Asn、Gln 含吲哚基的含吲哚基的AA：Trp 含含-氨基的氨基的AA：Lys 18教學(xué)運(yùn)用 1.除除R為為H（Gly）外）外,其其 余余

9、AA均具有均具有不對稱不對稱- 碳原子碳原子AA有有D/L- 構(gòu)型構(gòu)型,但構(gòu)成但構(gòu)成Pr的的AA均均 為為L-氨基酸氨基酸,在生物界在生物界 有有D-氨基酸的存在。氨基酸的存在。 2. AA具有具有不對稱不對稱-碳碳 原子原子AA具有具有旋光性旋光性 3.各種各種AA的區(qū)別的區(qū)別在于側(cè)在于側(cè) 鏈鏈R基基上上 AAAA的結(jié)構(gòu)通式的結(jié)構(gòu)通式 19教學(xué)運(yùn)用 AA的酸堿性質(zhì)的酸堿性質(zhì) p3-4 AA既含有氨基，可接受既含有氨基，可接受H H+ +，又含有羧基可電，又含有羧基可電 離出離出H H+ +，所以氨基酸具有，所以氨基酸具有酸堿兩性性質(zhì)酸堿兩性性質(zhì)。通。通 常情況下，氨基酸以常情況下，氨基酸以偶

10、離子偶離子兼（兩）性兼（兩）性 離子的形式離子的形式存在，如下圖所示：存在，如下圖所示： 20教學(xué)運(yùn)用 AA的等電點(diǎn)的等電點(diǎn)AAAA在在酸性環(huán)境酸性環(huán)境中主要以中主要以陽離子陽離子H H2 2A A+ +的形的形 式存在式存在, ,在在堿性環(huán)境堿性環(huán)境中主要以中主要以陰離子陰離子A A- -的形式存在的形式存在. .在在某一某一 pHpH環(huán)境環(huán)境下下, ,以以偶離子偶離子形式存在形式存在, ,在電場中既不向陰極也不向在電場中既不向陰極也不向 陽極移動陽極移動該該AAAA的的等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)，其定其定 義為義為AAAA所帶正負(fù)電荷相等時(shí)的溶液所帶正負(fù)電荷相

11、等時(shí)的溶液pHpH。 p3 21教學(xué)運(yùn)用 與茚三酮的反應(yīng)：除與茚三酮的反應(yīng)：除Pro外，可與外，可與 其它其它AA生成生成藍(lán)紫色藍(lán)紫色化合物。化合物。Pro在在 此反應(yīng)中并不釋放此反應(yīng)中并不釋放NH3，直接生成，直接生成 黃色黃色化合物。在化合物。在570nm（藍(lán)紫色）（藍(lán)紫色） 或或440nm（黃色）定量測定（黃色）定量測定（0.5- 50g/ml） 與茚三酮反應(yīng)與茚三酮反應(yīng) 22教學(xué)運(yùn)用 23教學(xué)運(yùn)用 脯氨酸與茚三酮反應(yīng)的產(chǎn)物：脯氨酸與茚三酮反應(yīng)的產(chǎn)物： N N+ + 黃色化合物黃色化合物 24教學(xué)運(yùn)用 肽鍵肽鍵（peptide bond）：一個(gè)：一個(gè)AAAA的的-COOH 和相鄰的另一個(gè)

12、和相鄰的另一個(gè)AAAA的的-NH2脫水形成的脫水形成的共共 價(jià)鍵價(jià)鍵。具有。具有部分雙鍵部分雙鍵性質(zhì)性質(zhì)不能自由旋不能自由旋 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，呈呈平面平面結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 25教學(xué)運(yùn)用 N N端端C C端端 肽鏈中從一個(gè)肽鏈中從一個(gè)CC原子到另一個(gè)原子到另一個(gè)CC原子之間共包原子之間共包 含的含的6 6個(gè)個(gè)原子（原子（CC、C C、O O、N N、H H、CC）在空間共）在空間共 處于處于同一個(gè)平面同一個(gè)平面肽肽/ /酰胺平面酰胺平面，是蛋白質(zhì)空間，是蛋白質(zhì)空間 構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位 26教學(xué)運(yùn)用 肽鍵肽鍵/酰胺平面與酰胺平面與 -碳原子的二面角（碳原子的二面角（ 和和 ） 二面角二面角 兩相鄰

13、酰胺平面之間，能以共同的兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的C C 為定點(diǎn) 為定點(diǎn) 而旋轉(zhuǎn)，繞而旋轉(zhuǎn)，繞C C -N -N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱角，繞角，繞C-C- C C 鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱 鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱角。角。和和稱作二面角稱作二面角 ，亦稱構(gòu)象角。，亦稱構(gòu)象角。 27教學(xué)運(yùn)用 腦啡肽：腦啡肽：為為5 5肽肽，具有鎮(zhèn)痛作用。有兩種類型，具有鎮(zhèn)痛作用。有兩種類型 MetMet腦啡肽腦啡肽和和LeuLeu腦啡肽腦啡肽 28教學(xué)運(yùn)用 第一章第一章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 1.4 Pr1.4 Pr的分離和純化的分離和純化 u1.4.11.4.1 Pr Pr分離、提純一般程序分離、提純一般程序 u1.4.21.

14、4.2 Pr Pr的溶解度分級沉淀的溶解度分級沉淀 u1.4.31.4.3 目的蛋白的精制目的蛋白的精制 29教學(xué)運(yùn)用 一一. . 分離純化蛋白質(zhì)的意義分離純化蛋白質(zhì)的意義 1.1.研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性要求純度高，不變性 2.2.提取活性的酶或蛋白質(zhì)：提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)必須保持天然活性狀態(tài) 3.3.作為藥物或食品添加劑：作為藥物或食品添加劑：純度達(dá)到規(guī)定要求純度達(dá)到規(guī)定要求 二、蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)：二、蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)： 增加制品增加制品純度或比活力純度或比活力，設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和，設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和 其他雜蛋白，

15、且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。其他雜蛋白，且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。 30教學(xué)運(yùn)用 蛋白質(zhì)分離純化的一般程序（蛋白質(zhì)分離純化的一般程序（溫和條件溫和條件） 1. 1.前處理前處理 生物組織生物組織 破碎、溶解、離心分離破碎、溶解、離心分離 蛋白質(zhì)提取液蛋白質(zhì)提取液 2. 2.粗分離粗分離 鹽析、等電點(diǎn)沉淀、透析、超濾、有機(jī)溶劑分級分離鹽析、等電點(diǎn)沉淀、透析、超濾、有機(jī)溶劑分級分離 3.3.細(xì)分級細(xì)分級 層析、電泳、超速離心層析、電泳、超速離心 精制精制 精制品精制品 4. 4.結(jié)晶結(jié)晶 結(jié)晶或凍干粉結(jié)晶或凍干粉 適宜介質(zhì)適宜介質(zhì) 31教學(xué)運(yùn)用 u選擇合適原料：選擇合適原料：動物、植

16、物組動物、植物組 織、基因工程表達(dá)產(chǎn)物織、基因工程表達(dá)產(chǎn)物 u采用不同方法將采用不同方法將細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 u得到含有得到含有目的蛋白的粗提液目的蛋白的粗提液 控制提純條件以避免控制提純條件以避免PrPr變性變性 32教學(xué)運(yùn)用 uPrPr在水中的溶解度在水中的溶解度取決于取決于PrPr的水合度的水合度 u常用常用加入無機(jī)鹽加入無機(jī)鹽的方法來控制水合度的方法來控制水合度 u鹽溶鹽溶: :當(dāng)溶液中無機(jī)鹽的濃度從零增加時(shí)當(dāng)溶液中無機(jī)鹽的濃度從零增加時(shí), Pr, Pr 的的溶解度有所增加溶解度有所增加（帶電層使（帶電層使PrPr分子彼此排分子彼此排 斥而與水分子間的相互作用加強(qiáng)）斥而與水分子間的相互作

17、用加強(qiáng)） u鹽析鹽析: :當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一點(diǎn)時(shí)當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一點(diǎn)時(shí), Pr, Pr開始開始 沉淀沉淀（PrPr分子表面的水化層被移去溶解鹽離分子表面的水化層被移去溶解鹽離 子，使子，使PrPr分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來而聚分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來而聚 集沉淀）集沉淀） 33教學(xué)運(yùn)用 u常用的中性鹽為常用的中性鹽為硫酸銨硫酸銨 u不同蛋白質(zhì)不同蛋白質(zhì)由于所帶電荷和水化程度不由于所帶電荷和水化程度不 同，鹽析時(shí)所需同，鹽析時(shí)所需鹽濃度也不同鹽濃度也不同，因此可，因此可 以將不同蛋白質(zhì)加以分離以將不同蛋白質(zhì)加以分離 u鹽析順序的先后差異達(dá)到分級沉淀鹽析順序的先后差異達(dá)到分級沉淀 p7p

18、7圖圖1-61-6 34教學(xué)運(yùn)用 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì) 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì) 水化層水化層 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì) 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 酸酸堿堿 酸酸堿堿 酸酸堿堿 脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用 蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)的聚沉 蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì) 溶溶 液液 等等 電電 點(diǎn)點(diǎn) 沉沉 淀淀 作作 用用 示示 意意 圖圖 35教學(xué)運(yùn)用 透析與超濾簡易裝置透析與超濾簡易裝置 36教學(xué)運(yùn)用 u層析層析: :離子交換層析離

19、子交換層析、凝凝 膠過濾層析膠過濾層析、親和層析親和層析、 疏水層析疏水層析 u電泳電泳：SDS-PAGESDS-PAGE電泳、電泳、 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 u超速離心超速離心: :密度梯度離心密度梯度離心 37教學(xué)運(yùn)用 離子交換層析：以離子交換層析：以離子交換樹脂離子交換樹脂為支持為支持 物，物，樹脂是一種人工合成的聚苯乙烯一樹脂是一種人工合成的聚苯乙烯一 苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子 聚合物。聚合物。 AAAA在樹脂上結(jié)合的在樹脂上結(jié)合的牢固程度牢固程度即即AAAA與樹脂與樹脂 間的親和力間的親和力，主要決定于它們之間的，主要決定于它們之間的靜靜 電

20、吸引電吸引和和AAAA的的R R基團(tuán)與樹脂基質(zhì)之間的基團(tuán)與樹脂基質(zhì)之間的 疏水作用疏水作用。 38教學(xué)運(yùn)用 陽離子交換樹脂：活性基團(tuán)是酸性的陽離子交換樹脂：活性基團(tuán)是酸性的，如磺酸基，如磺酸基- SO3H強(qiáng)酸型強(qiáng)酸型；羧基；羧基-COOH弱酸型弱酸型 陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)是堿性的陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)是堿性的，如，如OH- 39教學(xué)運(yùn)用 離子交換原理及流程示意圖離子交換原理及流程示意圖 + 40教學(xué)運(yùn)用 基本步驟：基本步驟： 裝柱裝柱 上樣上樣 分步洗脫分步洗脫 分步收集分步收集 強(qiáng)酸型陽強(qiáng)酸型陽 離子交換離子交換 樹脂樹脂 pH23，使所有氨，使所有氨 基酸帶基酸帶正電荷正電荷， 正電

21、荷大小順序：正電荷大小順序： 堿性堿性AA中性中性 AA酸性酸性AA 逐步提高逐步提高洗洗 脫液脫液pH和離和離 子強(qiáng)度子強(qiáng)度 分離分離AA混合物經(jīng)常使用混合物經(jīng)常使用強(qiáng)酸型陽離子強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂交換樹脂， pH23上柱上柱,此時(shí)此時(shí)AA主要以主要以陽離子陽離子形式存在形式存在,與與 樹脂上的陽離子交換而被樹脂上的陽離子交換而被“掛掛”在樹脂上。在樹脂上。 41教學(xué)運(yùn)用 由于由于AA與樹脂之間還有與樹脂之間還有疏水相互作用疏水相互作用，因此，因此， 除除Asn、Gln、Trp外外17種種AA的洗出順序?yàn)椋旱南闯鲰樞驗(yàn)椋?Asp-Thr-Ser-Glu-Pro-Gly-Ala-Cys-Val

22、- Met-Ile-Leu-Tyr-Phe-Lys-His-Arg pH3時(shí)，時(shí)，AA與樹脂之間的靜電吸引大小順序?yàn)椋号c樹脂之間的靜電吸引大小順序?yàn)椋?堿性堿性AA2+中性中性AA+酸性酸性AA0 因此因此AA的洗出的洗出 順序?yàn)轫樞驗(yàn)樗嵝运嵝訟A中性中性AA堿性堿性AA。 42教學(xué)運(yùn)用 凝膠過濾層析原理凝膠過濾層析原理 43教學(xué)運(yùn)用 親和層析法親和層析法 44教學(xué)運(yùn)用 由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈側(cè)鏈上存上存 在游離的在游離的氨基氨基和游離的和游離的羧基羧基，因此蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì) 與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)，因而與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)，因而 也具

23、有特定的也具有特定的等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pIpI）。 蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn) pH = pI 凈電荷凈電荷=0 pH pI 凈電荷為負(fù)凈電荷為負(fù) Pr COOH NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- Pr COO- NH2 Pr COO- NH3+ 45教學(xué)運(yùn)用 + + 5.0 6.0 7.0 穩(wěn)定pH梯度 5.0 6.0 7.0 穩(wěn)定pH梯度 通電通電 + + + + + + + + + + + + 電泳現(xiàn)象電泳現(xiàn)象 電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同分子大小不同 的蛋白質(zhì)所帶的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同凈電荷

24、密度不同，遷移率即不同遷移率即不同，在電，在電 泳時(shí)可以分開。泳時(shí)可以分開。 46教學(xué)運(yùn)用 紙電泳（醋酸纖維薄膜電泳法）紙電泳（醋酸纖維薄膜電泳法） 47教學(xué)運(yùn)用 SDS-PAGE凝膠電泳法凝膠電泳法 低濃度濃縮膠低濃度濃縮膠 高濃度分離膠高濃度分離膠 48教學(xué)運(yùn)用 第一章第一章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 1.5 Pr1.5 Pr的結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)構(gòu)和功能 u1.5.11.5.1 Pr Pr的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) u1.5.21.5.2 Pr Pr結(jié)構(gòu)的研究方法結(jié)構(gòu)的研究方法 u1.5.31.5.3 Pr Pr的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性 49教學(xué)運(yùn)用 1.5.1 Pr1.5.1 Pr的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) u、 PrPr結(jié)構(gòu)的結(jié)

25、構(gòu)的一般概念一般概念 u、 PrPr的的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) u、 PrPr的的二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu) u、 PrPr的的超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)和和結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域 u、 PrPr的的三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu) u、 PrPr的的四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)和和PrPr體系體系 u、 維持維持PrPr空間結(jié)構(gòu)的作用力空間結(jié)構(gòu)的作用力 50教學(xué)運(yùn)用 51教學(xué)運(yùn)用 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) （primary structure） 共價(jià)共價(jià)/ /初級結(jié)構(gòu)，包括組成蛋白質(zhì)的多肽初級結(jié)構(gòu)，包括組成蛋白質(zhì)的多肽 鏈的數(shù)目、多肽鏈的氨基酸順序，以及多鏈的數(shù)目、多肽鏈的氨基酸順序，以及多 肽鏈鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。肽鏈鏈內(nèi)或鏈間二

26、硫鍵的數(shù)目和位置。肽肽 鍵鍵是主要連接鍵，多肽鏈?zhǔn)且患壗Y(jié)構(gòu)的主是主要連接鍵，多肽鏈?zhǔn)且患壗Y(jié)構(gòu)的主 體。體。其中最重要是其中最重要是AAAA在肽鏈中的排列順序在肽鏈中的排列順序， 如改變不僅影響蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，而且如改變不僅影響蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，而且 將直接影響其生理功能。將直接影響其生理功能。 52教學(xué)運(yùn)用 肽（鏈肽（鏈）（）（peptide chain） 1 1）2/32/3個(gè)個(gè)AA組成的肽叫組成的肽叫二二/ /三肽三肽；多個(gè)；多個(gè)AA組成的肽叫組成的肽叫 多肽多肽；AAAA借肽鍵連成長鏈稱為借肽鍵連成長鏈稱為肽鏈肽鏈 2 2）肽鏈）肽鏈兩端兩端有自由有自由-NH-NH2 2稱為稱為N-N

27、-末端末端（氨基末端（氨基末端, ,H H）和）和 自由自由-COOH端稱為端稱為C-C-末端末端（羧基末端（羧基末端, ,OH）；有）；有開鏈開鏈 肽肽和和環(huán)鏈肽環(huán)鏈肽； 3 3）構(gòu)成肽鏈的）構(gòu)成肽鏈的AA已殘缺不全，稱為已殘缺不全，稱為氨基酸殘基氨基酸殘基； 4 4）肽鏈中的）肽鏈中的AA排列順序一般排列順序一般-NH2端開始，由端開始，由N N指向指向C C， 即即多肽鏈有方向性多肽鏈有方向性，N N端為頭，端為頭，C C端為尾；端為尾； 5 5）-S-S-S-S-鍵鍵也包括在也包括在一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)中，是連接多肽中，是連接多肽鏈內(nèi)和鏈鏈內(nèi)和鏈 間間的主要橋鍵；二硫鍵數(shù)目越多的主要橋鍵；

28、二硫鍵數(shù)目越多PrPr結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性越強(qiáng)。結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性越強(qiáng)。 53教學(xué)運(yùn)用 N N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端末端：多肽鏈中有自由氨基的一端 C C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端末端：多肽鏈中有自由羧基的一端 多肽鏈有兩端多肽鏈有兩端 氨基酸的順序是氨基酸的順序是N 端端C 端的端的排列順序。如上述五肽可排列順序。如上述五肽可 表示為：表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Glu 絲氨酰酰纈氨酰酰酪氨酰酰天冬氨酰酰谷氨酸酸 COOH 54教學(xué)運(yùn)用 常見二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元有常見二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元有3 3類：規(guī)則的二類：規(guī)則的二 級結(jié)構(gòu)（級結(jié)構(gòu)（-螺旋螺旋、-折疊折疊）、部分規(guī)則）、部分規(guī)則

29、的二級結(jié)構(gòu)（的二級結(jié)構(gòu)（-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角）、無規(guī)則的二級）、無規(guī)則的二級 結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)（無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲）等）等 PrPr二級結(jié)構(gòu)的概念：二級結(jié)構(gòu)的概念：secondary structure, ,多肽多肽 鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)即鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)即主鏈主鏈折疊形成由折疊形成由氫鍵氫鍵 維系的有規(guī)則的構(gòu)象。維系的有規(guī)則的構(gòu)象。 55教學(xué)運(yùn)用 -螺旋螺旋（-Helix）: : 是最常見最典型是最常見最典型 含量最豐富的二級結(jié)構(gòu)元件含量最豐富的二級結(jié)構(gòu)元件 （ secondary structrue element ） A:多個(gè)肽鍵平面通過多個(gè)肽鍵平面通過- -碳原子碳原子旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn), ,主鏈繞主鏈繞 一

30、條固定軸形成一條固定軸形成右手螺旋右手螺旋, ,每隔每隔3.63.6個(gè)個(gè)AA殘殘 基螺旋上升一圈基螺旋上升一圈, ,螺距為螺距為0.54nm, ,每個(gè)每個(gè)AA沿沿 軸上升軸上升0.15nm, ,上升時(shí)每個(gè)上升時(shí)每個(gè)AA沿軸旋轉(zhuǎn)沿軸旋轉(zhuǎn) 100100, ,AAAA側(cè)鏈側(cè)鏈R R分布在螺旋外側(cè)分布在螺旋外側(cè) 56教學(xué)運(yùn)用 57教學(xué)運(yùn)用 B:氫鍵氫鍵（hydrogen bond）相鄰螺圈之間借相鄰螺圈之間借 肽鍵中肽鍵中CO和和N-H形成許多形成許多鏈內(nèi)氫健鏈內(nèi)氫健，即第，即第n n個(gè)個(gè) AA殘基中的殘基中的CO 和后面第和后面第n+4n+4個(gè)個(gè)AA殘基的殘基的N-H 之間形成氫鍵，這是之間形成氫鍵

31、，這是穩(wěn)定穩(wěn)定-螺旋的主要鍵螺旋的主要鍵 CnC(NHCCO)3 NCn+4 OH H R 3.63.613 13 ( (n ns s) ) n n表示螺旋上升一圈的表示螺旋上升一圈的AAAA殘基數(shù)目殘基數(shù)目 S S表示形成一對氫鍵封閉環(huán)內(nèi)共價(jià)結(jié)構(gòu)的表示形成一對氫鍵封閉環(huán)內(nèi)共價(jià)結(jié)構(gòu)的 原子數(shù)目原子數(shù)目 58教學(xué)運(yùn)用 59教學(xué)運(yùn)用 -折疊折疊(-pleated sheets)(-pleated sheets)， 又稱又稱-片層片層, ,是肽鏈比是肽鏈比-螺旋伸螺旋伸 展的重復(fù)性結(jié)構(gòu)展的重復(fù)性結(jié)構(gòu), ,其主要作用力也其主要作用力也 是是氫鍵氫鍵，氫鍵可以在不同肽鏈之，氫鍵可以在不同肽鏈之 間形成間

32、形成, ,也可以在同一肽鏈的不同也可以在同一肽鏈的不同 肽段之間形成；按肽段之間形成；按-折疊的走向折疊的走向 分為分為平行式平行式和和反平行式反平行式兩種。兩種。 60教學(xué)運(yùn)用 C C端端 61教學(xué)運(yùn)用 62教學(xué)運(yùn)用 N1CHC C 2CH NH O=C 3CH N C4CHN R R H O H R R O H O -轉(zhuǎn)角經(jīng)常出轉(zhuǎn)角經(jīng)常出 現(xiàn)在連接反平現(xiàn)在連接反平 行行-折疊片的折疊片的 端頭。端頭。 - -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角(-turn):指指Pr的多肽鏈在形成空間構(gòu)的多肽鏈在形成空間構(gòu) 象時(shí)經(jīng)常會出現(xiàn)象時(shí)經(jīng)常會出現(xiàn)180180 的回折 的回折，回折處的結(jié)，回折處的結(jié) 構(gòu)的柔性介于規(guī)則與無規(guī)則結(jié)構(gòu)

33、之間。構(gòu)的柔性介于規(guī)則與無規(guī)則結(jié)構(gòu)之間。 63教學(xué)運(yùn)用 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu) 無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲random coil:有些多肽區(qū)段有些多肽區(qū)段 具有比部分規(guī)則結(jié)具有比部分規(guī)則結(jié) 構(gòu)更大的柔性構(gòu)更大的柔性, ,形形 成成沒有一定規(guī)律的沒有一定規(guī)律的 松散肽鏈結(jié)構(gòu)松散肽鏈結(jié)構(gòu). .但但 此結(jié)構(gòu)也不是隨機(jī)此結(jié)構(gòu)也不是隨機(jī) 出現(xiàn)的出現(xiàn)的, ,具有特定具有特定 生物功能生物功能. . 無規(guī)則卷曲無規(guī)則卷曲 64教學(xué)運(yùn)用 超二級結(jié)構(gòu)（模體超二級結(jié)構(gòu)（模體/ /花式）花式） Super-secondary structure, , 由由2 2個(gè)或幾個(gè)個(gè)或幾個(gè) 結(jié)構(gòu)單元被連接起來，進(jìn)一步組合

34、成有特結(jié)構(gòu)單元被連接起來，進(jìn)一步組合成有特 殊幾何排列的局域空間結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)層次殊幾何排列的局域空間結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)層次 上高于二級結(jié)構(gòu)上高于二級結(jié)構(gòu), ,但但不具有蛋白質(zhì)的功能不具有蛋白質(zhì)的功能。 常見組合方式有：常見組合方式有：、。 65教學(xué)運(yùn)用 超二級結(jié)構(gòu)類型超二級結(jié)構(gòu)類型 66教學(xué)運(yùn)用 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域 （structural domain） 多肽鏈在二級或超二多肽鏈在二級或超二 級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)局部折疊區(qū)， 是是相對獨(dú)立的緊密球狀實(shí)體相對獨(dú)立的緊密球狀實(shí)體，稱為結(jié)構(gòu)域。，稱為結(jié)構(gòu)域。 其對于一些簡單的球狀蛋白質(zhì)分子來說，還其對于一些簡單的球狀蛋白

35、質(zhì)分子來說，還 是一個(gè)獨(dú)立的功能單位或功能域（是一個(gè)獨(dú)立的功能單位或功能域（fuctional domain） 67教學(xué)運(yùn)用 68教學(xué)運(yùn)用 69教學(xué)運(yùn)用 多肽鏈在二級、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的多肽鏈在二級、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的 基礎(chǔ)再進(jìn)一步折疊，形成基礎(chǔ)再進(jìn)一步折疊，形成包括主、側(cè)鏈包括主、側(cè)鏈 在內(nèi)的專一排布在內(nèi)的專一排布稱為三級結(jié)構(gòu)。此時(shí)分稱為三級結(jié)構(gòu)。此時(shí)分 子內(nèi)能降低結(jié)構(gòu)子內(nèi)能降低結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定更穩(wěn)定。折疊時(shí)的趨勢。折疊時(shí)的趨勢 是大多數(shù)的是大多數(shù)的親水的親水的R側(cè)基側(cè)基分布于球形結(jié)分布于球形結(jié) 構(gòu)的構(gòu)的表面表面，而，而疏水的疏水的R側(cè)基側(cè)基分布于球形分布于球形 結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的內(nèi)部內(nèi)部，形成，形

36、成疏水的核心疏水的核心。 PrPr的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu) （tertiary structure） 70教學(xué)運(yùn)用 肌肌 紅紅 蛋蛋 白白 三三 級級 結(jié)結(jié) 構(gòu)構(gòu) 71教學(xué)運(yùn)用 Mb的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 72教學(xué)運(yùn)用 二條或二條以上具有獨(dú)立的三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈二條或二條以上具有獨(dú)立的三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈 (亞基，亞基，subunit) 彼此借彼此借非共價(jià)鍵（次級鍵）非共價(jià)鍵（次級鍵）相結(jié)相結(jié) 合形成合形成四級結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)。 四級結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)是亞基在空間排列的方式。四級結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)是亞基在空間排列的方式。亞亞 基可以相同（均一四級結(jié)構(gòu)），亦可以不同（非基可以相同（均一四級結(jié)構(gòu)），亦可以不同（非 均一四級結(jié)構(gòu)）均一四

37、級結(jié)構(gòu)） 亞基單獨(dú)存在時(shí)沒有完整的生物活性，亞基單獨(dú)存在時(shí)沒有完整的生物活性，只有形只有形 成完整四級結(jié)構(gòu)的寡聚體才有生物功能。成完整四級結(jié)構(gòu)的寡聚體才有生物功能。 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) （quaternary structure） 以以血紅蛋白血紅蛋白(hemoglobin)為例：為例： 73教學(xué)運(yùn)用 74教學(xué)運(yùn)用 HbHb的四級結(jié)構(gòu)的四級結(jié)構(gòu) 75教學(xué)運(yùn)用 血紅蛋白血紅蛋白 (hemoglobin) 76教學(xué)運(yùn)用 共價(jià)鍵共價(jià)鍵 次級鍵次級鍵 化學(xué)鍵化學(xué)鍵 肽鍵肽鍵 一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) 氫鍵氫鍵 二硫鍵二硫鍵 二、三、四級結(jié)構(gòu)二、三、四級結(jié)構(gòu) 疏水作用疏水作用 鹽鍵鹽鍵 范德華力范

38、德華力 三、四級結(jié)構(gòu)三、四級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子中重要的化學(xué)鍵蛋白質(zhì)分子中重要的化學(xué)鍵 共價(jià)鍵與次級鍵共價(jià)鍵與次級鍵 77教學(xué)運(yùn)用 維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力 離子鍵離子鍵氫鍵氫鍵 范德華力范德華力 疏水相互作用疏水相互作用 78教學(xué)運(yùn)用 維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力 多肽鏈多肽鏈 79教學(xué)運(yùn)用 1.5.2 Pr1.5.2 Pr結(jié)構(gòu)的研究方法結(jié)構(gòu)的研究方法 u1 1、 PrPr分子中分子中多肽鏈數(shù)目的確定多肽鏈數(shù)目的確定 u2 2、 多肽鏈的分離：多肽鏈的分離：肽鏈的拆開肽鏈的拆開、 末端分析末端分析、氨基酸組成分析（離、氨基酸組成分析（離 子交換

39、層析子交換層析自動分析儀）自動分析儀） u3 3、 多肽鏈的降解多肽鏈的降解 4 4、 肽段的分離肽段的分離 u5 5、 肽段氨基酸序列測定肽段氨基酸序列測定 u6 6、 肽段在多肽鏈中肽段在多肽鏈中次序的測定次序的測定 u7 7、 二硫鍵定位二硫鍵定位 80教學(xué)運(yùn)用 1.5.2 Pr1.5.2 Pr結(jié)構(gòu)的研究方法結(jié)構(gòu)的研究方法 根據(jù)根據(jù)PrPr的摩爾數(shù)和其的摩爾數(shù)和其N/C-N/C-末端末端 的摩爾數(shù)相比來確定：一條多的摩爾數(shù)相比來確定：一條多 肽鏈、多條相同多肽鏈、多條肽鏈、多條相同多肽鏈、多條 不同多肽鏈不同多肽鏈p18p18 81教學(xué)運(yùn)用 1.5.2 Pr1.5.2 Pr結(jié)構(gòu)的研究方法

40、結(jié)構(gòu)的研究方法 經(jīng)末端的分析，若該經(jīng)末端的分析，若該P(yáng)r含有兩條以上含有兩條以上 的肽鏈，而且肽鏈之間是通過的肽鏈，而且肽鏈之間是通過非共價(jià)非共價(jià) 鍵鍵連接，使用連接，使用Pr變性劑變性劑（如（如8M尿素、尿素、 6M鹽酸胍）將其鹽酸胍）將其變性后分開變性后分開；若；若Pr肽肽 鏈之間通過鏈之間通過共價(jià)鍵共價(jià)鍵（如二硫鍵）相連，（如二硫鍵）相連， 則可采取則可采取過甲酸氧化法過甲酸氧化法或或巰基乙醇還巰基乙醇還 原法原法將其分開將其分開p18 82教學(xué)運(yùn)用 二硫鍵可被二硫鍵可被氧化劑（過甲酸）氧化劑（過甲酸）或或還原劑還原劑 （巰基化合物（巰基化合物巰基乙醇）巰基乙醇）打開。打開。 H2N-C

41、H-COOH CH2 S S CH2 H2N-CH-COOH 6HCOOOH H2N-CH-COOH CH2 SO3H H2N-CH-COOH CH2 SH 2R-SH + + 6HCOOH R-S-S-R 磺基丙氨酸磺基丙氨酸 83教學(xué)運(yùn)用 1.5.2 Pr1.5.2 Pr結(jié)構(gòu)的研究方法結(jié)構(gòu)的研究方法 鑒定多肽鏈的鑒定多肽鏈的N-和和C-末端殘基末端殘基: N-末端分析：末端分析：丹磺酰氯法丹磺酰氯法、 2， 4二硝基氟苯法二硝基氟苯法、Edman降降 解法、氨肽酶法；解法、氨肽酶法； C-末端分析：末端分析：肼解法肼解法、羧肽酶羧肽酶 法法；p18 84教學(xué)運(yùn)用 H2NCHCOOH + R

42、 N CH3CH3 O=S=O Cl 5-5-二甲氨基萘磺二甲氨基萘磺( (丹丹 磺磺) )酰氯（酰氯（DNS-ClDNS-Cl） pH9.7 40 N CH3CH3 O=S=O HNCHCOOH R DNS-氨基酸氨基酸 (具熒光性具熒光性) 與與丹磺酰氯丹磺酰氯反應(yīng)反應(yīng)靈敏度高的靈敏度高的酰基化酰基化 反應(yīng)，反應(yīng)，常用于測定蛋白質(zhì)常用于測定蛋白質(zhì)N端端AA + HCl 85教學(xué)運(yùn)用 與與2,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)反應(yīng)反應(yīng)sanger 反應(yīng)，反應(yīng)，測定測定Pr的的N端端AA種類種類烴基化反應(yīng)烴基化反應(yīng) DNFBDNFB DNP-AA(黃色黃色) + + HF 弱堿中弱堿中 氨

43、基酸氨基酸 86教學(xué)運(yùn)用 肼解法肼解法：Pr/多肽多肽+NH2NH2 氨基酸氨基酸 肼化物肼化物 C-C-末端末端AAAA 苯甲醛苯甲醛 非水溶性二苯基衍生物非水溶性二苯基衍生物 水溶性水溶性C-C-末端末端AAAA在上清液中在上清液中 離心法離心法 C-C-末端末端AA+DNFBAA+DNFBDNP-AADNP-AA 乙醚乙醚 提取提取層析層析鑒定鑒定 GlnGln、AsnAsn、CysCys等等 被破壞不易測出，被破壞不易測出， ArgArg轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)镺rnOrn。 87教學(xué)運(yùn)用 羧羧 肽肽 酶酶 法法 羧肽酶羧肽酶（carboxypeptidase）是肽鏈外切酶，專）是肽鏈外切酶，專

44、一性地從一性地從C-末端開始逐個(gè)向里切，被末端開始逐個(gè)向里切，被釋放的釋放的AA 數(shù)目和種類隨反應(yīng)時(shí)間而變化數(shù)目和種類隨反應(yīng)時(shí)間而變化 有羧肽酶有羧肽酶A、B、C、Y四種：四種： 羧肽酶羧肽酶A：能釋放：能釋放除除Pro、Arg、Lys之外之外的所有的所有 C-末端殘基；末端殘基； 羧肽酶羧肽酶B：只水解：只水解堿性堿性AA（Arg、Lys）為為C-末末 端殘基的肽鍵；端殘基的肽鍵； 羧肽酶羧肽酶A和羧肽酶和羧肽酶B混合能釋放除混合能釋放除Pro之外的任一之外的任一 C-末端殘基；末端殘基； 羧肽酶羧肽酶Y：可以作用于任一：可以作用于任一C-末端殘基；末端殘基； 88教學(xué)運(yùn)用 1.5.2 Pr

45、1.5.2 Pr結(jié)構(gòu)的研究方法結(jié)構(gòu)的研究方法 常用常用化學(xué)法化學(xué)法和和酶解法酶解法將多肽鏈裂解成較小的將多肽鏈裂解成較小的 肽段肽段 化學(xué)法：化學(xué)法：用用CNBr斷裂，只斷裂斷裂，只斷裂Met形成的肽形成的肽 鍵的鍵的C端一側(cè)端一側(cè)，反應(yīng)加入，反應(yīng)加入70%甲酸，可使卷甲酸，可使卷 曲的多肽鏈松散開來，有利于和曲的多肽鏈松散開來，有利于和CNBr作用作用 酶解法：酶解法：一般用一般用蛋白水解酶蛋白水解酶，是肽鏈內(nèi)切酶，是肽鏈內(nèi)切酶， 能切斷肽鏈內(nèi)部某些能切斷肽鏈內(nèi)部某些AA形成的肽鍵。常用的形成的肽鍵。常用的 有有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、 胃蛋白

46、酶胃蛋白酶等等 89教學(xué)運(yùn)用 a a：胰蛋白酶胰蛋白酶：專一性強(qiáng)，只斷裂：專一性強(qiáng)，只斷裂ArgArg和和LysLys形成的肽形成的肽 鍵的鍵的C C端一側(cè)端一側(cè)，得到的是以，得到的是以ArgArg和和LysLys為為C-C-末端殘基的末端殘基的 肽段，產(chǎn)生的肽段，產(chǎn)生的肽段數(shù)目肽段數(shù)目等于多肽鏈中等于多肽鏈中ArgArg和和LysLys的總的總 數(shù)加數(shù)加1 1。 b b：胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶：作用于：作用于PhePhe、TyrTyr、TrpTrp芳香族芳香族和和 疏水疏水AAAA形成的肽鍵的形成的肽鍵的C C端一側(cè)端一側(cè)，但水解前者速度比后，但水解前者速度比后 者快。者快。最適最適pH8

47、pH89 9。 c c：胃蛋白酶胃蛋白酶：專一性與胰凝乳蛋白酶類似，但要求：專一性與胰凝乳蛋白酶類似，但要求 斷裂點(diǎn)兩側(cè)都是疏水?dāng)嗔腰c(diǎn)兩側(cè)都是疏水AAAA，最適最適pH2pH2，由于二硫鍵在酸，由于二硫鍵在酸 性條件下穩(wěn)定，因此性條件下穩(wěn)定，因此確定二硫鍵位置確定二硫鍵位置常用此酶來水解。常用此酶來水解。 90教學(xué)運(yùn)用 1.5.2 Pr1.5.2 Pr結(jié)構(gòu)的研究方法結(jié)構(gòu)的研究方法 通常用凝膠過濾、凝膠電泳、高通常用凝膠過濾、凝膠電泳、高 效液相色譜等方法分離提純效液相色譜等方法分離提純 用用EdmanEdman化學(xué)降解法化學(xué)降解法、酶解法、根、酶解法、根 據(jù)核苷酸序列推定法來測序據(jù)核苷酸序列推定法來測序 91教學(xué)運(yùn)用 與異硫氰酸苯酯與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)的反應(yīng)Edman反應(yīng)，反應(yīng)，重重 復(fù)測定復(fù)測定Pr多肽鏈多肽鏈N端端AA種類種類（多肽順序自動分析儀）多肽順序自動分析儀） 烴基化反應(yīng)烴基化反應(yīng) PITCPITC + 苯硫乙內(nèi)酰脲苯