公共選修課 腫瘤治療藥物及早期診斷研究概論第三章腫瘤信號轉導通路及相關藥物 查曉明手機mail xmzha 2015年3月1日 1 血管生成與侵襲轉移 血管生成 angiogenesis 是腫瘤生長 轉移 擴散的一個必要條件 它是在原有血管的基礎上 血管內皮細胞以出芽的方式形成血管的過程 血管生成與侵襲轉移 腫瘤轉移 metastasis 是一個復雜 多步驟 連續的主動過程 包括以下幾個步驟 腫瘤細胞間因黏附能力下降而從原發部位脫落 這是腫瘤轉移的開始 腫瘤細胞穿破脈管進入血管或淋巴管 在脈管逃脫血小板及宿主免疫活性細胞的作用而生存 通過與血管或淋巴管內皮和 或 內皮下基底膜作用停留并外滲出脈管 因為內皮基底膜沒有足以使腫瘤細胞自然通過的通道 所以腫瘤細胞需借助膠原酶及蛋白水解酶的水解作用破壞基底膜才能穿出管壁 脫離循環系統的腫瘤細胞在其他部位繼續生長 轉移是惡性腫瘤最本質的表現 良性腫瘤不轉移 只有惡性腫瘤才發生轉移 惡性腫瘤中 只有少數腫瘤不發生或很少發生轉移 如皮膚的基底細胞癌 腦的惡性膠質細胞瘤 應當指出 浸潤是轉移的基礎 1 淋巴道轉移 淋巴道轉移是癌轉移的重要途徑 少數肉瘤如滑膜肉瘤 惡性纖維組織細胞瘤也可發生淋巴道轉移 淋巴道轉移與淋巴引流的方向相同 但少數情況下也可發生跳躍轉移或逆行轉移 瘤細胞侵入淋巴管 隨淋巴液進入局部淋巴結 先聚集在邊緣竇 逐漸累及破壞整個淋巴結 并可進一步轉移到下一站引流淋巴結 最終經胸導管進入體循環 受累的淋巴結腫大 變硬 互相粘連成團 切面灰白而干燥 2 血道轉移 血道轉移是肉瘤轉移的重要途徑 少數癌如腎細胞癌 肝細胞癌 肺癌以及其它癌的晚期也發生血道轉移 肝 肺是兩個血道轉移的靶器官 腫瘤侵入血管 隨血流運行 到達遠隔器官 腫瘤栓子進入門靜脈引起肝轉移 進入體靜脈引起肺轉移 進入肺靜脈引起全身性轉移 進入胸 腰 盆腔靜脈 可通過吻合支 進入脊椎靜脈叢引起脊椎 腦轉移 3 種植性轉移 體腔內器官的腫瘤累及到器官的表面時 瘤細胞可脫落并種植到體腔各器官的表面 形成種植性轉移瘤 腹腔 胸腔最常受累 心包腔 蛛網膜下腔亦可受累 常在漿膜面形成多數轉移結節 很少侵入器官的深層 并常伴血性積液 積液內可查到腫瘤細胞 4 接觸轉移 非常罕見 如下唇腫瘤轉移到上唇的接觸部位 由此可見血管生成不但能為實體瘤提供養分和氧氣 還與腫瘤細胞的轉移有關 而腫瘤侵襲性增強也為血管生成創造一定的有利條件 血管生成與侵襲轉移 血管生長因子信號通路許多肽類生長因子以自分泌或旁分泌的方式誘導血管生成 統稱為血管生長因子 如血管內皮生長因子 VEGF 轉化生長因子 TGF 表皮生長因子 EGF 纖維母細胞生長因子 FGF 血小板衍生生長因子 PDGF 胎盤生長因子 PGF 以及血管生長素 angiogenin 等 其中VEGF在血管發生 病理 生理過程的作用最為重要 其他生長因子雖具有和VEGF相似的活性 但大都通過VEGF發揮作用 VEGF及其受體 VEGF VEGFA VEGFB VEGFC VEGFD PIGF 胎盤生長因子 orfviralVEGF同系物VEGFR VEGFR1 VEGFR2 VEGFR3其中VEGFR2是血管新生和有絲分裂過程主要的VEGF信號轉導受體 屬于蛋白酪氨酸激酶 PTK 超家族 其結構特點是胞內區具有PTK活性域 當受體與細胞因子結合時 受體的PTK功能可被激活 通過磷酸化下游分子誘導血管內皮細胞增殖 VEGF誘發的細胞內信號轉導 血管生長因子信號通路 相關藥物瘤內血管對腫瘤細胞有重要意義 抗血管生成藥物研發已成為腫瘤治療的的熱點之一 目前該類藥物除單克隆抗體藥物如帕尼單抗 貝伐單抗等以外 其余大多是小分子酪氨酸激酶抑制劑 Lapatinib由葛蘭素史克生產 是一種口服的小分子表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑 口服吸收不完全 而且個體差異較大 約4h后達到最大濃度 Cmax 半衰期24h 每日給藥后6 7d達到穩態 Lapatinib拉帕替尼是小分子4 苯胺基喹唑啉類受體酪氨酸激酶抑制劑 抑制表皮生長因子受體 ErbB1 和人表皮因子受體2 ErbB2 Erlotinib可試用于兩個或兩個以上化療方案失敗的局部晚期或轉移的非小細胞肺癌的三線治療 基于國外一項 期臨床研究結果得出 帕唑帕尼 pazopanib 是酪氨酸激酶抑制適應證 帕唑帕尼是一種激酶抑制劑適用于為治療晚期腎細胞癌患者 血管生成與侵襲轉移 腫瘤侵襲轉移化療或放療對早期腫瘤效果較好 因為此時的腫瘤細胞侵襲能力差 易于被殺死 而中晚期腫瘤復發很大程度上是因為有腫瘤細胞轉移至其他組織而產生轉移性腫瘤 據估計約有90 的癌癥病人死于轉移性腫瘤 所以要想最大程度的治愈腫瘤就有必要抑制腫瘤細胞的侵襲轉移能力 腫瘤侵襲轉移 腫瘤轉移是指腫瘤細胞從原發部位經遠程轉移至次發部位的復雜的多步驟過程 腫瘤細胞侵襲轉移有多種誘因 當瘤內缺氧時 會引起Hypoxia表達 導致與細胞生長 血管生成等相關的信號活化 腫瘤細胞侵襲能力增強 因腫瘤細胞過度生長所產生的機械壓力也是誘因之一 壓力通過細胞骨架蛋白傳至細胞內部 激活特定的基因表達 改變細胞的移動能力 腫瘤細胞完成遷移首先需要獲得破壞和重建細胞間及細胞與基質間黏附 破壞基底膜的能力 然后需要提升運動能力 只有這樣才能脫離瘤組織束縛 進入循環系統進而侵入其他組織并繼續分裂增殖 腫瘤侵襲轉移 腫瘤侵襲轉移 細胞內和細胞外的多種細胞因子 蛋白酶 信號轉導通路蛋白 受體都參與了腫瘤細胞轉移的起始和后繼過程 是開發抗腫瘤轉移藥物的有效靶標 胞內主要是信號通路蛋白與跨膜蛋白 如PI3K AKT MAPK VEGFR等胞外包括細胞因子 黏附分子 蛋白酶等 糖復合物 腫瘤細胞表面常可見的糖蛋白 糖脂等糖復合物 腫瘤組織內也有大量分泌型的糖蛋白 糖復合物被認為在腫瘤轉移過程中介導重要的病理過程 如腫瘤細胞黏附 運動等 腫瘤細胞膜表面糖基化作用的改變可通過調節黏附水平易化侵襲性瘤細胞脫離原發瘤組織 還可利用糖復合物配體與凝集素作用 結合在血小板 免疫細胞上 有利于在循環系統中散播 糖復合物 硫酸乙酰肝素糖蛋白 heparansulphateproteoglycans HSPGs 和趨化因子的結合能促使趨化因子梯度分布形成 易化瘤細胞進 出血管和淋巴管 并且許多腫瘤細胞可產生類肝素酶催化HSPGs的肝素鏈水解 其產物不但能促進瘤細胞轉移 還能促進生長因子釋放 因此抑制類肝素酶活性有助于降低腫瘤轉移能力 肝磷酯及其衍生物可抑制類肝素酶活性并阻止HSPGs水解產物與生長因子相互作用 糖復合物 PI 88是酵母細胞膜外硫酸甘露聚糖的衍生物 目前正在進行針對黑色素瘤和多發性骨髓瘤的臨床II期試驗 同時針對肺癌的臨床試驗已進行到 期 模擬肝素酶底物水解的過渡態得到了相對分子質量較小的抑制劑 抑制活性達 mol L 細胞黏附分子 細胞黏附分子是參與細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質 extracellularmatrix ECM 之間相互作用的分子 大致可分為5類 鈣黏素 cadherin 家族 選擇素 selectin 家族 免疫球蛋白 immunoglobulin 超家族 整合素 integrin 家族及其他 如CD44 整合素 FAK信號轉導通路 整合素 integrin 大多為親異性細胞粘附分子 其作用依賴于Ca2 介導細胞與細胞間的相互作用及細胞與細胞外基質間的相互作用 幾乎所有動植物細胞均表達整合素 由 120 185kD 和 90 110kD 兩個亞單位形成的異二聚體 整合素與膜上受體結合后 與胞內肌動蛋白 骨架蛋白等相互作用 形成肌動蛋白應力纖維的膜下終端 再和許多酪氨酸激酶 絲 蘇氨酸激酶作用 最終形成聚焦黏著斑 focaladhesionplaques FAP 其中黏著斑激酶 focaladhesionkinase FAK 的激活是黏著斑發揮效應的中心 FAK酪氨酸殘基磷酸化能通過paxillin Grb2 Cas PI3K及STAT等與信號轉導有關的分子 激活MAPK等多條信號轉導通路 抑制整合素與受體的結合可阻止黏著斑激酶活化 起到抗腫瘤轉移的效果 根據阻斷受體的作用機制不同 可分為抗整合素單克隆抗體和能夠封閉整合素結合位點的拮抗劑兩類 后者包括基于胞外基質蛋白RGD序列的合成多肽和肽類衍生物以及來源于天然生物毒素的解離素 選擇素 selectin 是一類異親型結合 Ca2 依賴的細胞粘著分子 能與特異糖基識別并結合 主要參與白細胞與血管內皮細胞之間的識別與粘著 主要有platelet選擇素 endothelial選擇素 leukocyte選擇素 又稱選擇蛋白 選擇凝集素 是細胞黏附分子中的一個家族 為I型單鏈跨膜糖蛋白 選擇素 selectin 分子結構 1 N端的鈣離子依賴的C型外源凝集素 lectin 結構域 可結合碳水化合物基團 即為選擇素的配體結合部位 2 表皮生長因子 EGF 樣結構域 系維持選擇素構型所必需 3 近膜端的多個補體調節蛋白重復序列 腫瘤細胞需要與血小板 淋巴細胞形成聚合物以逃避免疫細胞的攻擊 并需黏附在內皮細胞上才能滲出毛細血管 而選擇素與腫瘤細胞膜上過量表達的糖復合物結合正是與血小板 淋巴細胞黏附的關鍵過程 選擇素的配體在翻譯后需要進行必要的修飾才能被選擇素識別 這些修飾主要是糖基化 少數還需要在糖基化的基礎上進行糖鏈硫酸化修飾 在高爾基體內經由N2乙酰胺基葡萄糖 半乳糖基 唾液酸基和巖藻糖基化等一系列反應完成糖基化修飾 而巖藻糖基轉移酶 fucosyl2transferases FT 所催化的巖藻糖基化是關鍵的修飾過程 因此催化巖藻糖生成的fucose2generatingFXenzyme也是選擇素配體生成的關鍵酶 考慮到選擇素在腫瘤轉移中的重要地位及其調節機制 可以通過以下途徑進行調控 應用抗體或重組配體與腫瘤細胞膜表面的配體競爭選擇素 從而破壞腫瘤細胞與血小板 淋巴細胞的黏附 模擬巖藻糖基化過程的巖藻糖基供體 受體或酶催化過渡態結構抑制FT 根據配體結構尋找選擇素抑制劑 如一種海洋天然產物巖藻糖硫酸軟骨素也是P L2選擇素的抑制劑 肝磷酯及低相對分子質量類似物也可作為選擇素的抑制劑 但如前所述這類分子同時也具其他作用 可能副作用會比較大 Fucose2generatingFXenzym是選擇素配體生成的關鍵酶 針對其采用和FT抑制劑相似的策略應該也能得到較好的抑制腫瘤轉移藥物 蛋白酶 蛋白酶 proteases 種類較多 主要分為3個家族 絲氨酸蛋白酶 基質金屬蛋白酶 MMPs 半胱氨酸蛋白酶 以各種蛋白為底物 腫瘤細胞的侵襲轉移需要借助蛋白酶的水解作用破壞ECM 脫離原發組織 進而分布到其他部位 MMPs 為基質金屬蛋白酶 基質金屬蛋白酶是一個大家族 其家族成員具有相似的結構 一般由5個功能不同的結構域組成 1 疏水信號肽序列 2 前肽區 主要作用是保持酶原的穩定 當該區域被外源性酶切斷后 MMPs酶原被激活 3 催化活性區 有鋅離子結合位點 對酶催化作用的發揮至關重要 4 富含脯氨酸的鉸鏈區 5 羧基末端區 與酶的底物特異性有關 其中酶催化活性區和前肽區具有高度保守性 MMPs作用機制 Rho信號通路 Rho全稱Ras同系物 rashomo logue 是小相對分子質量G蛋白超家族成員 目前已發現包括Rho RhoA RhoB RhoC Rac Cdc42的3個亞家族共22種成員蛋白 Rho蛋白能夠與GDP GTP結合和水解GTP為GTP酶 使其在活性型與失活型之間循環 Rho信號通路 調節這個循環過程的3類重要蛋白是 鳥苷酸交換因子 guanine nucleotideexchangingfactors GEFS 催化GDP的釋放和GTP的結合 活化RhoGTP酶 GTP酶活化蛋白 GTPaseactivatingprotein GAP 作為負向調節因子加速RhoGTP酶的水解 使RhoGTP酶由活性狀態變為無活性狀態 GDP解離抑制因子 GDPdissociationinhibitor GDI 阻止GDP從RhoGTP酶上分離 抑制RhoGTP酶活性 Rho相關抑制劑 開發抑制RhoGTP酶活性的藥物可從以下幾方面考慮 與Ras蛋白相似 抑制Rho蛋白羧基端可抑制Rho蛋白的活性 抑制鳥苷酸交換因子 直接抑制Rho蛋白 從而使GDP與GTP不能正常交換 或使Rho蛋白與下游靶效應分子不能結合 還可特異性抑制RhoGTP酶的下游靶效應分子ROCK 如ROCK抑制劑Y227632可降低惡性腫瘤細胞的侵襲能力 改變腫瘤細胞侵襲相關性質 DNA RNA與染色體調節 DNA是細胞內一切活動的最終調控者 目前學術界對腫瘤發生機制的認識逐漸趨于一致 即因內外環境因素誘導細胞內DNA突變或染色質倍增 細胞中的原癌基因活化 遺傳行為異常是腫瘤產生的根源 腫瘤細胞內的染色體 DNA總是異于正常細胞 如染色體狀態改變 染色質倍數擴增 基因突變缺失 基因甲基化狀態異常等 這些異常現象表現為增殖等相關蛋白的過度表達等 過量的轉錄因子也以正反饋的方式促進癌基因的轉錄 加速腫瘤進程 DNA甲基化調節DNMT DNAmethyltransferase 轉錄因子 NF B信號轉導通路 染色質調節 HDAC通路 A B C Contents 染色質調節 HDAC通路 HDAC和HAT的動態調節組蛋白去乙酰化酶 histonedeacetylase HDAC 是一類蛋白酶 對染色體的結構修飾和基因表達調控發揮著重要的作用 一般情況下 組蛋白的乙酰化有利于DNA與組蛋白八聚體的解離 核小體結構松弛 從而使各種轉錄因子和協同轉錄因子能與DNA結合位點特異性結合 激活基因的轉錄 HAT為組蛋白乙酰化轉移酶 HAT將乙酰輔酶A的乙酰基轉移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上 HDAC使組蛋白去乙酰化 與帶負電荷的DNA緊密結合 染色質致密卷曲 基因的轉錄受到抑制 HDAC抑制劑 HDAC的催化區由390個氨基酸殘基組成 其活性區域為一個底部較寬的彎曲管狀口袋 通過電荷傳遞移去乙酰基 其中一個重要部分是口袋底部的鋅離子結合位點 對該位點的鋅離子進行螯合是HDAC抑制劑作用機制中的一個重要因素 異羥肟酸 hydroxamicacid 異羥肟酸類HDAC抑制劑 由環 脂肪鏈和異羥肟酸三部分組成 它們分別為表面識別區 連接區和金屬結合區 鋅結合區 異羥肟酸類 hydroxamicacid 在結構上 TSA與SAHA比較相似 但是 TSA對HDAC的抑制活性則要強得多 它們最大的不同在于TSA連接區含有雙烯和一個R型甲基 TSA的表面識別區芳胺環能與酶囊氨基酸殘基相作用也可能是活性高的關鍵之一 將異羥肟酸類化合物的金屬結合區分成A和B兩部分 然后對A和B分別改造 研究其對活性的貢獻 尋找結構優化的方向 以發現活性更強的衍生物 這是異羥肟酸抑制劑的主要研究方向之一 環狀四肽類 cyclictetrapeptide 此類化合物的分子中均含有一個環四肽結構 與HDAC抑制劑藥效團模型 表面識別區 連接區 金屬結合區 一致 氨基酸大環是疏水的表面識別區 烷鏈為連接區 金屬結合區含功能基團 環肽類HDAC抑制劑作用HDAC酶的方式與異羥肟酸類一致 短鏈脂肪酸類 short chainfattyacid 短鏈脂肪酸類HDAC抑制劑結構比較簡單 主要有丁酸 戊酸和苯丁酸及其鹽類化合物 脂肪酸類抑制劑的金屬結合區是其羧酸基團 29 這類藥物的選擇性較差 酶抑制活性較低 在體內代謝也較快 生物利用度低 所以需要在較高濃度下給藥 苯甲酰胺類化合物 benzamides 苯甲酰胺類HDAC抑制劑的金屬結合區是苯甲酰胺基團 如果氨基被取代 則活性喪失 這類抑制劑通常比對應的異羥肟酸類和環肽類化合物活性低 HDACinhibitors DNA甲基化調節DNMT DNA甲基化調節DNMT DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶 DNAmethyl transferase DNMT 的催化下 在胞嘧啶的5位碳原子引入一個甲基 使之變成52甲基胞嘧啶 5 mC 的化學修飾過程 DNMT家族至少包括DNMT1 DN2MT2 DNMT3a和DNMT3b4個成員 DNMT1是最早發現的DNMT 是DNMT家族中最為重要的一員 起著維持甲基化的作用 即根據親本鏈上特異的甲基化位點 在DNA半保留復制出的新生鏈相應的胞嘧啶上進行甲基化修飾的過程 DNMT3亞家族包括DNMT3a和DNMT3b兩個成員 它們的功能主要是參與從頭甲基化 即在沒有甲基化的DNA雙鏈上進行甲基化 從頭甲基化完成后就由維持甲基化來維持其穩定的甲基化狀態 因此正常甲基化模式的建立需要DNMT3 DNMT1的共同作用 DNMT1是DNMT3啟動子CpG島核苷酸從頭甲基化的保證 而DNMT3則使甲基化水平提高到正常需要水平 97 98 DNMT抑制劑 DNMT抑制劑就其作用部位來分 主要有二類 一類是富GC區的DNA嵌入劑一類是直接作用于DNMT的抑制劑 直接作用于DNMT抑制劑 5 氮雜胞苷臨床上用于治療乳腺癌 腸癌 黑色素瘤 急性粒細胞性白血病等有一定療效 直接作用于DNMT抑制劑 地西他濱為一種2 脫氧胞苷類似物 地西他濱有抗腫瘤活性 且表現為劑量相差的雙重機制 高濃度時具有細胞毒作用 低濃度時具有去甲基化作用 作用于增殖期 S期 細胞 與5 氮雜胞苷一樣 此類去甲基化藥物在體內外均能通過抑制DNA甲基轉移酶使抑癌基因恢復正常的去甲基狀態 重新激活那些由于DNA過度甲基化而失活的基因 使細胞恢復正常終末分化 衰老或凋亡 地西他濱抑制DNA甲基化的活性是5 氮雜胞苷的30倍 新型抑制劑 沒食子兒茶素沒食子酸酯 普魯卡因 轉錄因子 NF B信號轉導通路 NF B及其激活途徑NF B為一個轉錄因子蛋白家族 包括5個亞單位 Rel cRel p65 RelA NF B3 RelB和p50 NF B1 p52 NF B2 p65 cRel和RelB分含有N端Rel同源區 Relhomologydomain RHD 和C端的反式激活結構域 transactivationdomain TD 在RHD的C末端有一個核定位區域 nuclear localizationsequence NLS 負責與DNA結合 二聚體化和和核易位 而TD則與轉錄活化相關 NF B信號通路 最基本的NF B信號通路 包括受體和受體近端信號銜接蛋白 I B激酶復合物 I B蛋白和NF B二聚體 當細胞受到各種胞內外刺激后 I B激酶被激活 從而導致I B蛋白磷酸化 泛素化 然后I B蛋白被降解 NF B二聚體得到釋放 然后NF B二聚體通過各種翻譯后的修飾作用而被進一步激活 并轉移到細胞核中 在細胞核里 它與目的基因結合 以促進目的基因的轉錄 NF B經典和非經典通路 NF B的經典信號通路和非經典信號通路的主要區別就在于 在NF B的經典信號通路中 I B蛋白的降解使NF B二聚體得到釋放 而在NF B非經典信號通路中 則是通過P100到P52的加工處理 使信號通路激活 NF B家族 NF B家族由P50 P52 P65 c Rel和RelB五個成員組成 它們分別由NFKB1 NFKB2 RELA REL和RELB基因進行編碼 它們都具有一個N端Rel同源結構域 RHD 負責其與DNA結合以及二聚化 另外 在P65 c Rel和RelB中 存在著轉錄激活區域 TAD 對基因表達起正向調節的作用 P50和P52不存在轉錄激活區域 它們的同型二聚體可以抑制轉錄 NF B二聚體的存在方式 NF B二聚體與I B蛋白結合NF B二聚體與DNA結合NF B二聚體結構 氨基末端為免疫球蛋白相似區域 對某一種形式的 B位點具有選擇性 C 末端疏水區域提供NF B各亞基之間的連接 一般 NF B是以二聚體的形式存在的 而它的二聚體又有兩種存在方式 I B蛋白家族 I B蛋白家族包括七個成員 I B I B I B I B Bcl 3 p100和p105 作用 在細胞質中與NF B二聚體結合 并對信號應答具有重要作用 I B蛋白的結構特點 存在錨蛋白重復區域 即多個緊密相連的鉤狀重復序列 每個重復序列含有33個氨基酸 I B激酶復合物 IKK IKK1 CHUK IKK IKK2 IKBKB 調節亞基NEMO 在特定的NF B信號通路中 IK