第二篇 酶學基礎,第四章 酶的分子結構與催化功能,第一節 酶分子組成,酶,單純酶,結合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子,輔因子,輔酶,與酶蛋白結合得比較松的小分子有機物。,輔基,與酶蛋白結合得緊密的小分子有機物。,金屬激活劑,金屬離子作為輔助因子。,蛋白質具有一級、二級、三級、四級結構以及大分子組織形式。 酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。 輔因子通常是作為電子、原子或某些化學基團的載體。,第二節 酶的結構與功能,酶蛋白的結構,包括一級結構和高級結構,與酶的催化功能密切相關，結構的改變會引起酶催化作用的改變或者喪失。 研究酶結構與功能的關系是酶學的核心課題。,一、酶的活性中心,（一）活性中心 酶蛋白上只有少數氨基酸殘基參與酶對底物的結合和催化，這些相關氨基酸殘基在空間上比較靠近，形成一個與酶顯示活性直接有關的區域（在酶分子表面上具有三維結構的特定區域）,稱為酶的活性中心，又稱活性部位(active site）。 構成活性中心的化學基團實際上就是酶蛋白氨基酸殘基的側鏈，有時尚包括肽鏈末端的氨基酸。 胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ile16、His57、Asp102、Asp194、ser195。在酶原形式時它們分散在一條肽鏈上,但酶原經激活后，形成A、B、C三條肽鏈。前3個殘基在B鏈,后2個在C鏈。依靠肽鏈的折疊，包括肽鏈間的二硫鍵，使這些互相遠離的基團靠近。,(二)必需基團 酶活性中心的一些化學基團為酶發揮催化作用所必需，故稱為必需基團。 在酶活性中心以外的區域，也有不和底物直接作用的必需基團，稱為活性中心外的必需基團。這些基團與維持整個酶分子的空間構象有關，間接地對酶的催化活性發揮作用。,Koshland將酶分子中的氨基酸殘基或其側鏈基團分成四類：,1. 接觸殘基(contact residues) 如R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164和R165。和底物直接接觸,參與底物的化學轉變，是活性中心的主要組成部分。這些殘基中的一個或幾個原子與底物分子的一個或多原子接觸的距離都是一鍵距離(即0.150.2nm)之內。 2. 輔助殘基(auxiliary residues) 如R4，雖未直接與底物接觸，但在使酶與底物相互結合以及在輔助接觸殘基發揮作用上起著一定的作用。輔助殘基也是活性中心一個不可缺少的組成部分。 接觸和輔助殘基組成酶的活性中心。 接觸殘基的側鏈中，有的可能擔負和底物結合的作用, 稱為結合基團；有的可能參與使底物轉變成產物的催化作用，稱為催化基團。 結合基團也可參與催化作用 輔助殘基，因不與底物接觸， 只能參與輔助催化基團的作用，如質子的供給或接受等。,3、結構殘基(structural residues) 如R10、R162、R169等，這些殘基在維持酶蛋白形成一種有規則的空間構象方面起著重要作用。對酶活性的顯示也有一定貢獻，但離底物分子較遠，不能列人活性中心的范圍，屬于活性中心以外的必需基團。 4、非貢獻殘基 (non-contributing residues) 在酶的活性中心外, 不參與酶的催化功能，對酶活性的顯示不起作用。如圖中的R3、R5、R7以及圖中未列入的一些殘基, 這些殘基可以被取代， 甚至把它們去掉也不會對酶的構象和功能產生重大改變。,二、酶的一級結構與催化功能的關系,一級結構是酶的基本化學結構，是催化功能的基礎。一級結構的改變將使酶的催化功能發生相應的改變。,核糖核酸酶在其C末端用羧酸酶去掉3個氨基酸時，對酶的活性幾乎沒有影響，而若用胃蛋白酶去掉C末端的4個氨基酸時，則酶活性全部喪失。,核糖核酸酶，有活性,沒活性,有活性,酶原是活性酶的前體，需經激活才顯示出酶的性。 由酶原轉變為活性酶，可通過酶或氫離子的催化而實現。 胰蛋白酶原在胰蛋白酶或腸激酶的作用下，使酶原變為活性的酶。酶原轉變成酶時，一級結構僅僅發生微小的變化，在碳鏈的N-末端失去了一個六肽，從而使隱蔽的活性基團解放出來,形成了活性部位。,許多酶都存在著二硫鍵。一般二硫鍵的斷裂將使酶變性而喪失其催化功能。但是某些情況下，二硫鍵斷開，而酶的空間構象不受破壞時，酶的活性并不完全喪失；如果使二硫鍵復原，酶又重新恢復其原有的生物活性。,三、酶的二級和三級結構與催化功能的關系,二級、三級結構是所有酶都必須具有的空間結構,是維持酶的活性部位所必須的構型。當酶蛋白的二級和三級結構徹底改變，就可使酶遭受破壞而喪失其催化功能。 二級和三級結構的改變，也可以使酶形成正確的催化部位而發揮其催化功能。由于底物的誘導而引起酶蛋白空間結構發生某些精細的改變，與適應的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發揮其催化功能誘導契合學說的基礎。,1.酶的變性和失活,酶受到變性因素的作用，空間結構破壞，其活性中心的構象也隨著改變，酶因此失活。 有時只要維持酶活性中心各基團的相對位置，即使一級結構受到輕微破壞，酶活性也不會改變。 牛胰核糖核酸酶(RNA酶) 有4對二硫鍵及很多氫鍵維持其空間構象; 活性中心中有兩個組氨酸（His12及His119）。用枯草桿菌蛋白酶處理，被水解成為N端的肽(S肽)和其余的104肽(S蛋白)兩個片段，分別含有His12和His119，兩者單獨存在時均無活力，但在pH7.0的介質中，將兩者1:1混合，并使S肽與S蛋白間形成氫鍵及疏水鍵連接，則20與21位之間的肽鍵雖不能恢復，但活力能恢復。這是因為S肽上的His12又與s蛋白上的His119互相靠近，恢復了原來活性中心的空間構象。,酶蛋白的變性有時是可逆的。當某些化學變性劑去除后，酶可以恢復原有的空間構象，并恢復酶活力。 牛胰核糖核酸酶經尿素及-巰基乙醇處理后發生變性，當透析去除變性劑后，酶可自動折疊成具有催化活性的原始形式。,2.活性中心的撓性,近年來的研究證明：酶蛋白活力的變化和變性時空間構象的改變并不是同步的。 用紫外分光差光譜、熒光光譜、圓二色光譜、光散射和內埋巰基暴露等手段研究肌酸激酶、核糖核酸酶、乳酸脫氫酶及3一磷酸甘油醛脫氫酶等在鹽酸胍和尿素溶液中變性不同時間的構象變化(即肽鏈去折疊的過程)，同時測定酶活力的下降，發現：酶活力的喪失往往先于上述常規手段所測出的酶分子的整體構象變化。 熱變性實驗同樣證明，酶活性喪失在前，整體構象變化在后。,進一步用探測活性中心構象的方法來研究(如3-磷酸甘油醛脫氫酶活性中心的巰基被羧甲基化后再經激發光照，可在活性中心生成具有熒光的NAD共價結合物，可通過熒光改變來探測活性中心的構象變化)，結果發現，活性中心的構象的改變先于酶分子整體的構象改變，而且與活力喪失幾乎同步。 即：酶的活性中心的空間結構相對酶分子整體而言，處于分子中一個撓性的局部區域，是由較弱的化學鍵維持其空間結構，對各種變性因素較為敏感。 低濃度的變性劑在一定條件有時反而使酶激活，也可證明活性中心的可塑性。,3.酶分子的結構域,結構域(domain)是指蛋白質肽鏈中一段較獨立的具有完整、致密立體結構的區域，一般由40400個氨基酸殘基組成。 大多數酶都有一個以上的結構域，如彈性蛋白酶兩個十分類似的結構域，而木瓜蛋白酶則有兩個很不一樣的結構域。結構域在蛋白質肽鏈的折疊和變構調節等現象中具有重要作用。 不同的結構域常有不同的功能。 在大多數蛋白激酶中，兩個不同功能的區結構域一般都存在于一條肽鏈中，形成催化結構域和調節結構域，如cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)，鈣-甘油二酶(佛波酯)一磷脂依賴的蛋白激酶C(PKC)以及具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長因子受體，其調節結構域都位于N側，催化結構域位于C側。,有一些多功能酶，其不同酶活力來自不同的結構域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨酰化的活性，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。 已發現與凝血及纖維蛋白溶解有關的蛋白酶由6種不同的結構域以不同的組合方式裝配而成，包括:一羧基谷氨酸域、表皮生長因子域、三環(kringle)結構域、指(finger)結構域和接觸因子(CF)域以及類胰蛋白酶的催化域。 不同蛋白酶中的相同結構域則往往有相同或類似的功能。可以把結構域看成是酶蛋白中的一個功能單位。 對結構域的研究正方興未艾，將來有可能利用不同的結構域用DNA重組技術組裝成新的人工酶蛋白。,四、酶的四級結構與催化功能的關系,具有四級結構的酶，按其功能可分為兩類：一類與催化作用有關，另一類與代謝調節關系密切。 只與催化作用有關的具有四級結構的酶：由數個相同的亞基組成，每個亞基都有一個活性中心。四級結構完整時，酶的催化功能才會充分發揮出來。當四級結構被破壞時，亞基被分離，若采用的分離方法適當，被分離的亞基仍保留著各自的催化功能。 天冬氨酸轉氨酶用溫和的琥珀酸的方法使四級結構解離時，分離得到的亞基仍各自保持催化功能；當用強烈的條件如酸、堿、表面活性劑等破壞其四級結構時，得到的亞基沒有催化活性。 與代謝調節有關的具有四級結構的酶：其組成亞基中，有的亞基具有調節中心（激活中心和/或抑制中心），使酶的活性受到激活或者抑制，調節酶反應的速度和代謝過程。,第三節 酶催化作用的基本理論,有過各種酶催化學說。早期學說的中心思想是底物的活化，到世紀60年代，隨著新技術的發展，從而亦考慮到在催化反應中，酶本身功能基團的作用。 酶在進行催化反應時，首先和底物形成ES絡合物，這樣分子間的催化反應就變為分子內的催化反應。,一、酶底物復合物,酶與底物結合形成中間復合物（或稱中間絡合物）。 復合物的形成是專一性決定的過程，也是變分子間反應為分子內反應的過程，同時又是誘導契合過程。由于中問復合物的形成，酶和底物的結構都將發生有利于催化反應進行的變化。,（一）酶一底物復合物存在的證據,光譜技術是證明ES復合物存在的有效手段。 醇脫氫酶（ADH）的底物NADH在游離狀態下，于340nm處有一吸收峰，但加入ADH后,吸收峰移向328nm，再加入巰基試劑對氯汞苯甲酸又使吸收峰回到340nm，證明NADH和ADH的結合是通過ADH的巰基介導的。 催化絲氨酸和吲哚合成色氨酸的色氨酸合成酶含有磷酸吡哆醛輔基，后者能在激發下發出熒光。當單加入絲氨酸而尚無吲哚時, 其熒光強度顯著增加，再加入吲哚，就使熒光淬滅，低于單獨酶的熒光，這就證明酶-絲氨酸復合物和酶-絲氨酸-吲哚復合物的存在。,大分子底物和酶的復合物可用電子顯微鏡直接觀察 DNA聚合酶與DNA的復合物。即使小分子底物也可用X射線衍射法獲得酶-底物復合物的信息，如羧肽酶A是通過哪些殘基和底物甘氨酰-L-酪氨酸結合的以及溶菌酶的最小六糖底物是怎樣“躺”在酶分子表面的狹長凹穴中，目前都已研究清楚。 有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結晶，這也是酶一底物復合物的直接證據。 現已充分證明:底物是通過酶的活性中心和酶結合的。,(二)酶與底物形成復合物的作用力,酶與底物的結合與穩定酶分子的三維結構的力是相同的。 1.離子鍵 底物分子上的電荷和酶分子上相反電荷之間的作用, 離子鍵受溶劑、鹽濃度、酶活性部位的微環境以及酶活性部位的側鏈基團等因素的影響。 2.氫鍵 底物和酶結合的一種重要的相互作用力。 酶分子可以在主鏈與側鏈之間以及某些側鏈之間形成氫鍵。氫鍵在水中仍然可以保持，但強度減弱。在酸、堿液中氫鍵不存在。在高溫或各種變性劑的作用下，氫鍵會被破壞。 3.范德華力 一種非專一性的相互作用力，比離子鍵和氫鍵都弱。 酶與底物之間的有效范德華引力作用,，只有在它們相互之間處于立體互補的情況下才能發生作用。在酶和底物的結合過程中，許多原子基團間的范德華引力的總和將會產生相當大的作用。,二、酶的催化作用本質,酶和一般催化劑的共性 用量少而催化效率高； 它能夠改變化學反應的速度，但是不能改變化學反應平衡。酶本身在反應前后也不發生變化。 酶能夠穩定底物形成的過渡狀態，降低反應的活化能，從而加速反應的進行。,一般催化劑 反應活化能,反應總能量變化,酶促反應活化能,非催化反應活化能,初 態,終 態,能 量 改 變,活 化 過 程,酶促反應活化能的改變,過渡態,三、酶作用的專一性機制,（一）酶作用的專一性（底物特異性）（Substrate-specificity）,（1）低特異性（Low specificity）:不能辨別底物，僅能對裂開的鍵表現特異性，如非特異性脂酶。 （2）基團特異性（Group specificity）: 對于相鄰于特定基團的一個特殊的化學鍵表現出特異性。 胰蛋白酶對羧基一側為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現特異性。 O X-NH-CH-C-NH-CH-COOH (精氨酸或賴氨酸) | | R1 R2,。,（3）絕對特異性（Absolute specificity） 酶僅作用于一種底物并催化一個反應。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。,（4）立體化學特異性（Stereochemical specificity） 通常顯示出正確無誤和完全的立體定向性，能區別光學或立體異構體。幾乎總是選擇一對對映體中的一種形式做底物，除非酶的特異功能是催化對映體的異構化。,（二）酶作用的專一性機制,有多種學說，得到廣泛支持的有： 鎖鑰學說 誘導契合學說 過渡態學說 共同點： 酶的作用專一性必須通過它的活性中心和底物結合后才表現出來。,1.鎖鑰學說,1894年，德國有機化學家E.Fisher提出。 酶與底物結合時，酶活性中心的結構與底物的結構必須吻合， 就如同鎖和鑰匙一般，非常配合地結合形成中間復合物)。當中間復合物形成時，會促進底物結構發生某些化學變化(如底物分子的鍵被扭曲)，變形而斷裂，轉變為產物。 可解釋酶的立體化學專一性和底物飽和曲線動力學。,在酶的表面存在著一個特殊形狀的活性部位，這個活性部位在結構上能與底物精確地互補。底物與酶之間存在某種立體專一結合。底物類似鑰匙，酶類似鎖。,獲得相當多的事實支持。 乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解。要求底物中的膽堿氮帶正電，為此可推測：酶分子中至少有一個陰離子部位與酯解部位。事實是，這兩部位間有嚴格的距離，膽堿和酰基間多或少一個-CH2-都不適于作底物或競爭抑制劑，而符合這種鍵長、鍵角要求的化合物都能與該酶發生作用（被酶催化水解或者抑制酶）。 缺點： 認為酶的結構是剛性的， 難以解釋一個酶可以催化正、逆兩個反應，因產物(或逆反應的底物)的形狀、構象和底物完全不同。,2.誘導契合學說,1958年，Koshand提出 酶分子(包括輔酶在內)的構象與底物原來并非恰當吻合，只有底物分子與酶分子相碰時，才可誘導后者的構象變得能與底物配合， 然后才結合形成中間復合物，進而引起底物分子發生相應的化學變化。,誘導楔合模型要點： （a）當底物與酶的活性部位結合時，酶蛋白的幾何形狀有相當大的改變； （b）催化基團的精確定向對于底物轉變成產物是必需的； （c）底物誘導酶蛋白幾何形狀的改變使得催化基團能精確地走向和底物結合到酶的活性部位上去。,A、B催化基團,C結合基團,在用X光衍射法研究溶菌酶、彈性蛋白酶等與底物結合后結構的改變中得到了證實。 能解釋鎖鑰學說不能解釋的實驗事實，但也有局限性： 不是酶的底物或酶的抑制物，不能誘導酶分子的構象發生變化，或即使有少許變化，也不能使酶分子與有關催化基團處于互補契合位置。 實際上，大于底物或小于底物的類似物亦能誘導酶分子的構象發生變化。,3.過渡態學說(transition state theory),Linus Pauling （20世紀40年代）提出的過渡態理論認為：酶與底物的過渡態互補，親和力最強，釋放出結合能使ES的過渡態能級降低，有利于底物分子跨越能壘，使酶促反應大大加速。 “過渡態”是反應物分子處于被激活的狀態，是反應途徑中分子具有最高能量的形式。不同于反應中間物。它只不過是一個短暫的分子瞬間。在這一瞬間分子的某些化學鍵正在斷裂和形成并達到能崩解生成產物或再返回生成反應物的程度。 過渡態學說認為，酶的作用專一性既寓于酶與底物的結合，也寓于酶對底物的催化，酶與底物的結合不僅促成了結合基團和催化基團的正確取位，同時也為下一步酶對底物的催化做了準備。,.表示正在形成和斷裂的化學鍵,乙酸乙酯的水解反應:,過渡態看來:,過渡態是一種變動的分子。,20世紀70年代以來，對很多酶促反應的過渡態類似物(人工設計出的類似過渡態的穩定分子)的研究發現，這些過渡態類似物與酶的結合比底物與酶的結合緊密102106倍，證明了酶與反應過渡態互補的概念是正確的。 過渡態學說涵蓋了對專一性機制和對高效性機制的解說。,第四節 酶在生物體內存在的幾種形式 一、單體酶、寡聚酶和多酶復合物,酶和其他蛋白質一樣，由種L-氨基酸組成,也有特定的氨基酸排列和特定的空間結構。根據酶蛋白分子結構可將酶分為三類。 單體酶 寡聚酶 多酶復合物,（一）單體酶(monomeric enzyme),僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應。,（二）寡聚酶（oligomeric enzyme）,寡聚酶具有四級結構，至少有2個亞基,多的可達60個以上，相對分子質量在3.5萬至百萬以上。組成寡聚酶的亞基可以相同，也可以不同。亞基之間以非共價鍵結合。 有的亞基上有結合基團，叫結合亞基，有的亞基上有催化基團，叫催化亞基。 亞基分離時沒有活性。,（三）多酶復合體(multienzyme complex),多酶復合體是指幾個酶嵌合而成的絡合物，又稱多酶絡合物。一般由26個功能相關的酶組成，有利于生化反應的連續進行，以提高酶的催化效率，同時也便于機體對酶的調控。,二、同工酶（isozyme）,同工酶是指能催化相同的化學反應，但蛋白質分子結構不同的一組酶。 由于蛋白質分子結構不同，各同工酶的理化性質、免疫學性質都存在很多差異。 同工酶不僅存在于同一機體的不同組織中，也存在于同一組織細胞的不同亞細胞結構中。 已陸續發現的同工酶達數百種，其中研究得最多的是乳酸脫氫酶(LDH)。哺乳動物中有5種乳酸脫氫酶同工酶. NAD+ NADH + H+ CH3-CHOH-COOH CH3-CO- COOH 乳酸 丙酮酸,用電泳法分離LDH可得到5種同工酶區帶。都是由H和M二種不同類型的亞基組成的四聚體。,乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜,同工酶的測定可作為某些疾病的診斷指標。 正常人血清LDH主要來自紅細胞滲出，活力很低。當某一組織病變時，血清LDH同工酶電泳圖譜會發生變化。如肝細胞受損早期，LDH總活性在正常范圍內，但LDH5升高；急性心肌病變時，LDHl可升高。,同工酶的測定在食品檢測和鑒別中得到日益廣泛的應用 食用菌菌種純度的同工酶電泳鑒定 利用同工酶對食用菌進行分類研究旨在探求不同菌種的酶譜差異，從而界定其親緣關系，以改善目前市場上食用菌菌種管理混亂、分類不清、甚至同種異名的現狀。 選取目前銷售、應用較為廣泛、代表性強的平菇和香菇菌種，測定其液培菌絲的酯酶和過氧化物酶譜帶。,蜂蜜品質同工酶電泳檢測 比較兩種天然蜂蜜與摻假所用的工業淀粉酶的同工酶電泳，發現天然蜂蜜的淀粉酶同工酶酶譜和工業淀粉酶的同工酶酶譜存在差異。,三、別構酶與修飾酶,別構酶(變構酶)與修飾酶統稱為調節酶。調節酶通常在一連串的反應中催化單向反應，或催化反應速度最慢的反應步驟。其活性的改變可以決定全部反應的總速度，甚至可以改變代謝的方向，故又稱為限速酶(或關鍵酶)。,（一）別構酶（allosteric enzyme）,一類較復雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構中心。 活性中心負責對底物結合和催化，別構中心則與調節催化速度有關。當某些代謝物以非共價方法結合于別構中心部位后，可使酶蛋白的構象發生改變，從而改變酶活性，這種效應稱為別構效應。 可發生別構效應的酶稱為別構酶，可引發別構效應的代謝物稱為別構效應劑。 別構酶通常由多個亞基組成，活性中心和別構中心可分布在不同的亞基，也可分布在同一亞基的不同部位，能結合別構效應劑的亞基為別構亞基。 別構效應劑一般為小分子代謝物，可以是別構酶的底物，也可以是代謝通路上的產物。根據別構效應劑與酶結合后的效果，可將其分為兩類，使酶活性升高者稱為別構激活劑，使酶活性降低者稱為別構抑制劑。 異檸檬酸脫氫酶是別構酶，NAD+、ADP和檸檬酸是該酶的別構激活劑，而NADH和ATP是別構抑制劑。,（二）修飾酶(modification enzyme),1、修飾酶的類型 某些酶能在其他酶的催化下，通過共價鍵可逆結合某種化學基團，從而改變其活性，這種作用稱為共價修飾調節，這類酶稱為共價修飾酶或化學修飾酶。 修飾酶活性的改變是通過共價鍵結合，別構酶活性的改變是通過非共價鍵結合。 修飾酶的共價修飾有磷酸化/脫磷酸化、乙酰化/去乙酰化、腺苷化/去腺苷化、甲基化/去甲基化、-SH/- S-S-等，其中磷酸化/脫磷酸化最為常見。,2、修飾酶的特點,（1）絕大多數修飾酶具有無活性/有活性(或低活性/高活性)兩種形式，催化其正逆兩方向反應的酶不同，且受激素或第二信使的調節。 （2）耗能少 磷酸化/脫磷酸化是最常見的共價修飾。每個亞基磷酸化僅僅需1分子ATP，比生物合成多肽鏈消耗的ATP少得多，速度也快得多。 （3）效率高 由于化學修飾反應一般是酶促反應，且受體內調節因子控制，故對調節信號有快速、放大的效應。體內酶促化學修飾反應往往是連鎖反應，即一種酶經化學修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子進行化學修飾，每修飾一次就產生一次放大效應。因此，極少量的調節因子經化學修飾酶的逐級放大，可產生顯著的生理效應。,環磷腺苷,四、結構酶(組成酶)與誘導酶,根據合成與代謝的關系，將酶相對地分為結構酶和誘導酶。 結構酶(structural enzym)是細胞以恒定速率和恒定數量生成的那些酶類，亦稱組成酶。細胞中天然存在, 含量較穩定， 一般不受外界條件的影響。 誘導酶(induced enzyme)是指細胞中進入特定的誘導物后, 被誘導生成的。其有無及含量的多少受外界條件的影響。 在某