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文檔簡介

1、,Tianjin Medical University,天津醫科大學藥學院體內藥物分析第三章,考馬斯亮藍法（Bradford法）,徐 亮,一、基本原理,酸性溶液兩者結合，使染料溶液的最大吸收峰的位置，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。,二、試劑與器材 試劑： （1）考馬斯亮藍試劑： 考馬斯亮藍G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000ml, 濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 （2）標準蛋白質溶液： 純的牛血清血蛋白，根據其純

2、度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。 2. 器材： （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器,三、操作方法,1、標準曲線的制作,以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標（六個點為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標軸上繪制標準曲線。,2、樣品中蛋白質含量的測定 另取兩支干凈的試管（做一重復），加入合適濃度的待測樣品，使其測定值在標準曲線的范圍內，測定方法同上，由樣品液的吸光度查標準曲線即可求出含量。,四、Bradford法的優缺點,1、優點,（1）靈敏度高：蛋白質染料復合物具有很高的消光系數，因此蛋白質測定的靈敏度較高

3、，最低檢出量為1ug蛋白質。,（2）測定快速、簡便：染料與蛋白質的結合，大約只需2分鐘，結合物的顏色在1小時內是穩定的。,（3）干擾物質少。,2、缺點,四、Bradford法的優缺點,（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時最好選用 球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。,（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH,（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。,五、注意事項,1、 如果要求嚴格，最好在試劑加入后的520min內測定光 吸收，因為這段時間內顏色是最穩定的。 2、 若選擇在旋渦混合器上混合，注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除。,六、思考題,說出你所

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