1、生物樣本分析 島津自動前處理系統 （Co-Sense for BA LCMS ）,藥代動力學研究的內容,藥代動力學應用動力學原理研究藥物吸收、分布、代謝和排泄過程。 藥物劑量與藥理效應的相互關系研究 人體生理及病理狀態對藥物體內過程的影響 藥物制劑的生物利用度測定 藥物相互作用評價 生物樣品包括各種體液和組織,血漿中微量藥物或代謝產物的測定,藥物化學結構的特點,世界藥物索引1999收載 藥物總數：51596 可離子化藥物：62.9%，其中 酸性化合物14.5% 堿性化合物67.5% 兩性化合物18.0% 分子量一般 500 離子化 質譜分析,血漿樣品的特點,基質復雜 選擇性強 待測物含量低 靈

2、敏度高 濃度差異大 線性范圍寬,生物樣品中的藥物分析前處理的要點 除蛋白質，分離純化 濃縮 液液萃取法 固相萃取法 規模縮小的柱色譜法 直接沉淀法 超濾法,血漿樣品加入提取溶媒（酸化或堿化）渦旋離心取上清液吹氮氣濃縮殘渣溶解過濾進樣 色譜分析,樣本前處理一般步驟,藥代動力學研究面臨的挑戰,高效液相色譜法（HPLC）的特點和局限： 靈敏度：定量限一般為 10100 ng/ml，選擇性差 測試速度：每個樣品 1520 min，低通量 對結構分析提供的信息很少 需求： 靈敏度： ng/ml 濃度，高選擇性 制劑生物等效性實驗：5001000 樣品 新藥研究：分析超過 10000 個生物樣品,液相色譜

3、-質譜聯用法的發展,1977年，LC/MS開始投放市場 1978年，LC/MS首次用于生物樣品分析 1991年，API LC/MS用于藥物開發,數據來源：American Society for Mass Spectrometry, 2002,藥物色譜分析中不同方法的比例,1990年,2000年,LC/MS 法測定人血漿中克拉霉素的濃度,克拉霉素(clarithromycin) 紅霉素衍生物 新一代對酸穩定的口服大環內酯類抗生素,以往克拉霉素血藥濃度測定 多采用微生物法 HPLC紫外檢測,克拉霉素,檢測條件 流動相: 0.05%冰醋酸和乙腈（4060 v/v） 流速: 0.2mL/min 色譜

4、柱: Shim-pack ODS 150mm2.0 mm I.D. 5m 柱溫: 40 質譜離子化方式：電噴霧離子化（ESI） 離子極性:Positive； 選擇性離子檢測(SIM): 克拉霉素m/z: 748.5M+H+ 羅紅霉素m/z: 837.5 M+H+ 內標物 14-羥基克拉霉素m/z: 764.5M+H+,血漿樣品的處理 血漿樣品, 內標羅紅霉素, 碳酸鈉溶液堿化后乙醚提取, 上清液用氮氣吹干。最后殘渣乙腈溶解。 方法的專屬性 克拉霉素、內標、14-羥基克拉霉素的保留時間分別為1.93min、1.93min、1.92min,島津自動前處理系統 （Co-Sense for BA LC

5、MS ）,內容,自動前處理的優點與問題 自動前處理系統Co-Sense for BA的特長 采用新型色譜柱和稀釋系統實現了高回收率 使用新型色譜柱的自動濃縮系統實現了高靈敏度 Co-Sense for BA + LCMS系統的特長,背景,樣品前處理是目前分析化學的瓶頸，是分析化學研究的難點和熱點問題之一。由于樣品數量極多，且分析物含量越來越低、基體越來越復雜，迫切要求發展高通量、高選擇性、高效率的在線樣品前處理技術。因此，開展這方面的研究具有極為重要的意義。,HPLC/LC-MS廣泛應用于血漿或血清的代謝物分析和原藥分析，一般的血漿和血清分析，需要對樣本進行預處理，以除去蛋白質，這樣會降低精確

6、度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（restricted access media -RAM）的預柱，可對血漿樣本進行直接分析，而不必進行預處理。這樣，可提高精確度、簡化操作和提高工作效率 。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些問題，需解決的問題：回收率、靈敏度、耐用性。,生物樣品中的藥物分析前處理的要點 除蛋白質 濃縮 手工前處理的問題 處理時間 重現性 藥物回收率,前處理的現狀,除蛋白、濃縮操作自動化的優點 提高分析精度 脫線處理時，難以保持操作完全一致，有時分析精度變差。 提高操作簡便性 脫線處理時需操作熟練 提高處理效率 夜間可自動運行，大幅度地提高了處理效率 前處理自動化的課題

7、 提高回收率及提高濃縮率,自動前處理的優點和課題,提高回收率的手段,有必要使與蛋白質結合的藥物游離出來 與蛋白質結合的藥物，在除蛋白質處理時，藥物也與蛋白質一起被除去，藥物回收率降低。 切斷蛋白質結合（離子結合，疏水結合） 調整樣品導入溶液的pH值 堿性藥物時，使用pH值低的溶液 酸性藥物時，使用pH值高的溶液 調整樣品導入溶液的離子強度 20-100mM的緩沖液濃度 在樣品導入溶液中添加有機溶劑 在20%以內使用有機溶劑（防止由蛋白質的變性而產生的析出） 使用界面活性劑 (*) 從藥物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制藥離子化的pH 值較為理想。,方法,我們研究開發出優質的限制性通路媒介（R

8、AM）預柱，應用柱切換HPLC系統及其在線稀釋旁路系統，可對血漿直接進行藥物分析。 我們的系統 .,回收率 即使是緊密與蛋白質結合的化合物，也能被預柱吸附（捕集）， 并且回收率幾乎達到100% 靈敏度 目標化合物可進行濃縮和分離即使是大體積進樣分析也如此。 不會造成峰值惡化。 耐用性 新設計的涂漬技術和粒徑優化技術，使得數據保持穩定，即使是 長時間的實驗也能如此。,Co-Sense for BA,何謂Co-Sense for BA 用于分析生物樣品的應用系統 具有在線稀釋旁通流路的自動前處理系統和新開發的前處理柱 Shim-Pack MAYl-ODS的組合，實現了真正的血漿（血清）的直接大量注

9、入。 特長 可對應蛋白質結合率高的藥物 使用樣品導入用溶液的在線稀釋的應用，即使是蛋白質結合率高的藥物且在大量注入時 也可有效地捕集，回收率幾乎100%。 超高速進樣和無限接近零的交叉污染。 -使用高效自動進樣器 迅速且有效地除去蛋白 有效地保護分析柱色譜柱和LC/MS的接口 經久耐用的新型柱 通過采用新開發的涂覆技術和粒子徑的最優化，可得到長期穩定數據。,自動前處理系統的基本流路,自動前處理系統的基本流路,通過對樣品導入溶液進行最優化，可提高回收率。 但是，為了提高濃縮效果而大量進樣時的回收率會怎樣呢？,血漿（血清）樣品的大量進樣時的回收率？,因大量進樣，回收率降低。 通過安裝在線稀釋旁通流

10、路，可大量注入血漿（血清）樣品。 這便是Co-Sense的關鍵技術！,樣品處理柱的容量,進樣體積對色譜圖的影響 當進樣體積加大的時候，由于樣品處理柱子容量的限制會發生峰展寬的現象.,100 uL,50 uL,10 uL,不同進樣體積的影響,小體積進樣的時候，預處理柱可捕集幾乎所有的藥物分子 大體積進樣的時候，部分藥物被蛋白帶走，回收率降低,在線稀釋泵提高回收率的原因,在樣品進入預處理柱之前，在線稀釋泵可預先將蛋白和藥物分子分離,Shim-pack MAYI-ODS （RAM）預處理柱,采用Shim-pack MAYI-ODS除蛋白,將硅膠（50m）的外表面用親水性聚合物涂覆，只將細孔內部用十八

11、烷基進行化學修飾。象蛋白質這樣的高分子不能進入細孔內部，并被外表面的親水性聚合物阻擋，不在固定相上保留，很快地洗脫。另一方面，諸如藥物這樣的通常的小分子化合物則浸透到細孔內部，被保留在內部表面的固定相上。,column name ; Shim-pack MAYI-ODS packing material ; silica particle outer surface methyl cellulose inner surface octadecylsilyl group particle size ; 50mm column size ; 4.6mm i.d. x 10mm pH range ;

12、 2 - 7.5 maximum pressure ; 20MPa,涂漬的甲基纖維素表面,藥物,蛋白質,ODS 表面,預處理柱,Co-Sense for BA的流路構成,樣品通過在線稀釋旁通的作用 ，導入溶液自動稀釋，被導入MAYI-ODS前處理柱。在除蛋白的同時，捕集、濃縮藥物,Step1. 除蛋白質的捕集濃縮,分析用高壓梯度泵,分析柱,自動進樣器,前處理柱,在線稀釋旁通,導入樣品泵,檢測器,被MAYI-ODS捕集的藥物，經閥切換，導入分析柱,Step 2. 分析經濃縮的藥物,導入樣品泵,分析用高壓梯度泵,分析柱,自動進樣器,前處理柱,在線稀釋旁通,檢測器,在線自動稀釋用旁通流路的效果,樣品

13、：消炎痛(1 mg/L) 添加血漿 樣品導入液（稀釋液）：0.1磷酸水溶液：乙腈=95：5 注入量：500L 稀釋倍率：8倍 檢測：UV 315nm,用蛋白結合率較高的消炎痛進行評價 無稀釋旁通流路：回收率約50%。 有稀釋旁通流路：回收率幾乎100%,自動濃縮帶來的高靈敏度,樣品：消炎痛(1 mg/L) 添加血漿 無峰形歪斜 樣品導入液（稀釋液）： 0.1%磷酸水溶液：乙腈混合液（95：5） 檢測：UV 315nm,實現高靈敏度,實現高靈敏度的大量注入的穩定性 捕集效率 即使注入血漿500L，回收率也幾乎達到100%。 峰形狀 樣品名：添加消炎痛的血漿,流動相 (樣品導入溶液) ：100mM

14、 醋酸鈉緩沖液 ,血漿樣品中藥物回收率測定,在線自動稀釋用旁通流路的影響,各藥物在有稀釋旁路下的回收率結果 (spiked 2ug/mL each),Table. 血漿樣品中藥物回收率 (spiked 2ug/mL each, 50uLinj.),樣品導入溶液 pH值變化對回收率的影響,樣品導入溶液對回收率的影響 1,Table血漿樣品中各藥物回收率結果 (spiked 0.5ug/mL each (Naproxen:2ug/mL), 50uLinj.),樣品導入溶液對回收率的影響 2,樣品導入溶液 離子強度變化對回收率的影響,Table Recovery of drugs in plasma

15、 (spiked 0.5ug/mL each (Naproxen:2ug/mL), 50uLinj.),樣品導入溶液對回收率的影響 3,樣品導入溶液 乙腈溶劑添加對回收率的影響,出色的柱使用壽命,連續注入時的穩定性 血漿基底的洗脫 從穩定的MAYL-ODS洗脫蛋白質等血漿基底 峰及回收率 穩定的峰形狀及回收率（幾乎100%）,樣品 ：添加異丙基安替比林的血漿 注入量 ：100L 樣品導入液 ：0.1%磷酸水溶液乙腈混合液 稀釋倍數 ：8倍 檢測 ：分析；275nm，血漿基質；280nm,Co-Sense for BA-LCMS系統的特長,通過在Co-Sense for BA系統上連接LCMS-

16、2010EV，成為更強有力的生物樣品分析系統 LCMS所具有的高選擇性檢測，在有復雜的基底的生物樣品的分析中，發揮威力。,何種化合物可用 LC/MS分析?,取決于化合物的離子化效率； 化合物分子自身的極性，結構及其所含的功能基團等因素均會影響離子化情況； 多數具有一定極性的有機化合物可以通過ESI 或APCI的方式離子化，如: 藥物及其代謝產物 天然產物 (生物堿, 配糖物、苷glycosides, taxanes, 毒素, 糖類, 脂類, 維生素等等) 蛋白質，多肽； 殺蟲劑，除草劑 表面活性劑和染料,LC/MS的優勢,強大的定性和選擇性能力 多組份樣品的準確定性； 未充分分離組份峰的鑒別；

17、 消除雜質干擾； 可作為便捷的定性分析 用于合成和衍生反應的研究； 作NMR預分析的質譜鑒定； 廣泛適用于難揮發性化合物的分析 擴展了大氣壓離子化的多種應用,對液相色譜分離組份進行強有力的定性確證,TIC色譜圖 質譜圖,強大的選擇性,未充分分離峰的鑒別,椰子油的分析,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,min,0e6,10e6,20e6,30e6,40e6,50e6,60e6,Int.,m/z 467.5 : C40 DB=1,m/z 495.5 : C42 DB=2,m/z 523.5 : C44 DB=3,TIC,高效液相色譜HPLC與質譜MS的接口技術研究始于

18、1970s ; 大氣壓下的離子化API (atmospheric pressure ionization) 于1987年商品化。 大氣壓下的離子化接口: 電噴霧離子化 Electrospray ionization (ESI)；大氣壓下化學離子化 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) ；大氣壓下光離子化Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI),LC/MS離子化接口,高效液相HPLC,質譜MS,離子化接口,含緩沖鹽的水/有機相； 非揮發性的流動相Non-volatile,高真空狀態 分析離子

19、（m/z）,大氣壓狀態,低真空區域,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,機械泵 渦淪分子泵TMP1 渦淪分子泵TMP2,MS質量分析器,高真空區域,LC/MS系統硬件主要構造,離子源,離子化接口,大氣壓下的離子化API方法的優勢,電噴霧Electrospray(ESI) 適于極性樣品的分析； 推薦使用半微量流速，在霧化氣條件下LC可實現高至 1ml/min的流速； 用該種離子源能形成多電荷離子，擴展了所能檢測的分子量范圍； 大氣壓下化學電離Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI) 低極性化合物；

20、 推薦使用半微量流速，在霧化氣條件下LC流速可實現高至2ml/min； 比熱噴霧具有更好的穩定性； 大氣壓下光電離Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI) 弱極性和非極性化合物 直接APPI離子化及摻雜物APPI離子化方式的正確選擇,LCMS2010EV儀器結構特點,- 干燥氣體 - 保護,TMP 1,TMP 2,旋轉泵,廢液管,檢測器,四極桿,前桿,入口鏡,聚焦鏡,八極,Q-陣列,Skimmer,保護閥,來自LC,霧化氣體,ESI或APCI或APPI源,CDL,干燥氣體,島津QoQ設計,允許流速：0.0011 ml/min； 操作溫度：室溫； 霧

21、化氣流速N2 ：1.5 L/min,高電壓,霧化氣,大氣壓下的離子化(API) 原理 電噴霧離子化 ESI,ESI,液相流出組份,1)帶電液滴,2)溶劑蒸發,3)離子蒸發,大氣壓下的離子化 (API)原理大氣壓下化學離子化 (APCI),高壓放電針,離子-分子反應,允許流速：0.05 2 ml/min 加熱模塊: 400oC 霧化氣流速N2 ： 2.5 L/min,APCI,液相流出組份,霧化氣,大氣壓下的離子化大氣壓下化學離子化 (APCI),LC 流份在霧化氣作用下進入加熱模塊； 流動相蒸發； 高壓放電條件下，質子化溶劑被離子化 (產生反應離子)； 4) 樣品和已產生的反應離子發生離子-分

22、子反應生成質子化分子,離子-分子反應,Schematic diagram of APPI,ESI,APCI,APPI,polarity,Very polar,nonpolar,Molecular Weight,10,000,1,000,100,正離子或負離子模式采集數據?,質譜數據以正離子還是負離子模式采集，需考慮被測樣品結構和特性等 由于C-O、C-N、雙鍵、三鍵及堿性化合物具有較強的質子親和力，上述基團或化合物更傾向于形成正離子； 含COOH, -F, -Cl, -HSO3 的偏酸性化合物由于具有較強的質子給予能力，更傾向于形成負離子； 還有許多化合物既可形成正離子，也能生成負離子；,LC

23、/MS 2010EV的硬件結構,正交設計的離子源,加熱的毛細管,Q-array,八極桿 Octapole,四極桿質量分析器,檢測器,離子轉移,質量過濾,CDL(Curved Desolvation Line )單元和QoQ系統,QoQ系統是一套包含Q- 陣列(Q-array) + 八極桿透鏡(Qctopole lens) +四極桿(Quadrupole)。 這套離子光學系統是島津公司集30年質譜設計、生產經驗的結果，具有優異的離子傳輸和離子會聚性能 。,QoQ 系統介紹,Q-array（Q-陣列） 三排四極板平行排列，形成一錐形區域，使離子能被有效地引入八極桿。,Octopole Lens（八

24、極桿透鏡） 八極桿透鏡實現穩定的離子會聚, 不易受系統真空變化的影響。,Quadrupole（四極桿） 帶有預桿的鉬制雙曲線四極桿系統作為 質量過濾器。預桿保護主四極桿免受污染，并延長使用壽命。島津公司多年來 不斷改進、優化四極桿系統的性能, 最終實現優異的離子傳輸效率，質量數的穩定性和峰形。,Q,Q,O,Q-array中離子軌道示意圖,上圖顯示具有不同入射角度的離子集穿過Q-array的軌跡。離子的運行路線被校正后，匯聚在中心的Skimmer入口處。這一離子運行軌道是依據Optdesign模型（島津研發中心）計算優化得到的。,各種方向運動矢 量的離子集,通過Q-array后的離子集，經會聚作

25、用具有同一矢量,三排四極板成錐形平行排列， 使離子被會聚于一狹窄區域。 這與具有高頻電壓的四極桿工作原理類似。錐形設計提高了離子會聚能力，這也是提高靈敏度的關鍵。 Performance of the Q-array and related optics is up to 10 times more sensitive than other designs.,典型的LC/MS質譜圖,404,341,497,66,82,469,453,57,482,APCI 正離子模式,APCI 負離子模式,Co-Sense for BA-LCMS分析血漿樣品,通過在Co-Sense for BA系統上連接LC

26、MS-2010EV，成為更強有力的生物樣品分析系統 LCMS所具有的高選擇性檢測，在有復雜的基底的生物樣品的分析中，發揮威力。,分析條件,SIM chromatograms of standards,each 1ug/mL, 5uL,重現性,標準 血漿中的藥物,倍他樂克95.0% 普萘洛爾97.4% 利多卡因94.0% 狄布卡因107.7% 布比卡因97.1% each 1ug/mL, 5uL, n=5,回收率,1 :倍他樂克r=0.99954 2 :普萘洛爾r=0.99958 3 :利多卡因r=0.99981 4 :狄布卡因r=0.99978 5 :布比卡因r=0.99986 0.01 1ug/mL, 10uL, n=5, plasma spiked,1,2,3,4,5,校正曲線,提取液中含乙腈對回收率的影響,a. 提取液 : 10mM 乙酸銨/乙腈 = 95/5 b. 提取液 : 10mM 醋酸銨,耐用性 (Chromatogram),0.1mg/mL each, plasma spiked, Injection volume : 50mL, Extraction time : 2min,Column pressure at s