體外分析技術現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展

疾病診斷的革新可在沒有任何臨床癥狀，而病人體內(nèi)發(fā)生

1.基因表達異常；

2.受體分布異常或受體功能改變；

3.器官代謝異常；

4.激素水平異常酶、神經(jīng)遞質(zhì)……等異常，可早期發(fā)現(xiàn)。體外分析和影像學的發(fā)展起了很大作用例如癌癥的早期診斷體外分析技術的主要特點及檢測范圍體外分析法（invitroradioassay）以放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）為代表，是以免疫分析加上放射性“標記”，創(chuàng)立的一種新的體外分析方法。可以測定極微量的生物活性物質(zhì)，主要用于測定患者血清或其他體液樣品內(nèi)的激素、受體位點數(shù)、基因調(diào)控相關物質(zhì)、腫瘤標志物、病毒、酶等。放射免疫分析法的創(chuàng)立

集中了放射性核素示蹤技術的高靈敏度和免疫發(fā)應的高特異性1959美國Yalow&Berson1960英國Ekin’s1977獲諾貝爾醫(yī)學生物學獎開創(chuàng)了醫(yī)學生物學超微量分析方法使人體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的測量成為可能對現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展起到推動作用體外分析技術的主要特點及檢測范圍

RIA具有以下特點：（1）靈敏度高，可分析10-9—10-18g的微量生物活性物質(zhì)。（2）操作簡便，成本低。血清、血漿、體液、組織勻漿等樣品不加提純就可直接測量。

待測物質(zhì)濃度與檢測手段

臨床化學分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitaminsSerumProteins常量微量超微量體外分析技術體外放射分析體外非放射分析放射性競爭結合分析放射性非競爭結合分析放射免疫分析

(RIA)免疫放射分析酶免疫分析化學發(fā)光免疫分析熒光免疫分析(IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)體外分析法的基本原理一是以RIA法為代表，基本原理是競爭性免疫結合反應：以放射核素標記的抗原為示蹤劑，以非標記抗原（標準抗原或待測抗原）為檢測對象，共同與限量的特異性抗體進行競爭性免疫結合反應。由于標記抗原與抗體的結合量（因變量）與非標記抗原的含量（自變量）之間，存在競爭抑制的函數(shù)關系，依據(jù)反映這一函數(shù)關系的標準曲線，求出被測抗原的含量。

體外分析法的基本原理二是非競爭性免疫結合分析，代表方法是免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。基本原理是用過量標記抗體與待測抗原形成復合物，分離除去多余的游離抗體，測量抗原抗體復合物的放射性。

放射免疫分析放射免疫分析法(radioimmunoassay)Dr.Yalow利用標記抗原和非標記抗原競爭結合其特異抗體，反應達到平衡后，分離并分別測定結合的抗原抗體復合物放射性（B）和游離抗原放射性（F），由于B或B/F與非標記抗原的含量之間存在競爭抑制的函數(shù)關系，可以通過曲線求出非標記抗原（待測樣品）含量。滿足該函數(shù)關系的條件（1）標記抗原與非標記抗原具有相同的免疫活性；（2）特異抗體（Ab）與標記抗原（labeledantigen，*Ag）的量是一恒量；（3）Ag+*Ag的分子數(shù)大于抗體的分子數(shù)。這樣才能形成標記抗原和非標記抗原競爭結合其特異抗體的條件。基本原理

Ag-Ab

+Ag*Ag

AbAg++*Ag-Ab

+

*Ag(B)(F)*Ag與Ag

免疫活性相同*Ag＋Ag>

AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++基本方法基本試劑1.抗體2.標記抗原3.非標記標準抗原（標準品）操作基本步驟加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，一般是37℃。分離：選擇好的分離方法分離游離抗原和抗原－抗體復合物。測量：測量游離或結合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標準曲線和待測物濃度的計算。Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456濃度B%標準曲線常用的有B%，B/F，F(xiàn)/B等這些反應變量都可以用作縱坐標來對應標準抗原的濃度作標準曲線，選用的反應變量不同，標準曲線的形狀也不同。但是這些標準曲線都是反映的反應變量對應標準抗原濃度變化而變化的函數(shù)關系。標準曲線

左：橫座標為等份刻度；右：橫座標為對數(shù)刻度

Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？60質(zhì)量控制（qualitycontrol）

1.精密度（precision）

變異系數(shù)（CV）7%~10%2.準確度（accuracy）

回收率=測定值/真實值×100%90%~110%

3.靈敏度（sensitivity）方法的最小可測量4.特異性（specificity）

交叉反應率5.可靠性（validity）平行性試驗6.穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75

ABC

質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。具體作用有：1．檢查誤差的程度，決定測定結果的取舍。2．識別誤差的來源并消除其原因。3．改進測定方法的設計以提高質(zhì)量。

RIA小結靈敏度高特異性好精確的定量方法操作簡便免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）IRMA的基本原理與RIA不同（1）標記抗體抗原抗體反應中，標記抗體是過量的。（2）屬非競爭性結合分析用過量標記抗體與待測抗原形成復合物，分離除去多余的游離抗體，測量抗原抗體復合物的放射性。以抗原抗體復合物的放射性求出非標記抗原的量。免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab

+

*Ab（immunoradiometricassay,IRMA）B%Ag（B）（F）在體外,利用Ag與過量的*Ab的非競爭性結合反應，通過測定放射性復合物的量來計算出Ag量。標記抗體，抗體是過量的。IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別IRMA的特點1IRMA的主要優(yōu)點是靈敏度一般比RIA高。2IRMA的應用目前還主要限于肽類和蛋白質(zhì)，很多小分子半抗原不能應用。3IRMA反應系統(tǒng)對緩沖液PH值及離子強度的要求較嚴格。4當待測抗原的量很高時，抗原含量超過了抗體的結合位點數(shù)，出現(xiàn)抗原抗體復合物反而降低的所謂“倒鉤”現(xiàn)象，遇到這種現(xiàn)象，應當將待測樣品稀釋后再測量。非放射性標記免疫分析技術酶標記免疫分析技術化學發(fā)光免疫分析技術酶標記免疫分析技術

用酶分子代替放射性核素標記抗原或抗體，進行競爭性或非競爭性免疫分析的技術。其中應用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。

是結合了抗原抗體高特異性和酶促反應的高敏感性的檢測技術。

ELISA方法是用酶分子標記抗體，進行與IRMA相似的免疫反應，反應結束后分離結合部分和游離部分，利用結合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計測定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復合物的量成正比。

常用的酶是辣根過氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺

(TMB)，反應后顯黃色。

化學發(fā)光免疫分析技術化學發(fā)光免疫分析技術是以化學發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術。化學發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。1.化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光物質(zhì)作為標記物，標記抗原或抗體，反應以后，利用堿性條件下化學發(fā)光物質(zhì)在氧化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢測光子的數(shù)量就可以反映復合物的量。常用的化學發(fā)光物質(zhì)是異魯米那和吖啶酯。

2.化學發(fā)光酶免疫分析和ELISA相似，用堿性磷酸酶標記抗體，經(jīng)夾心法免疫反應后，帶有酶的復合物作用于特殊的底物--金剛烷，使底物發(fā)射出光子。此法光子發(fā)射持續(xù)時間較長，可靠性比較好。3.電化學發(fā)光免疫分析(略)4.生物發(fā)光免疫分析(略)總結

體外分析的發(fā)展方法設計的改變：競爭結合分析非競爭結合分析，代表方法是免疫放射分析標記物的改變：放射性核素

熒光、酶、化學發(fā)光、稀土元素結合體的改變

微生物——RMA

酶——REA

受體——RRA

特異結合蛋白——CPBA

改變結合體對放射性技術Ag

Ag-Ab

RIA+Ab免疫學技術※Ag

※Ag-Ab

改變標記物第一階段第二階段第三階段小分子半抗原聯(lián)接125I單克隆技術固相技術藥品化Kit理論與實踐上更