首例胚胎移植成功首創動物組織體外培養法發現哺乳動物精子獲能現象體細胞核移植成功試管家兔誕生創立單克隆抗體技術胚胎分割移植成功分離和培養小鼠胚胎干細胞克隆羊多莉誕生獲得誘導多能干細胞單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生我國科學家首次培育了體細胞克隆猴。1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年動物細胞工程的發展歷程科技探索之路第2章細胞工程第2節動物細胞工程情境導入

在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。通過細胞培養構建的人造皮膚1）自身健康皮膚？非常有限免疫排斥反應2）使用他人皮膚？動物細胞培養動物細胞融合動物細胞核移植基礎一、動物細胞培養的概念和原理

p43組織1.概念：

從動物體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后在適當的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術。適宜條件細胞生長和增殖動物體取出單個細胞分散2.原理：原因：細胞分化程度低，分裂能力強，易培養。3.目的：細胞增殖(有絲分裂)獲得細胞或者細胞產物，不能獲得完整動物個體。幼齡動物or老齡動物？動物細胞應該放在什么樣的條件下培養？思考：1、動物細胞培養能不能體現動物細胞的全能性？2、動物細胞培養過程中，遺傳物質是否發生改變？不能不改變﹤動物細胞培養所需基本條件﹤營養條件其他條件糖類氨基酸無機鹽維生素等適宜溫度、pH和滲透壓無菌、無毒的環境適宜的氣體環境思考①直接用合成然培養基嗎？Why？②如何維持無菌、無毒的環境？③適宜的溫度、pH和滲透壓分別是多少？④氣體環境？分別有什么作用？裝置？二、動物細胞培養的條件（1）營養：

合成培養基+一般使用

培養基，也稱為培養液。二、動物細胞培養的條件液體合成培養基血清為什么要添加血清？

人們對細胞所需的營養物質尚未全部研究清楚，在使用合成培養基時，通常需要加入血清等一些天然成分。（2）無菌、無毒的環境：無菌①對

和

進行滅菌處理②在無菌環境下進行操作無毒定期更換培養液以便清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害1.如何防止培養過程中的微生物污染？在細胞培養液中添加一定量的抗生素培養液所有培養用具二、動物細胞培養的條件目的思考（3）溫度、PH、滲透壓：多數動物細胞生存的適宜pH為________①適宜的溫度：36.5±0.5℃7.2-7.4維持細胞正常的形態和功能哺乳動物細胞培養的溫度多以___________為宜；維持適宜滲透壓的目的

。

②適宜的pH：③適宜的滲透壓：二、動物細胞培養的條件（1）氣體的組成及作用細胞代謝所必需(有氧呼吸)維持培養液的pHO2：CO2：（2）具體操作：通常采用培養皿或松蓋培養瓶，置于含有95%空氣和5%

CO2的混合氣體的CO2培養箱中進行培養。培養皿CO2培養箱松蓋培養瓶（4）氣體環境：二、動物細胞培養的條件【合作探究】閱讀教材P44-P45，構建動物細胞培養的流程圖三、動物細胞培養的過程分瓶取動物組織用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理一段時間分散成單個細胞加培養液制成細胞懸液原代培養在培養皿或培養瓶中傳代培養動物胚胎或幼齡動物的組織、器官剪

碎胰蛋

白酶分散成單個細胞加培

養液細胞懸液轉入培養瓶CO2培

養箱原代培養分散、分瓶CO2培養箱傳代培養取動物組織分散成單個細胞CO2培養箱原代培養細胞懸液轉入培養瓶分散、分瓶CO2培養箱傳代培養動物細胞培養的過程（1）取動物組織細胞分化程度低，分裂能力強，易培養動物胚胎或幼齡動物的組織、器官②利于與培養液充分接觸，保證O2與營養供應和代謝物及時排出。選材：原因：①成塊組織中細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長與增殖；（2）分散成單個細胞用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等原因：方法：2.基本過程：三、動物細胞培養的過程分瓶取動物組織分散成單個細胞制成細胞懸液原代培養傳代培養2.基本過程：（2）分散成單個細胞用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等方法：不可以，因為胃蛋白酶最適PH為1.5左右，而動物培養PH條件為7.2-7.4，此條件下，胃蛋白酶失活，不起作用。長時間會分解細胞膜蛋白，破壞細胞結構，注意控制時間和酶用量。①說明動物細胞間的物質主要是什么成分？②用胃蛋白酶可以嗎？③胰蛋白酶處理時間過長，會怎樣？蛋白質最適PH為7.5~8.5分瓶取動物組織分散成單個細胞制成細胞懸液原代培養傳代培養三、動物細胞培養的過程（3）制細胞懸液培養將細胞懸液放入培養皿或培養瓶內，置于適宜環境中培養。操作方法：

酶處理動物組織適宜的時間后，多個細胞被分成單個細胞分散在酶解液中。此時可加入帶血清的培養液終止酶解反應。并在高速離心后，棄掉上清液（胰蛋白酶），留下沉淀物（一堆單個細胞）。

向帶有沉淀物的試管中加入動物細胞培養所用的培養液，振蕩均勻后。分裝到各個培養瓶或者培養皿中，并補充適量的培養液。（4）原代培養指動物組織經處理后的初次培養。概念：分瓶取動物組織分散成單個細胞制成細胞懸液原代培養傳代培養三、動物細胞培養的過程1.動物細胞培養的類型：第1類：懸浮生長細胞第2類：貼壁生長細胞（主流）懸浮培養瓶細胞貼壁現象細胞貼壁：細胞需要貼附于某些基質表面才能生長增殖要求：培養瓶或培養皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。懸浮生長貼壁生長(大多數）細胞密度過大、有害代謝物積累、營養物質缺乏等接觸抑制接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂增殖。解決辦法?（4）原代培養培養到一定時間后，細胞生長受阻原因：膜上糖蛋白等物質減少腫瘤細胞失去接觸抑制，條件適宜在培養液可以無限增殖下去。三、動物細胞培養的過程分瓶取動物組織分散成單個細胞制成細胞懸液原代培養傳代培養①收集細胞貼壁生長類：重新用胰蛋白酶等處理,使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集。②將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養動物細胞的整個培養過程中可能多次用到胰蛋白酶或膠原蛋白酶：第一次使用的目的是

；貼壁細胞傳代培養時使用的目的是

，分散成單個細胞，便于分瓶后傳代培養。直接用離心法收集懸浮生長類：判斷依據：看用胰蛋白酶處理的對象分瓶后的細胞培養。（5）分瓶、傳代培養使組織細胞分散開，便于原代培養使細胞從瓶壁上脫離下來分瓶取動物組織分散成單個細胞制成細胞懸液原代培養傳代培養三、動物細胞培養的過程傳代培養部分細胞的遺傳物質可能會發生變化，增殖緩慢，甚至完全停止大部分細胞衰老死亡少數細胞會克服細胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細胞已經發生了突變，正朝癌細胞發展10~50代繼續培養（50代以后）（有限細胞系）（無限細胞系）目前使用或冷凍保存的細胞通常為

以內，以保持細胞正常的二倍體核型(遺傳物質

)；這一階段的細胞稱為細胞株細胞系的遺傳物質一定改變了；10代不改變Q1:正常細胞能否一直傳代培養下去？

不可以植物細胞培養VS動物細胞培養比較項目植物組織培養動物細胞培養原理培養基性質培養基特有成分培養結果培養目的相同點獲得細胞或細胞產物常用固體培養基植物體葡萄糖、動物血清常用液體培養基細胞增殖細胞的全能性許多細胞快速繁殖等蔗糖、植物激素1.培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂；2.均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件傳代培養（視頻）(1)動物細胞培養時，要將細胞放入95%O2和5%CO2的培養箱中培養()(2)培養保留接觸抑制的細胞在培養瓶壁上可形成多層細胞()(3)懸浮培養的細胞直接用離心法收集，貼壁細胞需要用胰蛋白酶等

處理后再用離心法收集()(4)培養動物細胞的第一代(即第一次細胞增殖)被稱為原代培養()××√×原代培養指動物組織經處理后的初次培養，不一定是第一次細胞增殖。單層細胞;針對訓練1．如圖是動物細胞培養的基本過程示意圖。請據此回答：(1)容器A中放置的材料一般取自______________________________。(2)容器A中的動物器官或組織首先要進行的處理是________，然后在B瓶中用____________________處理使細胞分散開，這樣做的目的是____________________________。(3)動物器官或組織經消化后首先在C瓶中培養，稱為_____培養。當C瓶中的細胞貼滿瓶壁時，可分裝到D瓶和E瓶中繼續培養，該過程中用相應的酶處理后再用培養液將分散的細胞制成___________，然后分裝。(4)一般來說，細胞在傳至10～50代時，增殖會逐漸緩慢，以至于完全停止，當繼續傳代培養時，少數細胞會朝著等同于________(名稱)的方向發展。練習動物胚胎或幼齡動物的器官、組織剪碎胰蛋白酶或膠原蛋白酶使每個細胞能與培養液充分接觸原代細胞懸液癌細胞取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞解決懸浮生長貼壁生長(大多數）細胞密度過大、有害代謝物積累、營養物質缺乏等接觸抑制傳代培養細胞懸液原代培養分瓶培養①原代培養：指動物組織經處理后的初次培養。②細胞貼壁：某些細胞需要貼附于某些基質表面才能增殖，這類細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁上。③接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞停止分裂增殖的現象。④傳代培養：分瓶后的細胞培養。加培養液在培養皿或培養瓶內懸浮培養的細胞:直接用離心法收集貼壁細胞:用胰蛋白酶處理分散成單個細胞，用離心法收集細胞分裂受阻②制成細胞懸液，分瓶培養①收集細胞課堂小結第2章細胞工程第2節動物細胞工程第2課時

干細胞培養及其應用1.什么是干細胞？它有哪些類型？這些類型的干細胞各有怎樣的特點和哪些方面的應用？2.科學家是怎樣獲得iPS細胞的？這種細胞與胚胎干細胞相比，有哪些應用優勢？閱讀教材P46，思考并回答下列問題：一、干細胞培養及其應用(2)分布：(3)分類：動物和人體內仍保留的少數具有分裂和分化能力的細胞。在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。(1)干細胞的概念：干細胞存在于

、

和

等多種組織和器官中。早期胚胎骨髓臍帶血胚胎干細胞成體干細胞按來源全能干細胞多能干細胞按分化潛能專能干細胞一、干細胞培養及其應用2.分類（1）胚胎干細胞（簡稱ES細胞）?分布：?特點：?應用實例：?局限性：存在于

中具有分化為成年動物體內的

類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至

的潛能。目前科學家已分離出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES細胞，在體外培養可分化成心肌細胞、神經元細胞和造血干細胞等細胞。必須從

中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫學上的應用。早期胚胎任何一種個體胚胎一、干細胞培養及其應用（2）成體干細胞?分布：?特點?常見類型存在于

組織或器官內的干細胞造血干細胞神經干細胞精原干細胞發現最早研究最多應用最成熟具有

性，只能分化成

細胞或組織，

發育成完整個體的能力。成體（骨髓、外周血和臍帶血中）（神經系統中）（睪丸中）組織特異特定的不具有?作用：有著自我更新能力

及分化潛能的干細胞，與組織、器官的

、

和

等密切相關。發育再生修復2.分類治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病。造血干細胞→神經干細胞→?概念：通過

誘導小鼠

細胞，獲得了類似胚胎干細胞的一種細胞，稱為誘導多能干細胞?誘導方法：①借助載體將

或

導入細胞（成纖維細胞以及已分化

的

均可）；②用

誘導形成。?誘導多能干細胞優點：①誘導過程

破壞胚胎；②

iPS

細胞可以來源于病人自身的

細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免

反應。體外成纖維（簡稱iPS細胞）特定基因特定蛋白T細胞、B細胞小分子化合物無須體免疫排斥（3）誘導多能干細胞2.分類所以，科學家普遍認為iPS細胞的應用前景優于胚胎干細胞。各種類型細胞導入特定基因導入特定蛋白小分子化合物成纖維細胞T細胞B細胞iPS細胞移植病人取出存在導致腫瘤發生的風險。面臨的問題干細胞將在再生醫學、藥物安全性與有效性檢測等領域發揮大作用。應用展望三、干細胞培養及其應用定向誘導分化治療白血病、帕金森病、阿爾茨海默病等（3）誘導多能干細胞(iPS細胞)三種干細胞的比較

來源或存在功能、特點局限性胚胎干細胞(ES細胞)成體干細胞誘導多能干細胞(iPS細胞)早期胚胎能夠分化成為動物體內的任何細胞，并進一步形成組織、器官甚至生物個體成體組織或器官，如造血干細胞、神經干細胞和精原干細胞等體外誘導體細胞產生能分化成為具有特定功能的細胞來治療疾病。無須破壞胚胎，且避免免疫排斥反應。具有組織特異性，能分化成特定的細胞或組織不具有發育成完整個體的能力需從胚胎中獲取，涉及倫理問題，限制了它在醫學上的應用技術不成熟。【基礎過關】(1)干細胞都是來源于早期胚胎。()(2)造血干細胞是發現最早、研究最多、應用也最為成熟的一類成體干細胞，主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血中。()(3)不同類型的干細胞，它們的分化潛能完全相同。()(4)iPS細胞是一種人工誘導產生的多能干細胞，在治療阿爾茨海默病、心血管疾病領域具有重要的研究價值。()×√×√課堂小結動物細胞培養動物細胞培養的概念和原理動物細胞培養的條件動物細胞培養的過程原理：細胞的增殖在適當的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術(1)營養條件(2)無菌、無毒的環境(3)溫度、pH和滲透壓(4)氣體環境取動物組織單個細胞細胞懸液原代培養傳代培養干細胞培養及其應用干細胞的分布干細胞的類型干細胞的應用胚胎干細胞（ES細胞）成體干細胞早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中主要應用在醫學上誘導多能干細胞一、概念檢測1.判斷下列有關動物細胞培養的表述是否正確。(1)培養環境中需