ICS65.202.30DB12B45天津市地方標(biāo)準(zhǔn)DB12/T952—2020豬糞中抗生素殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法Thedeterminationmethodofantibioticresiduesinpigmanurebyliquidchromatography-massspectrometry天津市市場(chǎng)監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布DB12/T952—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所、天津農(nóng)學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：支蘇麗、張克強(qiáng)、周婧、劉海學(xué)、吳惠惠、杜連柱、阮蓉。IDB12/T952—2020豬糞中抗生素殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬糞中抗生素檢測(cè)的原理、試劑耗材、儀器設(shè)備、試樣制備、檢測(cè)步驟、結(jié)果計(jì)算和精密度。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生豬養(yǎng)殖場(chǎng)畜舍內(nèi)以及堆糞場(chǎng)糞便中土霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、洛美沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、二氟沙星、氟羅沙星、奧比沙星、氟甲喹、西諾沙星和依諾沙星殘留量的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T1896-2010獸藥殘留實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范3樣品中抗生素殘留物用甲醇-乙腈-檸檬酸緩沖溶液提取，用固相萃取小柱凈化，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。4試劑材料4.5EDTA-McIlvaine緩沖液：稱取檸檬酸12.9g，磷酸氫二鈉5.45g，乙二胺四乙酸二鈉37.2g，溶于水中，并稀釋至1L。4.60.1%甲酸溶液：取甲酸（4.4）0.5mL溶于水稀釋至500mL，當(dāng)天配制。4.7標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品（精確到0.00001g），分別用甲醇（4.3）溶解，配制成100mg/L，置于冰箱-20℃保存，保質(zhì)期6個(gè)月。4.8標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱取抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.7）適量，用甲醇水（v/v=50:50）配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（用時(shí)現(xiàn)配）。51DB12/T952—20205.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（ESI源）。5.2分析天平：感量0.00001g和0.01g。5.3旋渦混勻器。5.4超聲波發(fā)生器。5.5離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速不低于5000r/min。5.6移液器。5.7固相萃取裝置。5.8氮?dú)獯蹈蓛x。5.9冷凍干燥器。6試樣制備取適量樣品，將充分的樣品進(jìn)行冷凍干燥并粉碎，粉碎后裝入潔凈容器，并于-18℃避光干燥保存。7檢測(cè)步驟7.1提取稱取1.00g（精確到0.01g）干燥豬糞樣于50mL離心管中，加入10mL乙腈-甲醇-EDTA-McIlvaine緩沖液（1:1:2，v/v/v）混合液，渦旋1.0min，100Hz超聲15min，4℃離心（10000r/min）15min，將上清液吸取到燒杯中，再重復(fù)提取一次，將上清液合并，進(jìn)行適當(dāng)稀釋至有機(jī)相低于10%。凈化首先用6mL甲醇和6mL水，依次活化固相萃取柱，將稀釋過(guò)的上清液混勻，以大約1mL/min的速度通過(guò)活化后的HLB固相萃取柱，待過(guò)完柱子后，用6mL水淋洗，真空抽干柱子，用6mL甲醇洗脫柱子（速度控制在1mL/min左右）。將洗脫液于低于40℃下氮?dú)獯蹈桑?.0mL甲醇:水（1:1，v/v，水含0.1%甲酸）復(fù)溶，0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。在儀器的最佳條件下，經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化的前處理方法提取得到空白糞樣溶液，分別用甲醇:水=1:1溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，配制0、5、10、50、100、200、500、1000μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。分別以目標(biāo)抗生素定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定7.4.1.3流動(dòng)相：A組分是一級(jí)水（含0.1%甲酸）；B組分是乙腈。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。7.4.1.4流速：0.3mL/min。2DB12/T952—2020表1梯度洗脫程序步驟時(shí)間/min流速/（mL/min）組分A/%組分B/%12341.580.30.30.30.390309090107010108.1127.4.2質(zhì)譜參考條件7.4.2.1離子源：電噴霧離子源（ESI）。7.4.2.2掃描方式：正離子掃描。7.4.2.3檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。7.4.2.4離子源溫度：150℃。7.4.2.5脫溶劑氣溫度：500℃。7.4.2.67.4.2.7脫溶劑氣和錐孔氣：氮?dú)狻Ｅ鲎矚猓焊呒儦鍤狻?.4.2.8多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量參見(jiàn)附錄A。7.4.3定性測(cè)定在相同條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果樣品中化合物質(zhì)量色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比在±2.5%的允許偏差之內(nèi)，并且定性離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)表2的規(guī)定，則可判斷樣品中存在相應(yīng)的目標(biāo)化合物。表2≤10%±50%取試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，以色譜峰保留時(shí)間和離子對(duì)定性，讀取試樣色譜峰面積，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。用外標(biāo)法定量。在上述色譜-質(zhì)譜條件下，目標(biāo)抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子的質(zhì)量色譜圖參見(jiàn)附錄B。試樣溶液與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)重新試驗(yàn)或?qū)⒃嚇尤芤汉突|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作相應(yīng)稀釋后重新測(cè)定。8......................................(1)3DB12/T952—2020式中：X——試樣中抗生素的殘留量，μg/kg；c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的抗生素殘留溶液的濃度，ng/mL；v——樣液最終定容體積，mL；m——最終樣液代表的試樣質(zhì)量，g；1000——用于單位換算的常數(shù)。9精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的15%。本方法精密度根據(jù)NY/T1896-2010獸藥殘留實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范規(guī)定的篩選分析方法精密度的性能要求，方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤25%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤30%。4DB12/T952—2020AA附錄A（資料性附錄）目標(biāo)抗生素特征離子參考質(zhì)譜條件表A.1目標(biāo)抗生素特征離子參考質(zhì)譜條件錐孔電壓（V）碰撞電壓（V）保留時(shí)間（min）定量限(μg/kg)名稱母離子251.21256.11265.10311.23254.15362.30360.3子離子磺胺嘧啶sulfadiazine磺胺噻唑92.04/156.02*302834363242314062363836426/163.163.954.235.896.134.594.925.274.574.814.447.395.975.024.585.745.224.833.402.871.253.605.130.471.131.670.250.660.650.170.190.371.480.150.290.20156.00*/92.0214/2630/1636/1828/1842/3019sulfathiazole磺胺甲基嘧啶sulfamerazine磺胺多辛磺胺類91.96/155.95*92.02/156.0*sulfadoxin磺胺噁唑92.04/155.96*sulfamethoxazole氧氟沙星57.95/261.14*ofloxacin恩諾沙星Enrofloxacin二氟沙星316.3/245.2*400.3299.21*/58.0230/4428/3220/3032/2032/1626/1433.4/24.820/2444/3430/5220/28Difloxacin氟羅沙星370.23352.30321.22262氟甲喹202*/244*461.24445.31465.32445.25注：*5DB12/T952—2020BB附錄B（資料性附錄）目標(biāo)抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖西諾沙星（5.97）恩諾沙星（4.92）氟甲喹（7.39）二氟沙星（5.27