第第頁專題22基因工程考點4基因工程的應用及蛋白質工程(2024·浙江1月選考·1，2分)關于生物技術的安全與倫理問題在我國相關法規明令禁止的是()A.試管動物的培育 B.轉基因食品的生產C.治療性克隆的研究 D.生物武器的發展和生產【答案】D我國禁止生物武器的發展和生產。(2023遼寧，8，2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受體。為實時監控CD163蛋白的表達和轉運過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起(如圖)，使其表達成一條多肽。該拼接過程的關鍵步驟是除去()A.CD163基因中編碼起始密碼子的序列B.CD163基因中編碼終止密碼子的序列C.RFP基因中編碼起始密碼子的序列D.RFP基因中編碼終止密碼子的序列【答案】B根據題干信息，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起，如果兩個基因中編碼起始密碼子和終止密碼子的序列完整，將得到兩條多肽，若想只表達出一條多肽，結合圖可知，CD163基因編碼起始密碼子的序列需保留，編碼終止密碼子的序列需除去，使得CD163基因翻譯結束后不停止，繼續合成紅色熒光蛋白RFP，即可得到一條多肽，B正確。(2023浙江1月選考，2，2分)以哺乳動物為研究對象的生物技術已獲得了長足的進步。對生物技術應用于人類，在安全與倫理方面有不同的觀點，下列敘述正確的是()A.試管嬰兒技術應全面禁止B.治療性克隆不需要監控和審查C.生殖性克隆不存在倫理道德方面的風險D.我國不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗【答案】D試管嬰兒技術可以幫助不育夫婦解決生育問題，不應全面禁止，A錯誤；治療性克隆也需要監控和審查，B錯誤；生殖性克隆存在倫理道德方面的風險，C錯誤；我國政府一再重申四不原則:不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗，D正確。(2022浙江1月選考，21，2分)羊瘙癢病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊體內存在蛋白質PrPc，但不發病。當羊感染了PrPSc后，PrPSc將PrPc不斷地轉變為PrPSc，導致PrPSc積累，從而發病。把患瘙癢病的羊組織勻漿接種到小鼠后，小鼠也會發病。下列分析合理的是()A.動物體內的PrPSc可全部被蛋白酶水解B.患病羊體內存在指導PrPSc合成的基因C.產物PrPSc對PrPc轉變為PrPSc具有反饋抑制作用D.給PrPc基因敲除小鼠接種PrPSc，小鼠不會發病【答案】D感染性蛋白粒子PrPSc會將羊體內的PrPc不斷轉變為PrPSc，PrPSc在體內積累從而導致發病，可見動物體內的PrPSc并不會全部被蛋白酶水解，A錯誤；患病羊體內存在指導蛋白質PrPc合成的基因，而PrPSc并不是自身合成的，而是外界感染的，B錯誤；PrPSc在體內積累從而導致發病，說明產物PrPSc對PrPc轉變為PrPSc不具有反饋抑制作用，C錯誤；把患瘙癢病的羊組織勻漿接種到小鼠后，小鼠也會發病，原因是患瘙癢病的羊組織勻漿含有感染性蛋白粒子PrPSc，小鼠體內含有PrPc，PrPc基因敲除小鼠不含PrPc，接種PrPSc后也不會發生使PrPc轉變為PrPSc并積累PrPSc而致病的現象，D正確。(2021北京，14，2分)社會上流傳著一些與生物有關的說法，有些有一定的科學依據，有些違反生物學原理。以下說法中有科學依據的是()A.長時間燉煮會破壞食物中的一些維生素B.轉基因抗蟲棉能殺死害蟲就一定對人有毒C.消毒液能殺菌，可用來清除人體內新冠病毒D.如果孩子的血型和父母都不一樣，肯定不是親生的【答案】A高溫加熱可能會破壞食物中的一些維生素，A有科學依據；轉基因抗蟲棉能產生Bt抗蟲蛋白，殺死害蟲，但對人畜無害，B沒有科學依據；消毒液能殺死人體皮膚表面的微生物，但不能用來清除人體內的新冠病毒，可通過藥物增強人體的免疫能力，通過細胞免疫等清除人體內的新冠病毒，C沒有科學依據；孩子的血型和父母都不一樣，也可能是親生的，如父母的血型分別為A型(IAi)、B型(IBi)，孩子是O型(ii)，D沒有科學依據。(2021遼寧，14，2分)腈水合酶(N0)廣泛應用于環境保護和醫藥原料生產等領域，但不耐高溫，利用蛋白質工程技術在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關敘述錯誤的是()A.N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一B.加入連接肽需要通過改造基因實現C.獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯D.檢測N1的活性時先將N1與底物充分混合，再置于高溫環境【答案】D根據題意可知，與N0相比，N1多了一段連接肽，二者氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一，A正確；利用蛋白質工程改造蛋白質時需對相關基因進行修飾或合成，在N0的結構中加入連接肽需要通過改造相關基因來實現，B正確；獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯，C正確；檢測N1的活性時，需要先將N1與底物置于高溫環境下，再將N1與底物充分混合，D錯誤。(2018浙江4月選考，3，2分)將某種海魚的抗凍基因導入西紅柿細胞中，培育成耐低溫的西紅柿新品種。這種導入外源基因的方法屬于()A.雜交育種B.轉基因技術C.單倍體育種D.多倍體育種【答案】B將某種海魚的抗凍基因導入西紅柿細胞中培育出耐低溫的西紅柿新品種，突破了物種間生殖隔離的障礙，屬于轉基因技術。(2024北京，20，10分)學習以下材料，回答(1)~(4)題。篩選組織特異表達的基因篩選組織特異表達的基因，對研究細胞分化和組織、器官的形成機制非常重要。“增強子捕獲”是篩選組織特異表達基因的一種有效方法。真核生物的基本啟動子位于基因5'端附近，沒有組織特異性，本身不足以啟動基因表達。增強子位于基因上游或下游，與基本啟動子共同組成基因表達的調控序列。基因工程所用表達載體中的啟動子，實際上包含增強子和基本啟動子。很多增強子具有組織特異的活性，它們與特定蛋白結合后激活基本啟動子，驅動相應基因在特定組織中表達(圖A)。基于上述調控機理，研究者構建了由基本啟動子和報告基因組成的“增強子捕獲載體”(圖B)，并轉入受精卵。捕獲載體會隨機插入基因組中，如果插入位點附近存在有活性的增強子，則會激活報告基因的表達(圖C)。獲得了一系列分別在不同組織中特異表達報告基因的個體后，研究者提取每個個體的基因組DNA，通過PCR擴增含有捕獲載體序列的DNA片段。對PCR產物進行測序后，與相應的基因組序列比對，即可確定載體的插入位點，進而鑒定出相應的基因。研究者利用各種遺傳學手段，對篩選得到的基因進行突變、干擾或過表達，檢測個體表型的改變，研究其在細胞分化和個體發育中的作用，從而揭示組織和器官形成的機理。(1)在個體發育中，來源相同的細胞在形態、結構和功能上發生的過程稱為細胞分化，分化是基因的結果。

(2)對文中“增強子”的理解，錯誤的是(單選)。

A.增強子是含有特定堿基序列的DNA片段B.增強子、基本啟動子和它們調控的基因位于同一條染色體上C.一個增強子只能作用于一個基本啟動子D.很多增強子在不同組織中的活性不同(3)研究者將增強子捕獲技術應用于斑馬魚，觀察到報告基因在某幼體的心臟中特異表達。鑒定出捕獲載體的插入位點后，發現位點附近有兩個基因G和H，為了確定這兩個基因是否為心臟特異表達的基因，應檢測。

(4)真核生物編碼蛋白的序列只占基因組的很少部分，因而在絕大多數表達報告基因的個體中，增強子捕獲載體的插入位點位于基因外部，不會造成基因突變。研究者對圖B所示載體進行了改造，期望改造后的載體隨機插入基因組后，在“捕獲”增強子的同時，也造成該增強子所調控的基因發生突變，以研究基因功能。請畫圖表示改造后的載體，并標出各部分名稱。【答案】(1)穩定性差異選擇性表達(2)C(3)斑馬魚各組織細胞中是否存在G、H蛋白或mRNA解析(2)由圖C可知，一個增強子可作用于報告基因的基本啟動子和內源基因的基本啟動子，C錯誤。(3)已觀察到報告基因在心臟中特異表達，說明在該幼體的心臟組織中含有有活性的特異性增強子，而G、H基因在捕獲載體插入位點附近，故可通過檢測斑馬魚其他組織中是否含有G、H基因的表達產物來判斷G、H基因是否為心臟特異表達的基因。(4)若去掉報告基因上游的基本啟動子后報告基因仍能表達，說明其已插入內源基因內部，導致內源基因發生突變，故可通過對比報告基因表達的細胞與非轉基因細胞的功能差異，推測內源基因的功能。改造后的載體圖示詳見【答案】。(2024河北，22，2分)新城疫病毒可引起家禽急性敗血性傳染病，我國科學家將該病毒相關基因改造為r2HN，使其在水稻胚乳特異表達，制備獲得r2HN疫苗，并對其免疫效果進行了檢測。回答下列問題:(1)實驗所用載體的部分結構及其限制酶識別位點如圖1所示。其中GtP為啟動子，若使r2HN僅在水稻胚乳表達，GtP應為啟動子。Nos為終止子，其作用為。r2HN基因內部不含載體的限制酶識別位點。因此，可選擇限制酶和對r2HN基因與載體進行酶切，用于表達載體的構建。

(2)利用方法將r2HN基因導入水稻愈傷組織。為檢測r2HN表達情況，可通過PCR技術檢測，通過技術檢測是否翻譯出r2HN蛋白。

(3)獲得轉基因植株后，通常選擇單一位點插入目的基因的植株進行研究。此類植株自交一代后，r2HN純合體植株的占比為。選擇純合體進行后續研究的原因是。

(4)制備r2HN疫苗后，為研究其免疫效果，對實驗組雞進行接種，對照組注射疫苗溶劑。檢測兩組雞體內抗新城疫病毒抗體水平和特異應答的細胞(細胞毒性T細胞)水平，結果如圖2所示。據此分析，獲得的r2HN疫苗能夠成功激活雞的免疫和免疫。

(5)利用水稻作為生物反應器生產r2HN疫苗的優點是。(答出兩點即可)

【答案】(1)水稻胚乳細胞終止轉錄HindIIIEcoRI(2)農桿菌轉化r2HNmRNA抗原—抗體雜交(3)1/4純合體自交后代不發生性狀分離(4)CD8+T體液細胞(5)不受性別的限制、可大量種植、成本低、安全性高解析(1)利用水稻細胞培育能表達出r2HN的水稻胚乳細胞生物反應器，水稻胚乳細胞啟動子僅在水稻胚乳細胞中被RNA聚合酶識別和結合而驅動轉錄。Nos為終止子，可以終止轉錄。r2HN基因內部不含載體的限制酶識別位點，據圖1分析知，為了將目的基因插入載體的啟動子和終止子之間，則需要用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ對r2HN基因與載體進行酶切。(2)將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法。為檢測r2HN表達情況，可通過PCR技術檢測轉錄的r2HNmRNA。為檢測是否翻譯出r2HN蛋白，可從轉基因水稻中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交。(3)獲得轉基因植株后，通常選擇單一位點插入目的基因的植株(相當于雜合子)進行研究。雜合子自交，后代含有r2HN基因的純合子為1/4。由于純合體自交后代不發生性狀分離，具有遺傳的穩定性，因此選擇純合體進行后續研究。(4)據圖2可知，實驗組的抗體水平和CD8+T細胞水平都比對照組高，說明實驗組的雞通過體液免疫產生了抗體，通過細胞免疫產生了細胞毒性T細胞，即r2HN疫苗能夠成功激活雞的體液免疫和細胞免疫。(5)見【答案】。(2023海南，20，13分)基因遞送是植物遺傳改良的重要技術之一，我國多個實驗室合作開發了一種新型基因遞送系統(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，簡稱CDB法)。圖1與圖2分別是利用常規轉化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。植株A外植體愈傷組織愈傷組織與含重組載體的農桿菌共培養幼苗→轉化植株A圖1植株B植株上半部分浸入含重組載體的農桿菌液植株長出毛狀根陽性毛狀根段幼苗→轉化植株B圖2回答下列問題。(1)圖1中，從外植體轉變成愈傷組織的過程屬于；從愈傷組織到幼苗的培養過程需要的激素有生長素和，該過程還需要光照，其作用是。

(2)圖1中的愈傷組織，若不經過共培養環節，直接誘導培養得到的植株可以保持植株A的。圖1中，含有外源基因的轉化植株A若用于生產種子，其包裝需標注。

(3)圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是。

(4)已知某酶(PDS)缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標記基因)，利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B。據此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發揮作用的方法是，依據是。

(5)與常規轉化法相比，采用CDB法進行基因遞送的優點是(答出2點即可)。

【答案】(1)脫分化細胞分裂素誘導葉綠素的形成，使幼苗能夠進行光合作用(2)遺傳特性轉基因種子(3)農桿菌細胞內含Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移并整合到受體細胞染色體DNA上(4)檢測毛狀根段是否有綠色熒光植物PDS中靶區域測序(或根據PDS基因的堿基序列設計引物進行PCR擴增)若導入幼苗的基因編輯載體成功發揮作用，則PDS基因被敲除，靶區域的測序就會出現序列缺失，(或PCR無法擴增出條帶)(5)不需要無菌操作、不需要進行植物組織培養、操作簡便解析(1)外植體經過脫分化形成愈傷組織，愈傷組織經過再分化形成幼苗，再分化培養基需要有一定比例的生長素和細胞分裂素。葉綠素的形成需要光，故再分化過程中需要適宜的光照以誘導葉綠素的形成。(2)圖1中，若不經過愈傷組織與含重組載體的農桿菌共培養環節，直接誘導培養植株，則獲得的植株遺傳物質全部來自植株A，這種無性繁殖的方式可以保持植株A的遺傳特性。為遵守我國對農業轉基因生物實行的標識制度，需對含有外源基因的轉化植株A生產的種子的包裝標注“轉基因種子”。(3)見【答案】。(4)用含有重組載體的農桿菌液處理植株B后長出的毛狀根中若含有基因編輯載體(陽性毛狀根)，則該基因編輯載體中的綠色熒光蛋白基因可以在毛狀根中表達，故可通過觀察其是否含有綠色熒光篩選陽性毛狀根。若導入幼苗中的基因編輯載體成功發揮作用，則PDS基因被敲除，靶基因測序就會出現序列缺失，或用另一種方法，根據PDS基因的堿基序列設計引物進行PCR擴增，不會出現擴增條帶。(5)對比圖1與圖2知，與常規轉化法相比，用CDB法進行基因遞送不需要進行植物組織培養，不需要無菌操作，操作簡便。(2023湖南，21，13分)某些植物根際促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列問題:(1)若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細菌，培養基的主要營養物質包括水和。

(2)現從植物根際土壤中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌H，其產生的抗菌肽抑菌效果見表。據表推測該抗菌肽對的抑制效果較好，若要確定其有抑菌效果的最低濃度，需在μg·mL-1濃度區間進一步實驗。

測試菌抗菌肽濃度(μg·mL-1)55.2027.6013.806.903.451.730.86金黃色葡萄球菌++枯草芽孢桿菌++禾谷鐮孢菌-++++++假絲酵母-++++++注:“+”表示長菌，“-”表示未長菌(3)研究人員利用解淀粉芽孢桿菌H的淀粉酶編碼基因M構建高效表達質粒載體，轉入大腸桿菌成功構建基因工程菌A。在利用A菌株發酵生產淀粉酶M過程中，傳代多次后，生產條件未變，但某子代菌株不再產生淀粉酶M。分析可能的原因是(答出兩點即可)。

(4)研究人員通過肺上皮干細胞誘導生成肺類器官，可自組裝或與成熟細胞組裝成肺類裝配體，如圖所示。肺類裝配體培養需要滿足適宜的營養、溫度、滲透壓、pH以及(答出兩點)等基本條件。肺類裝配體形成過程中是否運用了動物細胞融合技術?(填“是”或“否”)。

(5)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是一種耐藥菌，嚴重危害人類健康。科研人員擬用MRSA感染肺類裝配體建立感染模型，來探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力。以下實驗材料中必備的是。

①金黃色葡萄球菌感染的肺類裝配體②MRSA感染的肺類裝配體③解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽④生理鹽水⑤青霉素(抗金黃色葡萄球菌的藥物)⑥萬古霉素(抗MRSA的藥物)【答案】(1)淀粉、無機鹽(2)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌1.73~3.45(3)淀粉酶M基因發生突變或含有M基因的表達載體丟失(4)適宜的氣體和無菌、無毒的環境否(5)②③④⑥解析(1)培養基的成分一般包含水、碳源、氮源和無機鹽等營養成分，篩選分解淀粉的固氮細菌所需要的選擇培養基中，除含水、無機鹽外，還應含有淀粉，而不能含有有機氮。(2)從表中數據可以看出，抗菌肽濃度為3.45~55.20μg·mL-1時，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均無法存活，禾谷鐮孢菌和假絲酵母在抗菌肽濃度為55.20μg·mL-1時無法存活，而在抗菌濃度低于27.6μg·mL-1(含)時可存活，故抗菌肽對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制效果較好。抗菌肽濃度為1.73μg·mL-1時，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均能存活，而在3.45μg·mL-1時均不能存活，所以若要確定抗菌肽有抑菌效果的最低濃度，應在1.73~3.45μg·mL-1濃度區間進一步實驗。(3)淀粉酶M基因發生突變或含有M基因的表達載體丟失時，菌株不能再產生淀粉酶M。(4)動物細胞培養除需要滿足適宜的營養、溫度、滲透壓和pH條件外，還需要適宜的氣體環境(95%空氣和5%CO2)以滿足代謝需求和維持培養液pH，以及無菌、無毒的環境防止其他微生物的污染和細胞代謝物的危害。肺類裝配體形成過程涉及兩種或多種細胞的共培養，但并未運用動物細胞融合技術。(5)若要探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力，需至少取三組MRSA感染的肺類裝配體進行培養，第一組加入解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽，第二組加入萬古霉素(作為有抗菌效果的對照)，第三組加入等量生理鹽水(作為無抗菌效果的對照)，觀察并比較三組肺類裝配體的生長情況，若第一組肺類裝配體生長情況明顯好于第三組，且與第二組類似或好于第二組，說明該抗菌肽對MRSA引起的肺炎有治療潛力。(2023全國甲，38，15分)接種疫苗是預防傳染病的一項重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術獲得的乙肝病毒表面抗原(一種病毒蛋白)。回答下列問題。(1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產生乙肝病毒，原因是

。

(2)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是。

(3)目的基因導入酵母細胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細胞中提取進行DNA分子雜交，DNA分子雜交時應使用的探針是

。

(4)若要通過實驗檢測目的基因在酵母細胞中是否表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。【答案】(1)該疫苗不含乙肝病毒DNA，不會在人體細胞內增殖產生乙肝病毒(2)作為標記基因篩選出轉化成功的酵母細胞RNA聚合酶(3)基因組DNA放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段(4)從酵母細胞中提取蛋白質，用乙肝病毒表面抗原的特異性抗體進行抗原—抗體雜交，若有雜交帶出現，說明酵母細胞中表達出目的蛋白。解析(1)只有乙肝病毒的DNA分子進入人體細胞，才能以其為模板進行DNA復制和外殼蛋白的表達，然后裝配形成子代乙肝病毒。重組乙肝疫苗只含有乙肝病毒表面抗原，不含乙肝病毒DNA分子，不會在人體細胞內產生乙肝病毒。(2)載體上的抗生素抗性基因常作為標記基因，用于將成功導入重組基因表達載體的細胞篩選出來。細胞中的RNA聚合酶可識別載體中的啟動子，并以目的基因的一條鏈為模板進行轉錄。(3)由于不能確定目的基因是否插入染色體中，需提取酵母細胞的基因組DNA，加熱變性，用基因探針進行檢測。該探針中需要含有目的基因中的特異性片段，且帶有放射性同位素等標記。若受體細胞的染色體中含有目的基因，該探針就會與目的基因通過堿基互補配對結合在一起，從而在放射性等檢測中觀察到雜交帶。(4)抗乙肝病毒表面抗原的抗體可與乙肝病毒表面抗原特異性結合，故可用該抗體與酵母細胞中提取出來的蛋白質進行抗原—抗體雜交，若出現雜交帶，則可證明酵母細胞中表達出目的蛋白。(2023全國乙，38，15分)GFP是水母體內存在的能發綠色熒光的一種蛋白。科研人員以GFP基因為材料，利用基因工程技術獲得了能發其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類。回答下列問題。(1)構建突變基因文庫。科研人員將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。通常，基因文庫是指。

(2)構建目的基因表達載體。科研人員從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構建表達載體，其模式圖如下所示(箭頭為GFP突變基因的轉錄方向)。圖中①為；②為，其作用是；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標記基因，其作用是。

(3)目的基因的表達。科研人員將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達，發現大腸桿菌有的發綠色熒光，有的發黃色熒光，有的不發熒光。請從密碼子特點的角度分析，發綠色熒光的可能原因是(答出1點即可)。

(4)新蛋白與突變基因的關聯性分析。將上述發黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進行測序，發現其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，實驗思路是。

【答案】(1)將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因(2)終止子啟動子識別和結合RNA聚合酶，驅動基因的轉錄將含有目的基因的細胞篩選出來(3)密碼子的簡并性(4)獲取YFP基因并構建表達載體，導入真核細胞，檢驗其能否發出黃色熒光解析(1)見【答案】。(2)基因表達載體中，啟動子和終止子分別位于目的基因的上游和下游，由圖中GFP突變基因的轉錄方向可判斷，位于目的基因上游的②為啟動子，位于目的基因下游的①為終止子，啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因的轉錄。氨芐青霉素抗性基因屬于標記基因，用于篩選含目的基因的受體細胞。(3)絕大多數氨基酸都有幾個密碼子，若突變后的基因轉錄出的mRNA中的密碼子與原基因序列所對應的密碼子編碼的氨基酸相同，則性狀不發生改變。(4)若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，可用獲得的YFP基因構建表達載體后導入真核細胞內，檢驗受體細胞能否發出黃色熒光。(2023浙江6月選考，23，14分)賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術可提高食物中賴氨酸含量。回答下列問題:(1)植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于。根據這種調節方式，在培養基中添加，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。

(2)隨著轉基因技術與動物細胞工程結合和發展，2011年我國首次利用轉基因和體細胞核移植技術成功培育了高產賴氨酸轉基因克隆奶牛。其基本流程為:①構建乳腺專一表達載體。隨著測序技術的發展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通過檢索獲取其編碼序列，用化學合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動子的相應載體連接，構建出乳腺專一表達載體。

②表達載體轉入牛胚胎成纖維細胞(BEF)。將表達載體包裹到磷脂等構成的脂質體內，與BEF膜發生，表達載體最終進入細胞核，發生轉化。

③核移植。將轉基因的BEF作為核供體細胞，從牛卵巢獲取卵母細胞，經體外培養及去核后作為。將兩種細胞進行電融合，電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了重組細胞發育的作用。

④重組細胞的體外培養及胚胎移植。重組細胞體外培養至，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。

⑤檢測。DNA水平檢測:利用PCR技術，以非轉基因牛耳組織細胞作為陰性對照，以為陽性對照，檢測到轉基因牛耳組織細胞中存在目的基因。RNA水平檢測:從非轉基因牛乳汁中的脫落細胞、轉基因牛乳汁中的脫落細胞和轉基因牛耳組織細胞，提取總RNA，對總RNA進行處理，以去除DNA污染，再經逆轉錄形成cDNA，并以此為，利用特定引物擴增目的基因片段。結果顯示目的基因在轉基因牛乳汁中的脫落細胞內表達，而不在牛耳組織細胞內表達，原因是什么?。

【答案】(1)(負)反饋調節一定濃度的賴氨酸類似物(2)①基因(序列)數據庫②融合③受體細胞激活④桑葚胚或囊胚⑤含酪蛋白基因的牛耳組織細胞DNA酶PCR的模板構建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉錄，而在牛耳組織細胞中不能表達解析(1)一個系統工作的效果反過來抑制該系統的工作稱為負反饋調節，基于此原理，若在培養基中加入一定濃度的賴氨酸類似物作為選擇培養基，就可篩選獲得抗賴氨酸類似物的細胞突變體。(2)①用化學方法合成目的基因時，需要已知其全部序列，所以可以通過基因(序列)數據庫檢索查詢該序列。②利用膜融合的方式可將脂質體包裹的表達載體轉入特定受體細胞。③核移植時常用的受體細胞為去核卵母細胞，攜帶轉基因的BEF(核供體細胞)與受體細胞通過電融合法誘導融合，使供體核進入卵母細胞，形成重組細胞，同時電刺激還可激活重組細胞，使其完成細胞分裂和發育進程。④當重組細胞發育至桑葚胚或囊胚時進行胚胎移植。⑤陽性對照是指含有目的基因的細胞，所以用含酪蛋白基因的牛耳組織細胞作為陽性對照，通過對比判斷目的基因是否導入轉基因牛組織細胞中。可從非轉基因牛乳汁中的脫落細胞、轉基因牛乳汁中的脫落細胞和轉基因牛耳組織細胞中提取總RNA，對總RNA進行DNA酶處理，以除去細胞中的DNA，只剩下RNA，再通過逆轉錄形成cDNA，并以此為模板利用PCR技術擴增DNA檢驗基因是否表達。不同種類細胞中遺傳信息的表達情況不同，含乳腺特異性啟動子的表達載體只在乳腺細胞中表達。(2023廣東，20，14分)種子大小是作物重要的產量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n=10)進行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發現野生型DA1基因發生一個堿基G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據此推測突變體的表型與其有關，開展相關實驗。回答下列問題:(1)擬采用農桿菌轉化法將野生型DA1基因轉入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉基因植株的種子大小應與植株的種子大小相近。

(2)用PCR反應擴增DA1基因，用限制性核酸內切酶對PCR產物和進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備。

(3)轉化后，T-DNA(其內部基因在減數分裂時不發生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點插入的植株，并進一步獲得目的基因穩定遺傳的植株(圖1)，用于后續驗證突變基因與表型的關系。圖1①農桿菌轉化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養基上，能夠萌發并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了。

②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養基，選擇陽性率約%的培養基中幼苗繼續培養。

③將②中選出的T2代陽性植株(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養基，陽性率達到%的培養基中的幼苗即為目標轉基因植株。

為便于在后續研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段，再使用限制性核酸內切酶X切割產物，通過核酸電泳即可進行突變檢測，相關信息見圖2，在電泳圖3中將酶切結果對應位置的條帶涂黑。圖2圖3【答案】(1)野生型(2)基因表達載體(或質粒，或載體)啟動子、終止子(3)①T-DNA片段(或DA1基因，或目的基因)②75③自交100(4)解析(1)野生型DA1基因為顯性基因，若導入成功，轉基因植株的種子大小應與野生型的一致。(2)用農桿菌轉化法進行轉基因需將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，所以需將二者用同種限制酶切割再用DNA連接酶連接。如要目的基因正常表達，其上游要有啟動子驅動轉錄開始，下游要有終止子終止轉錄。(3)①能在選擇培養基上萌發并生長的陽性個體說明其基因組中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。②T0代植株自交后所得的T1代種子若能在選擇培養基上存活，則為導入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的陽性種子，但導入的數量未知，故用T1代植株繼續自交，若某T1代植株為基因組單一位點插入，則其產生的T2代種子在選擇培養基上的存活率(陽性率)為75%。③目標轉基因植株應為純合陽性子代，T2代植株中存在雜合陽性和純合陽性子代，應該用自交的方法篩選，若后代不再出現性狀分離，即陽性率為100%，說明培養基中的幼苗為目標轉基因植株。(4)野生型基因和突變型基因長度均為150bp，野生型基因內部無限制酶X的酶切位點，突變型基因在50bp處有一個限制酶X的酶切位點，所以酶切后野生型出現1個150bp的條帶，而突變型出現100bp和50bp兩個條帶。(2022天津，15，10分)研究者擬構建高效篩選系統，將改進的苯丙氨酸合成關鍵酶基因P1導入谷氨酸棒桿菌，以提高苯丙氨酸產量。(1)如圖是該高效篩選系統載體的構建過程。載體1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB兩個標記基因，為去除篩選效率較低的SacB，應選擇引物和，并在引物的(5'/3')端引入XhoⅠ酶識別序列，進行PCR擴增，產物經酶切、連接后環化成載體2。

(2)PCR擴增載體3中篩選效率較高的標記基因RpsL(鏈霉素敏感基因)時，引物應包含(EcoRⅠ/HindⅢ/XhoⅠ)酶識別序列，產物經單酶切后連接到載體2構建高效篩選載體4。

(3)將改進的P1基因整合到載體4構建載體5。將載體5導入鏈霉素不敏感(由RpsL突變造成)、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導入載體5的菌株，應采用含有的平板進行初步篩選。

(4)用一定的方法篩選出如下菌株:P1基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA，且載體5上其他DNA片段全部丟失。該菌的表型為。

A.卡那霉素不敏感、鏈霉素敏感B.卡那霉素敏感、鏈霉素不敏感C.卡那霉素和鏈霉素都敏感D.卡那霉素和鏈霉素都不敏感(5)可采用技術鑒定成功整合P1基因的菌株。之后以發酵法檢測苯丙氨酸產量。

【答案】(1)14(以上兩空可調換)5'(2)XhoⅠ(3)卡那霉素(4)B(5)PCR(聚合酶鏈式反應，【答案】合理即可)解析(1)結合題圖中載體1分析，要去除SacB區域，應擴增SacB區域外的DNA片段，所選擇的兩種引物應方向相反，且位于擴增部位兩端，故應選引物1和4。由于PCR擴增時，子鏈從引物的3'端開始延伸，因此應在引物的5'端引入合適的限制酶識別序列。(2)根據題圖中構建載體4的過程可知，從載體3擴增出的RpsL片段插入了載體2的XhoⅠ位點，故以載體3為模板擴增RpsL時所需引物應包含XhoⅠ酶識別序列。(3)因受體菌的表型為鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感，載體5上具有RpsL(鏈霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因)，故成功導入載體5的菌株鏈霉素敏感、卡那霉素不敏感，所以，為獲得成功導入載體5的菌株，應利用含有卡那霉素的平板進行初步篩選，選擇平板上出現的菌落即可。(4)P1基因整合到受體菌擬核DNA，且載體5上其他DNA片段全部丟失，所以該菌的表型依然是受體菌的表型，即鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感，故B正確。(5)以受體菌擬核DNA為模板，采用P1基因特異性引物進行PCR擴增，若獲得相應大小片段，即可表明該菌株成功整合了P1基因。(2022重慶，26，15分)改良水稻的株高和產量性狀是實現袁隆平先生“禾下乘涼夢”的一種可能途徑。研究人員克隆了可顯著增高和增產的eui基因，并開展了相關探索。步驟Ⅰ:步驟Ⅱ:(1)花藥培養能縮短育種年限，原因是。在步驟Ⅰ的花藥培養過程中，可產生單倍體愈傷組織，將其培養于含的培養基上，可促進產生二倍體愈傷組織。Ⅰ中能用于制造人工種子的材料是。

(2)步驟Ⅱ中，eui基因克隆于cDNA文庫而不是基因組文庫，原因是；在構建重組Ti質粒時使用的工具酶有。為篩選含重組Ti質粒的菌株，需在培養基中添加。獲得的農桿菌菌株經鑒定后，應侵染Ⅰ中的，以獲得轉基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鑒定方法是，移栽后若發育為更高且豐產的稻株，則可望“禾下乘涼”。

【答案】(1)花藥培養獲得的單倍體經秋水仙素處理后所得植株均為純合子，后代不會發生性狀分離秋水仙素胚狀體(2)cDNA文庫是由編碼蛋白質的mRNA逆轉錄來的基因導入受體菌群而獲得的，在cDNA文庫中容易篩選獲得目的基因限制酶和DNA連接酶抗生素愈傷組織DNA分子雜交技術解析(1)花藥離體培養可獲得單倍體，再經秋水仙素處理后所得植株均為純合子，后代不會發生性狀分離，所以可以明顯縮短育種年限。秋水仙素能抑制紡錘體的形成，從而引起細胞內染色體數目加倍，故將單倍體愈傷組織培養于含秋水仙素的培養基上，可促進產生二倍體愈傷組織。胚狀體可分化形成根、芽，常用于制造人工種子。(2)cDNA文庫是由編碼蛋白質的mRNA逆轉錄來的基因導入受體菌群獲得的，而基因組文庫包含了本物種的全部基因，在cDNA文庫中容易篩選獲得目的基因。在構建重組Ti質粒時，需使用一定的限制酶切割質粒，再使用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段，之后再用DNA連接酶將目的基因和質粒連接成重組質粒。重組Ti質粒中含有抗生素抗性基因，在培養基中添加抗生素可以篩選獲得含重組Ti質粒的菌株。將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法，用含eui基因的農桿菌侵染愈傷組織，可將eui基因導入愈傷組織，獲得轉基因再生植株。可采取DNA分子雜交技術檢測再生植株是否含有eui基因。知識拓展cDNA文庫與基因組文庫cDNA是用某種生物發育的某個時期的mRNA逆轉錄產生的多種互補DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群體稱為cDNA文庫。基因組文庫是將某種生物的DNA全部提取出來，選用適當的限制酶切成一定范圍大小的DNA片段，再將這些DNA片段分別與載體連接后導入受體菌群獲得的。(2022廣東，22，12分)“綠水逶迤去，青山相向開”，大力發展低碳經濟已成為全社會的共識。基于某些梭菌的特殊代謝能力，有研究者以某些工業廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業)為原料，通過厭氧發酵生產丙酮，構建一種生產高附加值化工產品的新技術。回答下列問題:(1)研究者針對每個需要擴增的酶基因(如圖)設計一對，利用PCR技術，在優化反應條件后擴增得到目標酶基因。

(2)研究者構建了一種表達載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是，終止子的作用是。

(3)培養過程中發現重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現了生長遲緩的現象，推測其原因可能是，此外丙酮的積累會傷害細胞，需要進一步優化菌株和工藝才能擴大應用規模。

(4)這種生產高附加值化工產品的新技術，實現了，體現了循環經濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術的優勢在于，具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。

【答案】(1)引物(2)便于篩選含有目的基因的受體細胞使轉錄在所需要的地方停下來(3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物質和能量(4)廢棄物的資源化減少了碳排放解析(1)利用PCR技術擴增目的基因的前提是已知目的基因兩端的核苷酸序列，根據這一序列設計并合成一對引物。(2)抗生素抗性基因作為標記基因，作用是鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來。終止子相當于一盞紅色信號燈，位于基因的下游，可使轉錄在所需要的地方停下來。(3)酶蛋白的大量合成消耗大量的物質和能量，導致重組梭菌用于自身生長、繁殖的物質和能量減少，菌體生長遲緩。(4)該技術使一個系統產出的污染物，能夠成為本系統或另一個系統的生產原料，從而實現了廢棄物的資源化。從“碳中和”的角度看，該技術減少了碳排放。(2022湖南，22，15分)水蛭是我國的傳統中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構，提高其抗凝血活性。回答下列問題:(1)蛋白質工程流程如圖所示，物質a是，物質b是。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是

。

(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有、和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是。

(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的(填“種類”或“含量”)有關，導致其活性不同的原因是

。

(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路

。

【答案】(1)多肽鏈mRNAmRNA上決定氨基酸的密碼子具有簡并性(2)從基因文庫中獲取人工合成DNA半保留復制(3)種類酶處理后形成的肽中氨基酸的種類、數目和排列順序不同(4)在相同條件下，將蛋白質工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素分別進行抗凝血實驗，比較三組血液凝固所需時間長短，所需時間越長說明其抗凝血活性越大解析(1)蛋白質工程的基本途徑:從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。由于mRNA上決定氨基酸的密碼子具有簡并性，因此mRNA不同，翻譯形成的多肽鏈中氨基酸序列有可能是相同的，再盤曲、折疊形成相同結構的蛋白質。(2)基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取、人工合成和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的原理是DNA半保留復制。(3)由圖可知，水蛭蛋白經兩種蛋白酶處理后，酶解產物的肽含量差別不大，但是抗凝血活性有所差異，所以推測該差異主要與肽的種類有關，兩種處理后酶解產物中氨基酸的種類、數目和排列順序不同，從而導致兩種處理后抗凝血活性有差異。(4)在相同條件下，將蛋白質工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素分別進行抗凝血實驗，比較三組血液凝固所需時間長短，所需時間越長說明其抗凝血活性越大。[2022浙江1月選考，29(二)，7分]我國在新冠疫情防控方面取得了顯著的成績，但全球疫情形勢仍然非常嚴峻，尤其是病毒出現了新變異株——德爾塔、奧密克戎，更是威脅著全人類的生命健康。(1)新冠病毒核酸定性檢測原理是:以新冠病毒的單鏈RNA為模板，利用酶合成DNA，經PCR擴增，然后在擴增產物中加入特異的，如果檢測到特異的雜交分子則核酸檢測為陽性。

(2)接種疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制備技術要點是:將腺病毒的復制基因敲除；以新冠病毒的基因為模板合成的DNA插入腺病毒基因組，構建重組腺病毒。重組腺病毒在人體細胞內表達產生新冠病毒抗原，從而引發特異性免疫反應。在此過程中，腺病毒的作用是作為基因工程中目的基因的。將腺病毒復制基因敲除的目的是。(3)單克隆抗體有望用于治療新冠肺炎。單克隆抗體的制備原理是:取免疫陽性小鼠的細胞與骨髓瘤細胞混合培養，使其融合，最后篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞。與植物組織培養相比，雜交瘤細胞擴大培養需要特殊的成分，如胰島素和。

【答案】(二)(1)逆轉錄核酸探針(2)抗原載體使腺病毒失去復制能力(3)脾(B淋巴)動物血清解析(二)(1)以新冠病毒的單鏈RNA為模板，在逆轉錄酶催化下可合成相應的DNA。經PCR擴增后的DNA，可利用特定的核酸探針進行檢測。(2)制備腺病毒載體疫苗時需將以新冠病毒的抗原基因為模板合成的DNA插入腺病毒基因組，構建重組腺病毒。重組腺病毒在人體細胞內表達產生新冠病毒抗原，從而引發人體的特異性免疫反應。因此，腺病毒相當于基因工程中目的基因的載體。將腺病毒復制基因敲除，可使腺病毒失去復制能力，防止其在人體內增殖。(3)制備單克隆抗體時，要取免疫陽性小鼠的脾細胞(B淋巴細胞)和骨髓瘤細胞融合，篩選獲得特定的雜交瘤細胞。相比植物組織培養，動物細胞的培養需要動物血清等特殊成分。(2022全國乙，38，15分)新冠疫情出現后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發揮了重要作用。回答下列問題。(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA(核酸檢測)可以采取RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是，再通過PCR技術擴增相應的DNA片段。根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。

(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的來進行。PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是。

(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測(檢測體內是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明(答出1種情況即可)；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明。

(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術獲得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是。

【答案】(1)逆轉錄酶(2)特異核苷酸序列復性(3)被檢測者曾經感染過病毒，體內出現抗體但目前沒有病毒被檢測者感染了病毒并產生了抗體(4)獲得目的基因→構建表達載體→導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定解析(1)以病毒RNA為模板合成cDNA需要逆轉錄酶。(2)用PCR技術擴增新冠病毒RNA片段時，所需要的引物必須依據新冠病毒RNA中的特定核苷酸序列來進行設計。PCR過程每次循環分為變性(90℃以上)、復性(50℃左右)和延伸(72℃左右)三個階段，復性階段溫度最低。(3)同時進行核酸檢測和抗體檢測，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明被檢測者曾經感染過病毒，體內出現抗體但目前沒有病毒；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明被檢測者感染了病毒并產生了抗體。(4)基因工程技術獲得大量蛋白S的基本操作流程:目的基因的獲取→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定。(2021廣東，22，12分)非細胞合成技術是一種運用合成生物學方法，在細胞外構建多酶催化體系，獲得目標產物的新技術，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等。中國科學家設計了4步酶促反應的非細胞合成路線(圖13)，可直接用淀粉生產肌醇(重要的醫藥食品原料)，以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴重污染問題，并可以提高產率。圖13回答下列問題:(1)研究人員采用PCR技術從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有。

(答出兩種即可)(2)高質量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質量DNA模板時必須除去蛋白，方法有。

(答出兩種即可)(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉化大腸桿菌時，首先應制備細胞。為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白，需要采用的方法有。

(4)依圖13所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系。若這些酶最適反應條件不同，可能導致的結果是。在分子水平上，可以通過改變，從而改變蛋白質的結構，實現對酶特性的改造和優化。

【答案】(1)從基因文庫中獲取、用化學方法人工合成(2)蛋白酶水解法、鹽析法、60~75℃恒溫水浴法(3)感受態抗原—抗體雜交(4)部分酶失活，無法獲得肌醇基因結構解析(1)目前獲取目的基因常用的方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增、用化學方法人工合成等。(2)制備高質量DNA模板時，可直接在濾液中加入蛋白酶分解蛋白質，而不破壞DNA。中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，當鹽濃度較高時，蛋白質的溶解度下降并析出，這種現象稱為鹽析。利用DNA對高溫的耐受性，嚴格控制溫度范圍，使蛋白質變性沉淀而DNA分子不發生變性，可將DNA與蛋白質分離。(3)將表達載體導入大腸桿菌細胞最常用的轉化方法是首先用Ca2+處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，這種細胞稱為感受態細胞。然后將重組DNA分子溶于緩沖液中與感受態細胞混合，在一定的溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。為了檢測目的基因是否表達出相關的酶蛋白，可以從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，若有雜交帶出現，表明目的基因已表達出蛋白質產品。(4)酶的作用條件較溫和，在溫度過高、過酸、過堿的環境中會失活，不同酶的最適溫度、最適pH一般不同，將4種酶放在同一體系中，控制溫度、pH等條件一致，則部分酶可能會因溫度或者pH不適宜而失活，不能達到實驗目的，即無法獲得肌醇。基因指導蛋白質的合成，可以通過改造酶基因的結構，從而改變蛋白質的結構，進而實現對酶特性的改造和優化。(2021河北，24，15分)采礦污染和不當使用化肥導致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復技術將土壤中的Cd富集到植物體內，進行后續處理(例如，收集植物組織器官異地妥善儲存)，可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復能力，研究者將酵母液泡Cd轉運蛋白(YCF1)基因導入受試植物，并檢測了相關指標。回答下列問題:(1)為獲取YCF1基因，將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導入受體菌的群體中儲存，這個群體稱為。

(2)將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需要的兩種酶是。構建的重組基因表達載體中必須含有標記基因，其作用是。

(3)進行前期研究時，將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是。研究者進一步獲得了轉YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實驗材料的目的是。

(4)將長勢一致的野生型和轉基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據圖1可知，與野生型比，轉基因植株對Cd具有更強的(填“耐性”或“富集能力”)；據圖2可知，對轉基因植株的進行后續處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。

圖1圖2(5)已知YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡膜上。據此分析，轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境的原因是。相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復植物的優勢在于(寫出兩點即可)。

【答案】(1)基因文庫(2)限制酶和DNA連接酶鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來(3)農桿菌轉化法防止YCF1基因隨花粉擴散，給生態系統帶來風險(4)耐性葉(5)轉基因楊樹液泡膜上的Cd轉運蛋白可將細胞質基質中的Cd轉運至液泡貯存，降低Cd對細胞代謝的影響喬木比草本生物量大，與外界物質交換能力強解析(1)將含有某種生物細胞不同基因的許多DNA片段與載體連接起來，導入受體菌的群體中并儲存，每個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，這個群體稱為基因文庫。(2)構建基因表達載體時需要用限制酶切割DNA分子和質粒，然后用DNA連接酶使獲取的目的基因與質粒連接起來。標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，以便篩選出含有目的基因的細胞。(3)將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法等，其中農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物最常用的方法；不育株系可以防止基因在繁殖過程通過花粉在生態系統中擴散。(4)據圖1可知，轉基因植株的干重比野生型的大，表明轉基因植株對Cd具有更強的耐性；據圖2可知，葉片對Cd的富集作用最強，所以對葉進行后續處理對緩解土壤Cd污染最為有效。(5)轉基因楊樹液泡膜上有Cd轉運蛋白，可以將細胞質基質中的Cd運入液泡進行貯存，降低Cd對細胞代謝的影響，野生型不具有這個功能。與草本植物相比，喬木植株更大，生物量更多，與外界物質交換能力更強，可以富集更多的Cd。(2021浙江6月選考，29(二)，15分)斑馬魚是一種模式動物，體外受精發育，胚胎透明、便于觀察，可用于水質監測、基因功能分析以及藥物毒性與安全性評價等。(1)由于人類活動產生的生活污水日益增多，大量未經處理的污水直接排入河流、湖泊會引起水體，使藻類大量繁殖形成水華。取水樣喂養斑馬魚，可用斑馬魚每周的體重和死亡率等指標監測水體污染程度。

(2)為了研究某基因在斑馬魚血管發育過程中的分子調控機制，用DNA連接酶將該基因連接到質粒載體形成，導入大腸桿菌菌株DH5α中。為了能夠連接上該目的基因、并有利于獲得含該目的基因的DH5α陽性細胞克隆，質粒載體應含有(答出2點即可)。提取質粒后，采用法，將該基因導入斑馬魚受精卵細胞中，培養并觀察轉基因斑馬魚胚胎血管的發育情況。

(3)為了獲取大量斑馬魚胚胎細胞用于藥物篩選，可用分散斑馬魚囊胚的內細胞團，取分散細胞作為初始材料進行培養。培養瓶中添加成纖維細胞作為，以提高斑馬魚胚胎細胞克隆的形成率。

【答案】(1)富營養化(2)重組DNA分子限制性核酸內切酶的識別序列、抗生素抗性基因顯微注射(3)胰蛋白酶原代飼養層細胞解析(1)未經處理的生活污水中含有大量有機物，直接排放到水體中會引起水體富營養化，從而使得水體中藻類大量繁殖。(2)用一定的方法獲取目的基因后，將目的基因和質粒載體相互連接從而形成重組DNA分子，再將重組DNA分子導入受體細胞。質粒載體應含有限制性核酸內切酶的識別序列以便連接目的基因，同時也應含有抗生素抗性基因以便篩選導入目的基因的受體細胞。將含有目的基因的載體導入動物細胞，通常選用的方法是顯微注射法。(3)動物組織細胞之間的粘連物主要是蛋白質，一般選用胰蛋白酶將動物組織細胞分散開。分散的動物細胞作為初始材料進行的動物細胞培養是原代培養。為了提高動物細胞克隆的形成率，可用成纖維細胞作為飼養層細胞以支持細胞生長。(2021天津，16，12分)乳酸菌是乳酸的傳統生產菌，但耐酸能力較差，影響產量。釀酒酵母耐酸能力較強，但不產生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因(LDH)導入釀酒酵母，獲得能產生乳酸的工程菌株。下圖1為乳酸和乙醇發酵途徑示意圖，圖2為構建表達載體時所需的關鍵條件。圖1圖2(1)乳酸脫氫酶在轉基因釀酒酵母中參與厭氧發酵的場所應為。

(2)獲得轉基因釀酒酵母菌株的過程如下:①設計引物擴增乳酸脫氫酶編碼序列。為使擴增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉變為真核生物偏好的ATG，且能通過雙酶切以正確方向插入質粒，需設計引物1和2。其中引物1的5'端序列應考慮和。

②將上述PCR產物和質粒重組后，導入大腸桿菌，篩選、鑒定，擴增重組質粒。重組質粒上有，所以能在大腸桿菌中擴增。啟動子存在物種特異性，易被本物種的轉錄系統識別并啟動轉錄，因此重組質粒上的乳酸脫氫酶編碼序列(能/不能)在大腸桿菌中高效表達。

③提取重組質粒并轉入不能合成尿嘧啶的釀酒酵母菌株，在的固體培養基上篩選出轉基因釀酒酵母，并進行鑒定。

(3)以葡萄糖為碳源，利用該轉基因釀酒酵母進行厭氧發酵，結果既產生乳酸，也產生乙醇。若想進一步提高其乳酸產量，下列措施中不合理的是(單選)。

A.進一步優化發酵條件B.使用乳酸菌LDH基因自身的啟動子C.敲除釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因D.對轉基因釀酒酵母進行誘變育種【答案】(1)細胞質基質(2)①包含BamHⅠ的識別序列將GTG改為ATG②原核生物復制原點不能③缺失尿嘧啶(3)B解析(1)釀酒酵母為真核生物，其進行無氧呼吸的場所為細胞質基質，所以乳酸脫氫酶在轉基因釀酒酵母中參與厭氧發酵的場所應為細胞質基質。(2)①因為擴增的目的基因的引物1對應5'端的序列的編碼(非模板)鏈含有編碼起始密碼子的序列GTG，所以該引物5'端對應的序列含編碼鏈的起始端，故該引物5'端序列需要滿足兩個條件:一是將編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG改為真核生物偏好的ATG；二是引物5'端序列應加入BamHⅠ的識別序列(酶切位點)，以便將擴增的目的基因以正確方向插入質粒。②大腸桿菌為原核生物，若要在大腸桿菌內擴增，重組質粒上應有原核生物復制原點，以便被大腸桿菌的DNA聚合酶識別。因為插入的含乳酸脫氫酶基因的重組質粒沒有大腸桿菌基因啟動子，所以不能被大腸桿菌的轉錄系統識別并啟動轉錄，無法在大腸桿菌中高效表達。③實驗所選的釀酒酵母菌株為尿嘧啶合成缺陷型，不能在缺失尿嘧啶的固體培養基上生長，若該菌株細胞中導入重組質粒，由于重組質粒中含有尿嘧啶合成酶基因，可使導入重組質粒的釀酒酵母恢復合成尿嘧啶的能力，因此可以用缺失尿嘧啶的固體培養基篩選出轉基因釀酒酵母，并進行鑒定。(3)若使用乳酸菌LDH基因自身的啟動子，則不能被釀酒酵母的轉錄系統識別，所以不能提高其乳酸產量。(2021北京，21，10分)近年來發現海藻糖-6-磷酸(T6P)是一種信號分子，在植物生長發育過程中起重要調節作用。研究者以豌豆為材料研究了T6P在種子發育過程中的作用。(1)豌豆葉肉細胞通過光合作用在中合成三碳糖，在細胞質基質中轉化為蔗糖后運輸到發育的種子中轉化為淀粉貯存。

(2)細胞內T6P的合成與轉化途徑如下:底物T6P海藻糖將P酶基因與啟動子U(啟動與之連接的基因僅在種子中表達)連接，獲得U-P基因，導入野生型豌豆中獲得U-P純合轉基因植株，預期U-P植株種子中T6P含量比野生型植株，檢測結果證實了預期，同時發現U-P植株種子中淀粉含量降低，表現為皺粒。用同樣方法獲得U-S純合轉基因植株，檢測發現植株種子中淀粉含量增加。

(3)本實驗使用的啟動子U可以排除由于目的基因對種子發育產生的間接影響。

(4)在進一步探討T6P對種子發育的調控機制時，發現U-P植株種子中一種生長素合成酶基因R的轉錄降低，U-S植株種子中R基因轉錄升高。已知R基因功能缺失突變體r的種子皺縮，淀粉含量下降。據此提出假說:T6P通過促進R基因的表達促進種子中淀粉的積累。請從①~⑤選擇合適的基因與豌豆植株，進行轉基因實驗，為上述假說提供兩個新的證據。寫出相應組合并預期實驗結果。①U-R基因②U-S基因③野生型植株④U-P植株⑤突變體r植株【答案】(10分)(1)葉綠體基質(2)低(3)在其他器官(過量)表達(4)②⑤與突變體r植株相比，轉基因植株種子的淀粉含量不變，仍皺縮①④與U-P植株相比，轉基因植株種子淀粉含量增加，為圓粒②④與U-P植株相比，轉基因植株種子R基因轉錄提高，淀粉含量增加，為圓粒(答出任意兩條即可)解析(1)三碳糖合成的反應屬于暗反應，故豌豆葉肉細胞光合作用合成三碳糖的場所為葉綠體基質。(2)U-P基因使種子中P酶增加，促進了T6P轉化為海藻糖，故U-P植株種子中T6P的含量比野生型植株低。(3)通過題干信息可知，啟動子U使與之相連的基因只在種子中表達，不在其他器官表達，故使用啟動子U可排除目的基因在其他器官表達對種子發育產生的間接影響。(4)U-S基因可使種子中T6P含量增多，將該基因轉入突變體r植株(R基因功能缺失，種子皺縮)，若假說成立，則轉基因植株種子中U-S基因無法使種子中淀粉含量增加；U-P植株種子(皺縮)中R基因轉錄降低，將U-S基因轉入U-P植株，若假說成立，則轉基因植株種子中R基因轉錄升高，且淀粉含量增加，為圓粒；U-R基因可表達出生長素合成酶，將該基因轉入U-P植株，若假說成立，則轉基因植株種子中淀粉含量增加，為圓粒。(2020山東，25，11分)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強。科研人員將能表達出基因編輯系統的DNA序列轉入水稻，實現了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。(1)將能表達出基因編輯系統的DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需的酶是，重組載體進入水稻細胞并在細胞內維持穩定和表達的過程稱為。

(2)根據啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了，從而改變了Wx基因的轉錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列(填:“發生”或“不發生”)改變，原因是。

(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉錄產生的mRNA(WxmRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經過程獲得總cDNA。通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA，原因是。

(4)各品系WxmRNA量的檢測結果如圖所示，據圖推測糯性最強的品系為，原因是

。

【答案】(1)限制性核酸內切酶和DNA連接酶轉化(2)RNA聚合酶與啟動子的識別和結合不發生編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子(3)逆轉錄(或:反轉錄)引物是根據Wx基因的一段已知序列設計合成的(或:引物能與Wx基因的cDNA特異性結合)(4)品系3品系3的WxmRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強解析(1)構建重組載體所需的工具酶是限制性核酸內切酶和DNA連接酶，重組載體進入受體細胞并在細胞內維持穩定和表達的過程稱為轉化。(2)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，可驅動基因轉錄出mRNA，若啟動子序列改變，將會影響RNA聚合酶與啟動子的識別和結合，從而影響基因的轉錄；由題意知，3個突變品系發生改變的是Wx基因的啟動子，而啟動子位于基因的非編碼區，編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列(即編碼區)中不含啟動子，故3個突變品系合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列不發生改變，只是Wx基因的表達水平發生了改變。(3)檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經逆轉錄過程獲得總cDNA。利用cDNA進行PCR擴增前需根據Wx基因的一段已知序列設計特定引物，從而專一性地擴增出Wx基因的cDNA。(4)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，由于直鏈淀粉所占比例越小糯性越強，所以Wx基因表達量最少即WxmRNA量最少的品系糯性最強，故品系3糯性最強。(2020天津，16，10分)Ⅰ型糖尿病是因免疫系統將自身胰島素作為抗原識別而引起的自身免疫病。小腸黏膜長期少量吸收胰島素抗原，能誘導免疫系統識別該抗原后應答減弱，從而緩解癥狀。科研人員利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠進行動物實驗，使乳酸菌在小鼠腸道內持續產生人胰島素抗原，為此構建重組表達載體，技術路線如下。據圖回答:(1)為使人胰島素在乳酸菌中高效表達，需改造其編碼序列。如圖是改造前后人胰島素B鏈編碼序列的起始30個核苷酸序列。據圖分析，轉錄形成的mRNA中，該段序列所對應的片段內存在堿基替換的密碼子數有個。

(2)在人胰島素A、B肽鏈編碼序列間引入一段短肽編碼序列，確保等比例表達A、B肽鏈。下列有關分析正確的是(多選)。

A.引入短肽編碼序列不能含終止子序列B.引入短肽編碼序列不能含終止密碼子編碼序列C.引入短肽不能改變A鏈氨基酸序列D.引入短肽不能改變原人胰島素抗原性(3)在重組表達載體中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶僅有圖示的酶切位點。用這兩種酶充分酶切重組表達載體，可形成種DNA片段。

(4)檢測轉化的乳酸菌發現，信號肽-重組人胰島素分布在細胞壁上。由此推測，信號肽的合成和運輸所經歷的細胞結構依次是。

(5)用轉化的乳酸菌飼喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段時間后，小鼠體內出現人胰島素抗原，能夠特異性識別它的免疫細胞有(多選)。

A.B細胞B.T細胞C.吞噬細胞D.漿細胞【答案】(共10分)(1)6(2)ABCD(3)3(4)核糖體、細胞質基質、細胞膜、細胞壁(5)AB解析(1)改造前單鏈TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACAC改造后單鏈TTTGTCAACCAACATTTATGTGGATCACAT對應密碼子改變對應密碼子改變對應密碼子改變對應密碼子改變對應密碼子改變對應密碼子改變據表及題圖分析可知，轉錄形成的mRNA中，該段序列所對應的片段內共6個密碼子發生了堿基替換。(2)對人胰島素A、B肽鏈編碼序列間引入一段短肽編碼序列后不應破壞其正常功能，若引入的短肽編碼序列含有終止子序列，則會導致DNA轉錄提前結束，形成的mRNA過短，翻譯成的多肽鏈將不完整而失效，A正確；如果引入的短肽編碼序列含有終止密碼子編碼序列，則該mRNA的翻譯過程將提前結束，氨基酸數目減少從而導致蛋白質失效，B正確；由題干分析可知，加入短肽編碼序列的目的是使A、B肽鏈等比例表達，不能改變A、B肽鏈的氨基酸序列，更不能改變原人胰島素的抗原性，C、D正確。(3)由重組表達載體圖像分析可知，該環形DNA上有兩個SacⅠ酶切位點和一個XbaⅠ酶切位點，則用這兩種酶充分酶切重組表達載體后將產生三個短鏈(注意線形的DNA雙鏈被限制酶充分酶切三個相應位點之后將形成4個DNA片段，而一個環形質粒被限制酶充分酶切三個相應的位點之后將形成3個DNA片段)。(4)由于乳酸菌為原核生物，沒有細胞核且只有核糖體一種細胞器，再結合題意，所形成的蛋白質最終分布在細胞壁上，故綜合分析可知，蛋白質在核糖體上合成，經細胞質基質后，先到達細胞膜再分布到細胞壁上。(5)根據免疫調節基礎知識判斷，能特異性識別抗原的細胞有B細胞、T細胞、效應T細胞、記憶