液相色譜根底知識與應用液相色譜根底知識與應用液相色譜根底知識與應用Contents5樣品分析方法的建立液相色譜的維護及本卷須知軟件的簡單介紹及示范Contents液相色譜法發展史與分類1色譜方法基本原理2345樣品分析方法的建立液相色譜的維護及本卷須知軟件的簡單介紹及示范1液相色譜開展歷史與分類1.1色譜的起源(1903)Chromatography色譜M.S.TswettIUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection.固定相〔stationaryphase〕：在色譜別離中固定不動、對樣品產生保存的一相。流動相〔mobilephase〕：帶動樣品向前移動的另一相。色譜法：是一種物理化學別離方法，它利用不同組分與兩相〔固定相和流動相〕之間的作用力〔分配、吸附、離子交換等〕的差異，樣品在兩相中做相對移動時，各組分在兩相間進展屢次平衡，使不同物質到達相互別離。

色譜的定義1.3色譜的開展歷程1.4色譜中的別離過程定性定量串聯應用樣品純化成分分析分離色譜中的別離過程咖啡流動相固定相利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學作用性能的差異,當兩相作相對運動時,使各組分在兩相中反復屢次受到上述各作用力而到達相互別離1.5色譜的分類按流動相的物態分:–氣相色譜(GasChromatography,GC)：用氣體作為流動相(又叫載氣)–液相色譜(LiquidChromatography,LC)：用液體作為流動相(又叫洗脫劑)按固定相的形態分:–平面色譜紙色譜薄層色譜

–柱色譜按流動相和固定相的相對極性–正相色譜(NormalPhaseChromatography)

固定相的極性大于流動相–反相色譜(ReversedPhaseChromatography)

固定相的極性小于流動相HPLC與

GC的應用差異HPLC與

GC的應用差異揮發非揮發疏水性親水性糖環氧化合物多氯聯苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳氫化合物無機離子氨基酸糖類衍生物香精油聚合物單體甘油三酸酯磷脂亞硝胺有機磷殺蟲劑酒精多環芳烴芳族胺脂溶性維生素抗體天然食用色素類黃酮抗生素腈類抗氧化劑乙二醇脂肪酸磺胺類揮發性羧酸醛酮類甘草膦合成食用色素苯酚黃曲霉毒素酶糖醇2.色譜方法根本原理色譜的主要理論熱力學理論以相的平衡觀點研究色譜過程

塔板理論為代表

(Martin&Synge)動力學理論以動力學觀點研究各種動力學因素對色譜峰的影響

VanDeemter方程為代表MartinSynge別離的原理樣品組分在固定相和流動相之間的分配流動相帶動樣品經過色譜柱不同組分與固定相之間相互作用的強度不同不同組分在固定相上移動速度不同，形成別離分配系數KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流動相固定相樣品組分的別離進樣、分配、移動、流出、別離KD2<KD1，所以Y先流出來分配系數K分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在條件〔流動相、固定相、溫度和壓力等〕一定，樣品濃度很低時〔Cs、Cm很小〕時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易別離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜別離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保存時間，到達別離的目的。樣品組分別離情況A.樣品與色譜柱固定相無任何作用三種樣品在t0時間流出，無保存無保存時間B.樣品組分保存時間一致與色譜柱作用力一樣C.樣品組分保存時間不一致樣品各組分與色譜柱作用力不同D.實際別離狀況高斯分布曲線

色譜出峰形狀實際出峰形狀為高斯分布曲線(Gaussiancurve)樣品的擴散效應無擴散樣品擴散別離度別離度〔Resolution)兩個相鄰峰的別離程度。以兩個組份保存值之差與其平均半峰寬值的比來表示：R=時兩峰認為已分開不同別離度R相鄰兩吸收峰別離度R=1.0,98%,基線別離R=1.5,99.7%R＞=1.5時，完全別離〔中國藥典規定〕兩色譜峰被視為分開別離度R的數學表達別離度R的根本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰的保存特性:選擇因子(selectivityfactor)反映相鄰兩色譜峰的別離程度——色譜過程熱力學因素N:理論塔板數，反映色譜柱的別離效率(columnefficiency)——色譜過程動力學因素有關R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效選擇因子容量因子

容量因子k’測量溶質在固定相和流動相中分布的摩爾數〔量〕之比與溫度有關(GC)與流動相溶劑種類及組成有關(LC)Injectiont0t’RtRk’決定樣品能進入色譜柱固定相的量k’太小，在固定相上保存太短，很快流出，難以確定保存時間k’太大，在固定相上保存太強，洗脫時間太長，理想的k’為1～5別離效果與k’值的最優化

k’值的優化改變溶劑成分、梯度條件

(洗脫強度)

選擇因子

色譜柱分開兩組份的能力＞1時兩組分別離表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。t0t’R1t’R2Injection選擇因子

的影響因素影響

的因素

改變流動相成分，包括改變

pH

值改變柱溫

(在LC不明顯)改變固定相成分使用特殊化學效應理論板數

N塔板理論熱力學平衡理論色譜柱效的量化從分餾法技術衍生而來別離法依組分揮發性不同而分餾色譜法依組分分配系數不同而別離分配系數K=Cs/Cm理論板數N、塔板高度H柱效隨N增大和H減小而增加分配色譜流程模型N=L/H理論塔板數N與半峰寬W1/2和保存時間的關系如下在一樣保存時間色譜峰越鋒利，則色譜柱效越高別離效能的最優化增加容量增加選擇因子增加柱效增加k’值可增加別離度但會增加分析時間改變流動相、固定相成分增加值可增加別離度但不能因此影響k’值液相色譜儀設備概述液相色譜儀器組成溶劑傳輸系統〔泵系統〕進樣系統檢測器工作站組分收集〔選項〕液相色譜儀器構造組成示意圖流動相儲液瓶單元或多元泵梯度混合器預柱手動-進樣器自動-進樣器保護柱色譜柱柱后反響器柱溫箱檢測器餾分收集器積分儀工作站計算機接口溫度控制單元樣品制備單元3.樣品分析方法開發

樣品預處理樣品預處理的目的是為了純化樣品。完成純化的方法有:稀釋-

用一種互溶的且比流動相弱的溶劑或流動相本身稀釋樣品過濾-

有不同孔徑的過濾材料.

提示:有的化合物可能吸附在過濾器上，從而影響定量.離心-

可除去樣品中的顆粒物質.萃取-液液萃取，固相萃取揮發-采用惰性氣體通過樣品鼓泡或抽真空除去溶劑樣品準備優化概覽優化應當是系統進展的，也就是說每個參數應當逐步變化.

!!每次運行只改變一個參數!!目標是在最短的分析時間內獲得最好的別離結果.

優化溶劑強度

流速

溫度

柱長

固定相*優化流動相的選擇流動相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學性質穩定，不損壞柱子。③不阻礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環境。反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇系統方法開發)選擇初始色譜柱(直徑,長度,填料粒度〕-4.6x250mm,5m使用適當的孔徑初始運行采用與流動相組成條件一致的pH)優化k*(保存)梯度范圍,時間,斜率流動相-很小變化)優化回收率樣品的溶解性溫度的作用鍵合相的作用有機改性劑)優化*(選擇性)溫度鍵合相pH(最后的手段))優化N(色譜柱條件)流速長度填料粒度別離度與k’,N,和的關系初始改變k'提高N提高a梯度范圍,斜率流速,填料粒度,柱長溫度、流動相、pH優化色譜的定性分析色譜定性分析:用保存值定性和色譜聯用技術〔如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保存值定性根本依據：兩個一樣的物質在一樣的色譜條件下應該有一樣的保存值。但是，相反的結論卻不成立，即在一樣的色譜條件下，具有一樣保存值的兩個物質不一定是同一個物質利用物直接對照進展定性分析用絕對保存值定性－－一般要求用自動進樣用相對保存值定性用物增加峰高法定性利用文獻值對照進展定性分析－－采用保存指數(I)檢測器信號響應與時間的關系測量每個峰的保存時間tR1t0tR2timesignal色譜的定量分析檢測器信號響應與時間的關系測量每個峰的峰面積定量分析的根本公式：Mi–i組分的量；Ai–i組分的峰面積；fi–i組分的校正因子，與檢測器的行為和被測組份的行為有關。定量分析的依據是被測組分的量與響應信號成正比，但一樣含量的物質由于物理、化學性質的差異，即使在同一檢測器上產生的信號也不同，直接用響應信號定量，必然導致較大誤差。故引入校正因子。校正因子是定量計算公式中的比例常數，其物理意義是單位面積所代表的被測組分的量。

1.面積百分法(AreaPercent)2.外標法(ExternalStandard)3.內標法(InternalStandard)4.歸一化法(NormalizedPercent)色譜定量分析方法的種類面積百分法

最簡單的計算方法樣品中的所有成分對檢測器的響應值一樣樣品中的所有成分必須完全別離表示樣品中單一組份相對于其他組份的含量面積%=(AI/ΣA)*100AI=單一色譜峰的面積ΣA=全部色譜峰的面積之和不要求進樣量準確不適用于選擇性檢測器歸一化法(Normalized%)將樣品中所有組份的含量之和定為100%。計算其中某一組份百分含量的定量方法：其中：xi－試樣中組份I的百分含量

fi－組份I的校正因子

Ai－組份I的峰面積或峰高歸一化法例如

化合物 峰面積 校正因子 峰面積×校正因子 百分比含量C8 200 1.2 240 240/1708=14.1%C12 230 1.6 368 368/1708=21.5%C16 200 1.8 360 360/1708=21.1%C18 300 1.8 540 540/1708=31.6%C20 100 2.0 200 200/1708=11.7% 1030 1708 100%優點：方法簡便，進樣量與載氣流速的影響不大缺點：樣品中所有組份必須都能出峰，并且必須知道各自組份的校正因子〔校正因子需要由的標準品來求得〕。歸一化法主要用于氣相色譜的定量測定。且一般只適用于通用型檢測器。直接峰面積歸一化－－無校正因子法%(NOCalibration)當樣品中各組份的校正因子近似相等，如同系物或同分異構體，可直接用峰面積歸一化進展定量。即簡化為下式：例如：給出了采用校正因子和不用校正因子進展歸一化法的定量結果組份乙苯對二甲苯間二甲苯鄰二甲苯峰面積（Ai）校正因子（fi’）f’*Ai1200.97116751.00751400.961341050.98103校正因子歸一化法定量結果直接峰面積歸一化定量結果27.027.217.517.131.331.824.123.9多點校正的定量分析單點校準峰面積進樣量峰面積進樣量響應值=樣品量unn=峰面積響應值峰面積進樣量多點校準外標法〔ExternalStandard)－又稱校正曲線法在一樣分析條件下，比較標準物質與樣品的色譜峰面積或峰高1.用的標準品配成不同濃度的標準系列，在與被測樣品一樣的色譜條件下，等體積準確進樣，測量各種濃度的峰高或峰面積，繪制響應信號與百分含量的關系曲線；2.測量樣品的峰面積或峰高，在校正曲線上查出其對應的百分含量。外標法定量濃度峰面積標準1127187標準24012845標準38021437標準412027557標準514031440樣品結果直接在標準工作曲線上讀出，非常簡單，尤其對大量樣品分析時特別適合。要求進樣量、色譜分析條件嚴格不變；容易出現較大誤差。內標法(InternalStandard)用DBP做內標測定Pynamin.配制標準溶液：準確稱量200mgDBP和220mg90%的Pynamin配制成溶液100ml。色譜測定得到