第3章

物理圖繪制物理作圖：

以DNA分子的序列排列為基礎(chǔ)的非遺傳學(xué)的作圖技術(shù)統(tǒng)稱為物理作圖。物理作圖的方法和策略有多種多樣，常用的有：限制性作圖；基于克隆的基因組作圖；熒光原位雜交；序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖。3.1限制性作圖3.2基于克隆的基因組作圖3.2.1大分子DNA的克隆載體細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)：

BAC載體源于大腸桿菌中天然的F質(zhì)粒。F質(zhì)粒有較大的克隆容量，可達(dá)300kb以上可采取類似制備質(zhì)粒的方法直接提取克隆的DNA。3.2.2重疊群組建重疊群(contig)：相互重疊的DNA片段組成的物理圖稱為重疊群。克隆重疊群的組建：最早采用的是染色體步移(chromosomewalking)法。首選從基因組文庫中挑取一個(gè)指定的或隨機(jī)的克隆，將該起始克隆的末端序列作為探針，在基因組文庫中尋找與之重疊的第二個(gè)克隆。再按同樣的操作程序?qū)ふ业谌齻€(gè)重疊的克隆，依次延伸，直到完成所需要的重疊群。該方法速度緩慢僅適合于小基因組及小區(qū)段染色體的物理圖繪制。Contig3.2.3指紋作圖克隆指紋(clonefingerprinting)排序：指紋：系指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段組成。這些DNA片段可以通過不同的方法產(chǎn)生，經(jīng)凝膠電泳顯示后組成特定排列模式的DNA條帶，即指紋。克隆指紋：每個(gè)克隆的DNA序列都具有特征性的指紋，這些指紋稱為克隆指紋。如果兩個(gè)DNA克隆含有部分相同的指紋，那么這兩個(gè)克隆就含有部分重疊的DNA序列，它們?cè)诨蚪M中應(yīng)該相鄰排列。>20kb~300bpMolecularweightmarkerevery5thlaneBACclones培養(yǎng)提取BACDNAHindIII完全酶切

1%瓊脂糖凝膠電泳

指紋圖譜法

（WalkingbyFingerprintingdatabase）

挑取靠近空洞（gap）的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在FPC數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達(dá)到延伸目的。限制性帶型(restrictionpatterns)指紋：

用不同限制性酶處理樣品，經(jīng)凝膠分離產(chǎn)生DNA條帶。如果2個(gè)克隆產(chǎn)生的DNA條帶有部分是相同的，說明它們含有重疊的序列。HindIII完全酶切HindIII完全酶切FPC數(shù)據(jù)庫中比對(duì)CloneACloneBCloneCCABSTS作圖(STScontentmaping)指紋：當(dāng)需將某一克隆重疊群錨定到現(xiàn)有的已具有STS標(biāo)記的物理圖上時(shí)，這一方法特別有效。因?yàn)镾TS是單一序列，并且序列已知。根據(jù)選定的某個(gè)STS序列設(shè)計(jì)專一性引物，可對(duì)大量的單個(gè)克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，凡是能擴(kuò)增出條帶的克隆均含有序列重疊的插入子。3.4輻射雜種作圖構(gòu)建詳細(xì)的大基因組物理圖的主流技術(shù)為STS定位(STSmaping)的輻射雜種(radiationhybrid)作圖。主要原理是：基因組中單一序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequencetaggedsite,STS)都有獨(dú)一無二的序列組成，在染色體上的位置是確定的；位于染色體上近鄰排列的STS是機(jī)械連接的，在外力作用下斷裂DNA或部分酶切降解DNA時(shí)，2個(gè)不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)取決于它們?cè)诨蚪M中的相對(duì)位置。當(dāng)兩個(gè)片段含有同一STS序列時(shí)，可以確認(rèn)這兩片段彼此重疊。用于作圖的STS通常是一小段長(zhǎng)度在100到500bp的DNA序列，由于每個(gè)基因僅一份拷貝，很易分辨。3.4.1序列標(biāo)簽位點(diǎn)STS要滿足2個(gè)條件：一段序列已知的片段，在染色體上有獨(dú)一無二的位置，即每個(gè)STS都是單一序列。尋找STS的辦法：表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST)是一些從cDNA(complementaryDNA)克隆中找到的小段序列。EST可轉(zhuǎn)變?yōu)镾TS，條件是這個(gè)EST來自單拷貝基因而非基因家族成員，或者位于基因的非翻譯區(qū)。SSLP微衛(wèi)星序列具有多態(tài)性并已在連鎖分析中定位的SSLP具有特別的價(jià)值。隨機(jī)基因組序列3.4.2輻射雜種作圖的程序與方法輻射雜種作圖：輻射雜種(radiationhybrid)是含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細(xì)胞。原理：經(jīng)強(qiáng)輻射處理的人體細(xì)胞很快死亡，但若在輻射后立即處理過的細(xì)胞與未輻射的倉鼠或其他鼠類細(xì)胞融合，有些人體細(xì)胞染色體片段將會(huì)整合到鼠類染色體中進(jìn)行擴(kuò)增，因此又稱為輻射與融合基因轉(zhuǎn)移。通常選擇到的每個(gè)陽性雜種細(xì)胞系可保留5～10Mb大小的人細(xì)胞染色體片段，總約占人類基因組的15%～35%。這些雜種細(xì)胞的集合體稱為輻射雜種群(radiationhybridpanel)，可作為一種作圖試劑用于STS定位。每次從雜種細(xì)胞分離DNA，用PCR檢測(cè)雜種細(xì)胞中含有的STS標(biāo)記，根據(jù)成對(duì)STS出現(xiàn)的頻率，可判斷這些標(biāo)記是否連鎖以及連鎖程度。3.5.1人類基因組整合圖除輻射雜種作圖外，另一份以BAC克隆為基礎(chǔ)的物理圖也于2001年發(fā)表。這份物理圖采用指紋作圖法將覆蓋人類基因組約15個(gè)單倍體的283,287個(gè)BAC克隆組建成7