第1節(jié)基因工程及其技術(shù)第4課時利用大腸桿菌生產(chǎn)人類胰島素，我們已經(jīng)獲取了胰島素基因，接下來該如何使其在大腸桿菌中穩(wěn)定存在呢?第二步：基因表達載體

的構(gòu)建重組體大腸桿菌情境導(dǎo)入基因工程產(chǎn)品胰島素胰島素基因確保基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并

且遺傳給下

一

代，

使目的基因能夠有效表達。思考1:若要干擾素基因在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，并能夠表達和發(fā)揮作用，載體還需要哪些結(jié)構(gòu)?(閱讀課本97頁內(nèi)容)插入目的基因表達載終止子復(fù)制原點-標(biāo)記基因二、基因表達載體的構(gòu)建——核心新知講授1、

目

的

：思考2:

各個元件有什么作用?(閱讀課本97頁內(nèi)容)a、復(fù)制原點

DNA復(fù)制起點b、目的基因

能控制表達所需要的特殊性狀X

插入基因位于基因的上游，是RNA聚合酶結(jié)合

表達載體終止子c

、啟動子

位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

復(fù)制原點抗生素基因d、終止子

位于基因的下游，終止轉(zhuǎn)錄e、標(biāo)記基因

初步篩選接受了目的基因受體細胞新知講授2、

過

程

：限制酶切割位點啟動子、

終止子②用同種限制酶或

能產(chǎn)生相同末端的

限制酶切割含有目

的基因的DNA

片段。重組DNA

分

子③將切下的目的基因片段拼接到載體

的切口處，再加入適量DNA

連接酶，

形成了一個重組DNA

分子。標(biāo)記基因-①用一

定的限

制酶切割載體，使

其出現(xiàn)一個切口，

露出黏性末端。限制酶獲取目的基因連接酶目的基因限制酶切割位點新知講授C

限制酶質(zhì)粒

復(fù)制原點5°

ATTCATCsTCGAATC3

酶

切3°5°CTTAAGTAGCAGCTTAAG◆

缺

點

：

酶切位點

目的基因

酶切位點①質(zhì)粒、目的基因會發(fā)生自身環(huán)化連接②質(zhì)粒與目的基因會發(fā)生反向連接新知講授0空載質(zhì)粒?55

AATTCATCGTCG

3'3°

5GTAGCAGCTTAA目的基因自連接5目的基因能

正確表達GAAx錯連重組質(zhì)粒補

充

1

:

單

酶

切

體

系

總

結(jié)

：GAA7重組質(zhì)粒酶切位點酶切空載質(zhì)粒III目的基因不

能正確表達質(zhì)粒自連接空載質(zhì)粒1

1

A

A

以Ah9補充2:雙酶切體系總結(jié)：AGA空載質(zhì)粒?未連接成功的質(zhì)粒AGA空載質(zhì)粒酶切位點1酶切酶切位點2A空載質(zhì)粒連接重組質(zhì)粒TCTAGAATCGTCGAATTC5'

3°3°

AGATCTTAGCAGCTTAAG

5°

酶切位點1

目的基因

酶切位點2思考：雙酶切有什么優(yōu)點?CTAGAATCGTCG5

3'3'

TTAGCAGCTTAA

5未連接成功的目的基因CTAGAATCGTCG5'3°3°

TTAGCAGCTTAA

5'新知講授酶

切AGA?(1)不破壞目的基因：切點應(yīng)位于目的基因兩端，如圖甲中可選擇Pst

I,而不選擇Sma

I。(2)保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaI。Pst

I-EcoRI乙補充3:限制酶的選擇原則新知講授標(biāo)記基因

Pst

I抗病基因甲EcoRI

SmaIPst

I

Sma

ISma

I與終止子之

間，不宜選擇Pst

I—因其位于標(biāo)

記基因中，

不宜選擇其切割位點

其會破壞啟動!不在啟動子>Xho

I

子，不宜選擇復(fù)制原點被破壞后，目的基因不!

能在受體細胞中復(fù)制，不宜選擇啟動子

抗生素抗性基因

終

止-

子其位于啟

動子、終

止子之間，

宜選擇HindⅢNde

I

Xba

I

BamHIEcoR

I其會破壞終止|

子，不宜選擇新知講授Kpn

I即時訓(xùn)練1.結(jié)合基因表達載體模式圖分析以下問題：(1)圖中a、b、c分別代表什么結(jié)構(gòu)?a為啟動子、

b為終止子、

c為復(fù)制原點。(2)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子是一回事嗎?不是，啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達載體必需的部分。而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。(3)為什么目的基因要插入啟動子和終止子之間?啟動子位于目的基因的首端使轉(zhuǎn)錄開始，終止子位于目的基因的尾端，

使轉(zhuǎn)錄終止；只有順序正確，目的基因才能正常轉(zhuǎn)錄。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞T-DNA1.將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄖ饕寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒，其上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。新知講授目的基因插入到馬鈴薯細胞T-DNA感染

組織培養(yǎng)抗病毒馬鈴薯農(nóng)桿菌表達載體Ti

質(zhì)

粒

構(gòu)建目的基因插入

植物細胞

染

色DNA新知講授轉(zhuǎn)入

導(dǎo)入構(gòu)建基因

表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌③

轉(zhuǎn)

化

過

程

：病毒復(fù)制酶基因植物細胞新性狀Ti質(zhì)粒表達小

組

討

論

：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中兩次拼接、兩次導(dǎo)入的目的：(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T一DNA上；

第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T一DNA拼接到受體細

胞染色體的DNA上。(2)兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的重組Ti

質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；

第二次導(dǎo)入(非人工操作)是將含目的基因的T一DNA導(dǎo)入受體細胞。新知講授將含有目的基因

的表達載體提純注意：對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，受精卵具有體積大、易操作、經(jīng)培養(yǎng)可直接表達性狀的優(yōu)點。①常用方法：

顯微注射技術(shù)②常用受體細胞：

受精卵③基本操作程序：2.將目的基因?qū)雱游锛毎轮v授發(fā)育成為具有

新性狀的動物早期胚

胎培養(yǎng)胚胎移植顯微注射受精卵①原核生物的特點：

繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少等。②常用方法：

Ca2+

處理法(感受態(tài)細胞法)首先用Ca2+處理大腸桿菌細胞→感受態(tài)細胞

→將重組表達載體DNA

分子與感受態(tài)細胞混合

→感受態(tài)細胞吸收DNA

分子。3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎鸆a2+的作用：增加細胞壁的通透性新知講授③基本操作程序：A方法：DNA分子雜交B

過程：①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA;②將人工合成的目的基因的DNA片段用放射性同位素標(biāo)

記或熒光標(biāo)記，以此做探針；

(單鏈)③↓變性④↓轉(zhuǎn)膜硝酸纖

維素膜⑤|加入特異W性探針1.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交，若顯示出雜交

四

、目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定帶，表明目的基因已插入染色體DNA中。新知講授①②

電

泳瓊脂糖凝-

膠電泳

⑦放射自顯影

DNA分子

DNA

片段限制酶切⑥|洗膜六新知講授2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①方法：

分子雜交法②過程：用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交，若出

現(xiàn)

雜交

帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。瓊脂糖凝-

膠電泳硝酸纖維素膜⑤

放射

自顯影②

轉(zhuǎn)膜③

加入特異

￥性探針④

洗膜各種RNA①電泳0

DNABt毒素蛋白質(zhì)粒

蘇云金桿菌插人目的基因的染色體DNA脫分化注射提取→抗體蛋白質(zhì)3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)新知講授◆

方法：抗原-抗體雜交法出現(xiàn)雜

交帶植物細胞轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物飼喂害蟲(抗蟲接種實驗)害蟲死亡抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染(抗病接種實驗)未出現(xiàn)病斑抗鹽植物鹽水澆灌正常生長抗除草劑植物噴灑除草劑正常生長獲取目的基因產(chǎn)物

的轉(zhuǎn)基因生物提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常新知講授4.個體生物學(xué)水平的鑒定1.研究表明，將豌豆早枯病毒(PEBV)的復(fù)制酶C端編碼序列轉(zhuǎn)入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草會對PEBV表現(xiàn)出抗性。下列說法正確的是A.該過程需要用到限制酶和DNA聚合酶來構(gòu)建基因表達載體B.將豌豆早枯病毒(PEBV)的復(fù)制酶C端編碼序列導(dǎo)入煙草細胞最常用的

方法是Ca2+處理法C.

只要在轉(zhuǎn)基因煙草細胞內(nèi)檢測出豌豆早枯病毒(PEBV)的復(fù)制酶C端編

碼序列就代表成功了D.檢測轉(zhuǎn)基因生物DNA上是否插入了目的基因，可以用DNA分子雜交法即時訓(xùn)練2.在檢測抗蟲基因是否成功轉(zhuǎn)入棉花基