基因工程基因工程的基本操作程序【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1.簡(jiǎn)述目的基因的篩選和獲取方法2.簡(jiǎn)述PCR的原理、條件及過(guò)程【重難點(diǎn)】利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左）與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（右）

1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？從社會(huì)中來(lái)目的基因的篩選與獲取蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲。科學(xué)家通過(guò)實(shí)驗(yàn)，將該細(xì)菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。這個(gè)“殺蟲基因”就是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡(jiǎn)稱Bt基因第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因主要指編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因的種類：根據(jù)需求的不同，目的基因也不同，如生物抗逆性、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因那么，如何篩選與獲取目的基因呢？第一步：目的基因的篩選與獲取（篩選合適的目的基因）隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBanK）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰地基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法第一步：目的基因的篩選與獲取1.通過(guò)化學(xué)方法直接人工合成目的基因獲取目的基因的方法DNA合成儀要求：①基因比較小

②核苷酸序列已知的基因2.通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因基因文庫(kù)種類：①基因組文庫(kù)（包含一種生物的所有基因）

②部分基因文庫(kù)（只包含一種生物的部分基因，如cDNA文庫(kù)）第一步：目的基因的篩選與獲取拓展：基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程某生物體全部DNA許多DNA片段受體菌群體限制酶與載體連接、導(dǎo)入受體菌群體cDNA某生物體發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA逆轉(zhuǎn)錄與載體連接、導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)第一步：目的基因的篩選與獲取3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（常用）蘇云金桿菌Bt基因？快速獲得大量Bt基因提取前提：已知目的基因或其上下游的核苷酸序列引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸（長(zhǎng)度通常為20-30個(gè)核苷酸）⑴

全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)⑵

原理：DNA的半保留復(fù)制（在體外大量復(fù)制目的基因的核苷酸序列）⑶

原料：DNA模版、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶第一步：目的基因的篩選與獲取復(fù)習(xí)回顧：DNA復(fù)制堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（A與T、C與G配對(duì)保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）(2)條件:4種游離的脫氧核苷酸DNA的兩條鏈DNA解旋酶、DNA聚合酶等ATP(3)復(fù)制原則:能量：模板：原料：酶：半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制(1)特點(diǎn):合成子鏈解旋形成新DNA解旋酶DNA聚合酶第一步：目的基因的篩選與獲取第一步：目的基因的篩選與獲取

DNA復(fù)制和PCR反應(yīng)的條件對(duì)比解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無(wú)需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸（dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常為小的單鏈DNA至少需要2種引物）反應(yīng)還需要其它條件，如控溫系統(tǒng)、緩沖液（一般添加Mg2+）---能夠調(diào)節(jié)pH，激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶第一步：目的基因的篩選與獲取（5）PCR擴(kuò)增的過(guò)程5’3’3’5’3’5’5’3’

變性雙螺旋解開PCR儀①變性：當(dāng)溫度超過(guò)90℃時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈第一步：目的基因的篩選與獲取②復(fù)性：溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合5’3’3’5’復(fù)性3’5’兩種引物3’5’注意：復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)破壞引物與模板堿基互補(bǔ)配對(duì)

復(fù)性溫度過(guò)低，會(huì)造成引物與模板結(jié)合位點(diǎn)增加，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加第一步：目的基因的篩選與獲取③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈5’3’3’5’延伸3’5’3’5’5’3’3’5’第一步：目的基因的篩選與獲取3’5’3’5’5’3’3’5’第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’第一步：目的基因的篩選與獲取5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’第一步：目的基因的篩選與獲取（6）

結(jié)果與鑒定①結(jié)果：重復(fù)循環(huán)多次，每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)水平電泳儀②鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物探究·實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.PCR在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增原理PCR利用了DNA熱變性和DNA半保留復(fù)制的原理。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.材料用具（1）試劑①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水。②電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。③PCR反應(yīng)體系的配方(見教材)DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（2）用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）PCR儀微量離心管DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（1）移液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書，在微量移液管中依次加入各組分。PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA

5-10ul總體積50ul（2）離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。（3）擴(kuò)增：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。4.方法步驟（PCR）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定4.方法步驟（電泳鑒定）（1）配制瓊脂糖溶液：根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。（2）制備凝膠：將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（3）加樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。（4）電泳、觀察：接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：（1）你是否成功擴(kuò)增出

DNA

片段的斷依據(jù)是什么？在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)程度（條帶的分布代表擴(kuò)增產(chǎn)物的類型；條帶的粗細(xì)代表擴(kuò)增產(chǎn)物量的多少）。（2）通過(guò)電泳條帶能否確定擴(kuò)增產(chǎn)物一定是所需的DNA片段？為什么？不能；因?yàn)殡娪緱l帶僅能顯示擴(kuò)增片段的大致長(zhǎng)度，不能顯示精準(zhǔn)的DNA堿基數(shù)量，也不能呈現(xiàn)堿基序列。課堂小結(jié)目的基因的獲取與篩選篩選合適的目的基因獲取目的基因測(cè)序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫(kù)、序列對(duì)比工具利用化學(xué)方法人工合成目的基因通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因隨堂練習(xí)1.下列不屬于獲取目的基因的方法的是(

)A.從基因組文庫(kù)中獲取目的基因B.利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因C.利用逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因D.利用DNA連接酶復(fù)制目的基因答案：D

解析：獲取目的基因的方法有：從基因組文庫(kù)中獲取目的基因、利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因、利用逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因等。DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，利用DNA連接酶不能復(fù)制目的基因，故選D。隨堂練習(xí)2.傳統(tǒng)的多重PCR（MPCR）是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的引物對(duì)，針對(duì)不同的模板或同一模板的不同區(qū)段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，從而得到多個(gè)目的片段的技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MPCR技術(shù)在擴(kuò)增方面取得新的突破，不再局限于在同一反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，而是將不同的引物對(duì)和模板分散于相應(yīng)獨(dú)立的空間中進(jìn)行擴(kuò)增。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(

)A.對(duì)于同一DNA片段的不同區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，不同引物的堿基排列順序不能互補(bǔ)B.同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增不同模板時(shí)需加入更多耐高溫的DNA聚合酶才能使擴(kuò)增正常進(jìn)行C.在目的DNA片段擴(kuò)增時(shí)，若復(fù)性階段溫度控制過(guò)高，可能導(dǎo)致無(wú)產(chǎn)物D.PCR擴(kuò)增DNA時(shí)打開雙螺旋的方式與細(xì)胞內(nèi)不同，實(shí)質(zhì)都是磷酸二酯鍵斷裂解析：A.對(duì)同一模板不同區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，不同引物的堿基排列順序不能互補(bǔ)，如果互補(bǔ)就會(huì)形成雙鏈，不能與模板鏈結(jié)合，不能完成擴(kuò)增，A正確；B.在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增不同模板時(shí)需要加入更多耐高溫的DNA聚合酶才能使擴(kuò)增正常進(jìn)行，因?yàn)閿U(kuò)增不同片段需要結(jié)合的酶的數(shù)量較多，B正確；C.在目的片段擴(kuò)增時(shí)，溫度的控制是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，若復(fù)性階段溫度控制過(guò)高，導(dǎo)致引物不能與模板鏈結(jié)合，可能導(dǎo)致無(wú)產(chǎn)物，C正確；D.PCR擴(kuò)增DNA時(shí)通過(guò)高溫將雙螺旋打開，而細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA復(fù)制通過(guò)解旋酶將雙螺旋打開，二者斷裂的都是氫鍵，D錯(cuò)誤。D隨堂練習(xí)3.反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù),其過(guò)程如圖所示。下列敘述正確的是(

)A.環(huán)化階段,可選E.coli

DNA連接酶而不能選T4DNA連接酶B.圖中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中,沿左側(cè)引物延伸子鏈的方向是逆時(shí)針C.PCR產(chǎn)物是包含所有已知序列和未知序列的環(huán)狀DNA分子,其中含有EcoRI的酶切位點(diǎn)D.應(yīng)選擇引物2和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增答案：B

解析：圖示末端為黏性末端,所以環(huán)化階段,可選E.coli

DNA連接酶也能選T4DNA連接酶,A錯(cuò)誤。據(jù)圖中未知序列的位置可知,圖中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中,沿左側(cè)引物延伸子鏈的方向是逆時(shí)針,沿右側(cè)引物延伸子鏈的方向是順時(shí)針,B正確。根據(jù)題意和圖示可知,DNA分子被限制酶EcoRI切割后環(huán)化,再通過(guò)PCR擴(kuò)增得到包含所有已知序列和未知序列的鏈狀DNA分子;未知序列含有EcoRI的切割位點(diǎn),故PCR產(chǎn)物含有EcoRI的酶切位點(diǎn),C錯(cuò)誤。DNA子鏈合成的方向是5'→3',要通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物,應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,D錯(cuò)誤。隨堂練習(xí)4.熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入與模板DNA某條