...wd......wd......wd...從自然界篩選產乳酸微生物及菌種初步鑒定摘要酸菜是東北地區的一種傳統發酵食品，以自釀酸菜為采集菌種的來源。通過從酸菜汁中別離篩選得到未知乳酸菌菌株。采用BCP選擇培養基的別離方法對菌種進展篩選別離，得到50株乳酸菌菌株。再通過復篩得到4株表現良好的菌株。通過層析和酸堿滴定對乳酸菌進展定性和定量試驗。通過測定OD值和PH值來繪制生長曲線。通過實驗總結出乳酸菌的最正確pH值為7.0和最適鹽濃度為0%-2%以及最正確溫度為37℃，并對菌種進展生理生化鑒定。實驗結果為H2O2酶試驗為陰性，硫化氫產生為陽性，檸檬酸鹽為陽性，產酸不產氣，明膠液化為陰性，石蕊牛奶為陽性，葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖的糖原實驗為陽性。關鍵詞：酸菜；乳酸菌；鑒定目錄13251摘要I7980AbstractII177121緒論1308101.1乳酸菌的概述154881.2乳酸菌的根本屬性1265911.3乳酸菌的開展時期及分類2192451.3.1乳酸菌的開展時期2190461.3.2乳酸菌的分類 2262391.4乳酸菌的發酵特性 2177491.5乳酸菌的應用 3200031.5.1乳酸菌在食品領域的應用 3183611.5.2乳酸菌制劑 4212871.6乳酸菌的生理作用和作用機理 4275761.6.1乳酸菌的生理作用 4182171.6.2乳酸菌的作用機理 511161.7乳酸菌的國內外開展現狀6249251.7.1乳酸菌的開展歷史 6171461.7.2乳酸菌的開展現狀 7207261.8乳酸的生產及應用7308451.8.1乳酸的概述740051.8.2L—乳酸的生產8231341.8.3乳酸提取工藝 10238881.9本課題的目的及研究的意義12123082實驗局部 13220572.1實驗材料與儀器 13136272.1.1實驗材料13242642.1.2實驗儀器1376232.1.3實驗試劑14158802.1.4實驗培養基 1453862.2實驗方法 157522.2.1從自制酸菜汁中別離提純乳酸菌的思路和原理 1593242.2.2培養條件1559182.2.3菌種儲藏15121702.2.4樣品采集15294232.2.5乳酸菌的別離和篩選 16102892.2.6乳酸菌的產酸定性定量試驗16229882.2.7乳酸菌的生理生化鑒定 1786523結果與討論181343.1乳酸菌的形態學鑒定 1862933.1.1初步別離18171693.1.2乳酸菌的復篩18195823.1.3菌株形態19322443.2乳酸菌的產酸定性定量試驗20277333.2.1菌株產乳酸試驗 2049853.2.2乳酸定量試驗 203543.3乳酸菌的生長過程鑒定 2179593.2.1乳酸菌在37℃恒溫培養pH值變化2170033.2.2菌株最適生長起始pH值確實定21172383.2.3乳酸菌株耐鹽性確實定 22140023.2.4乳酸菌的不同溫度生長鑒定 2396733.3乳酸菌的生理生化鑒定 2526052結論 28緒論乳酸菌的概述乳酸菌是對能利用可發酵碳水化合物產生出大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱。自然界中乳酸菌分布十分廣泛，可以存活在各種動物的消化道及其其他器官里。在乳制品、發酵植物食品、自然界的湖泊和泥土都有所發現。人們常常利用乳酸菌產酸等特性來處理和加工食品，延長食物的儲存時間和提高食品的適口性。乳酸菌從發現、別離到分類體系的建設，經過了大約一個世紀。目前，在自然界中已發現的乳酸菌在細菌分類學上至少可劃分成23個屬，共有200多種。涉及到的有關屬則更多，有的只是某些屬中的少數成員。除極少數外，其中絕大局部都是人體內必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國內外生物學家所證實，腸內乳酸菌與安康長壽有著非常密切的直接關系。而人體腸道內乳酸菌擁有的數量，與人類年齡成倒數增長曲線。在平時，安康人比病人多50倍，長壽老人比普通老人多60倍。當人到老年或生病時，乳酸菌數量可能下降100至1000倍，直到老年人臨終完全消失。因此，人體內乳酸菌數量的實際狀況，已經成為檢驗人們是否安康長壽的重要指標。現在，由于抗菌素的廣泛應用，使人體腸道內以乳酸菌為主的益生菌遭受到嚴重破壞，抵抗力下降，安康受到極大的威脅。所以，增加人體腸道內乳酸菌的數量就是明智之舉。人體腸道內以乳酸菌為代表的益生菌數量越多越好。也完全符合諾貝爾得獎者生物學家梅契尼柯夫“長壽學說〞里所得出的結論：乳酸菌=益生菌=長壽菌。在面對抗生素的日漸無能為力的現狀，不斷尋求新的更加有效的生物抗菌產品是正確選擇。瑞典科學家研究發布的結果：治療胃和大腸炎癥時直接喝乳酸菌比用抗生素更好，不安全性根本沒有。而在日本，乳酸菌制品占據日本乳制品市場的85%以上，二十年來研究記錄說明日本青年平均身高增加15厘米，平均壽命達85歲，居世界第一位。這是乳酸菌制品所帶來的直接安康成效。乳酸菌的根本屬性乳酸菌具有的根本特點為:革蘭氏陽性細胞;菌體常排列成鏈，乳酸鏈球菌族，菌體球狀，通常成對或成鏈；乳酸桿菌族，菌體桿狀，單個或成鏈，有時成絲狀、產生假分枝;過氧化氫酶反響為陽性;消耗的葡萄糖50%以上并且產生乳酸;不形成芽孢;極少運動或者不運動;可以分解蛋白質,不產生腐敗產物;可以分解脂肪但是能力較弱。乳酸菌所屬界：細菌界〔Bacteria〕，所屬門：厚壁菌門〔Firmicutes〕，所屬綱：芽孢桿菌綱〔Bacilli〕，所屬目：乳桿菌目(Lactobacillales),所屬科：乳桿菌科(Lactobacillaceae),所屬屬：乳桿菌屬(Lactobacillus)；腸球菌屬(EnterococcusThiercelinandJouhaud)[1].在固體培養基上菌落較小，生長緩慢。在液體發酵培養基內可以很快的生長，離心洗滌可以獲得純度較高的菌體且兼具需氧和厭氧的性能。多數不運動，少數以鞭毛運動。有的也連消化驅動。1.3乳酸菌的開展時期及分類1.3.1乳酸菌的開展時期乳酸茵的分類也經歷了四個主要的開展時期，分別是經典分類時期和化學分類時期、數值分類時期、分子分類時期[2]。1.3.2乳酸菌的分類乳酸菌根據來源大體上可分為兩類。一類是植物源乳酸菌，一類是動物源乳酸菌。植物源乳酸菌，因為取自植物，攝取的量不易受限制，人體不會產生異體蛋白排斥反響，并且植物源乳酸菌比動物源者更具有活力，能比動物源乳酸菌多數倍的數量到達人體小腸內定植，從而發揮乳酸菌穩定的生物成效。因為動物源取自動物，菌種相對于植物源不穩定，生物成效也較不穩定，在大量攝取后，較容易導致人排斥反響。目前對乳酸菌的分類鑒定，是以表型特征和生物學特性為依據來判定其歸屬。這種分類鑒定方法也有其局限性，這種方法耗時耗力，培養條件的改變可能會導致結果發生變化，并且僅依靠主觀選擇的特征，很難對某些區別不明顯的生理生化特性的乳酸菌進展有效的區分[3]。因此隨著分子生物學同其相關技術的開展，分子標記技術可以快速、準確、靈敏的分類并且鑒定乳酸菌。1.4乳酸菌的發酵特性乳酸菌作為化能異養型微生物,代謝活動需要單糖,尤其是葡萄糖,經發酵作用將單糖轉變為低分子的乳酸和其它有機酸,獲取能量[4]。乳酸菌的發酵作用根據代謝途徑不同和產物的差異,可以劃分為異型乳酸發酵和同型乳酸發酵。同型乳酸發酵:葡萄糖經糖酵解途徑幾乎變成100%的乳酸。如鏈球菌、片球菌和局部乳桿菌等。葡萄糖通過糖酵解途徑轉化為兩個乳酸。異型乳酸發酵:葡萄糖的分解完全依賴磷酸戊糖途徑轉變為乳酸和其它產物,根據產物不同,又有兩種類型:第一、明串珠菌和局部乳桿菌將葡萄糖轉變為乳酸、乙醇和二氧化碳。葡萄糖通過磷酸戊糖途徑轉化為乳酸和乙醇和二氧化碳。第二、雙歧桿菌將1mol葡萄糖轉變成1mol乳酸和1.5mol乙酸。兩個葡萄糖通過磷酸戊糖途徑轉化為兩個乳酸和三個乙酸。1.5乳酸菌的應用1.5.1乳酸菌在食品領域的應用人類對于乳酸菌的應用可以追溯到遠古時代，那時候人類就在釀造和食品方面利用了乳酸菌。人類研究和掌握乳酸菌的生長規律，并加以利用。乳酸菌能夠賦予食品柔和的香味和酸甜的口感，可以改善食物的品質和營養，還具有抗菌、抗腫瘤、抗變異原和降低膽固醇、維持微生態環境、增強免疫力等生物學功能，被廣泛的應用在食品工業領域中[5]。在酸乳制品中的應用，是將乳酸菌純種培養活化后制成乳酸菌發酵劑，再添加于經過滅菌處理的鮮乳或者復原乳中，在40~45度下發酵獲得終產物．常用的發酵劑為嗜酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌。經乳酸菌發酵的乳酸菌奶酪蛋白及乳脂被轉化為短肽、氨基酸和小分子的游離脂類等，更易被人體吸收。乳酸與鈣結合形成乳酸鈣，極易被人體吸收，也可被乳糖不耐癥人群選用。乳酸菌奶促進消化，促進胃液分泌，對胃具有保養功能，能抑制腸道內腐敗菌的生長，其生物保健價值遠遠高于牛奶。在釀造業中的應用，是通過乳酸菌產生的乳酸與乙醇酯化生成乳酸乙酯，提高白酒的質量及口感，也可以改善葡萄酒的風味。乳酸菌產生的乳酸是一種呈香物質，可伊提高產品酸度，又可改善風味并且提高產品質量。在發酵肉制品中的應用，是通過發酵產生乳酸降低pH值，從而抑制肉毒桿菌及其它病原微生物的生長繁殖或產生毒素，減少了腐敗。還可以促進亞硝酸鹽的分解，形成穩定的亞硝基肌紅蛋白，促進發色和減少致癌物質一亞硝胺產生；使肌肉蛋白變性形成膠狀組織，增加肉塊間的結合力，可以提高制品的硬度和彈性。在發酵果蔬制品中乳酸菌的應用，是通過同型或異型發酵，產生乳酸、醋酸、丙酸等有機酸，這些酸賦予發酵果蔬制品柔和的酸味；同時產生的微量雙乙酰賦予制品奶油香味；產生的2一庚酮、2一壬酮對爽口、清香有一定作用；低級飽和脂肪酸與脂肪醇所形成的酯類具有水果香味。在飼料中添加乳酸菌，不僅可以提高蛋雛雞成活率和日增重，還可以使斷乳后仔犬體重顯著增加，因此顯著提高飼料利用率。1.5.2乳酸菌制劑利用現代生物技術，發酵生產的具有活性的乳酸菌制劑，是安全、高效的動物保健制劑，目前已經投入廣泛應用固體發酵和液體發酵的兩類活菌制劑。抑制了死的菌體及代謝產物效果不確切的弊端，為動物保健及食品安全保障提供了動力[7]。固態發酵制劑應用移動發酵技術、多菌種復合保質技術、高負壓吸真空技術，好氧厭氧分階段發酵技術，使發酵產品在潮濕狀態保質期到達18個月以上，保證了乳酸菌的活性。液態發酵制劑為養殖場提供小型全自動乳酸菌發酵罐，并提供菌種、培養基，由養殖場自行發酵，隨用隨飲，保證了乳酸菌的活性。1.6乳酸菌的生理作用和作用機理1.6.1乳酸菌的生理作用1、防治有些人種普遍患有的乳糖不耐癥〔喝鮮奶時出現的腹脹、腹瀉等病癥〕。2、促進蛋白質、單糖及鈣、鎂等營養物質的吸收，產生維生素B族等大量有益物質。3、抑制腐敗菌的繁殖，消解腐敗菌產生的毒素，去除腸道垃圾。4、使腸道菌群的構成發生有益變化，改善人體胃腸道功能，恢復人體腸道內菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護人體安康。5、抑制膽固醇吸收，降血脂、降血壓作用。6、抗腫瘤、預防癌癥作用。7、免疫調節作用，增強人體免疫力和抵抗力。8、有效預防女性泌尿生殖系統細菌感染。9、提高SOD酶活力，消除人體自由基，具抗衰老、延年益壽作用。10、控制人體內毒素水平，保護肝臟并增強肝臟的解毒、排毒功能[8]。1.6.2乳酸菌的作用機理通過對大量資料的研究，我們得以知道，乳酸菌有一下功能：調節胃腸道正常菌群、維持微生態平衡，促進動物生長，從而改善胃腸道功能；抑制腸道內腐敗菌生長；提高機體免疫力提高食物消化率和生物效價；降低血清膽固醇，控制內毒素等。乳酸菌通過發酵產生的有機酸、特殊酶系、酸菌素等物質。這些物質具有特殊生理功能。它們可以刺激組織發育，對機體的免疫反響和應激反響、營養狀態、生理功能等產生作用[10]。第一，提供營養物質，促進機體生長。乳酸菌可以通過揮代謝活性，為宿主提供可利用的必需氨基酸、各種維生素〔維生素B族和K等)，還可提高礦物元素的生物活性，進而到達為宿主提供必需營養物質、增強動物的營養代謝、直接促其生長的作用。Dalmin等(2001)研究報道乳酸菌可以改良水質，提高斑節對蝦的存活率、生長速率和安康狀況。Hamad(1979)試驗證明，小麥、稻米等谷物用乳酸菌發酵后，營養價值大大提高。此外，乳酸菌產生的酸性代謝產物使腸道環境偏酸性，而一般消化酶的最適PH值為偏酸性(淀粉酶6.5、糖化酶4.4)，這樣就有利于營養素的消化吸收。何機峻的產生還可加強腸道的蠕動和分泌，也可促進消化吸收養分。第二、改善胃腸道功能，維持腸道菌群平衡動物的整個消化道在正常情況下都寄生有大量微生物。就其作用而言，可分乃三類：①共生性類型，主要是兼性厭氧菌，在生態平衡時，它們的維生素和蛋白質合成、消化吸收、生物拮抗和免疫等功能對宿主有利。②致病性類型，正常情況下數量少，寄生于正常部位，不至于使宿主發病。假設失控，則會導致宿主的不良反響。③中間性類型，即同時具有生理和致病兩種作用。微生物群的平衡，對機體的安康十分重要，而乳酸菌就能夠調節這種微生態平衡，保障宿主正常生理狀態。乳酸菌是腸道常在菌〔常生菌〕，畜禽服用乳酸菌后，可以改變腸道內環境，抑制有害菌繁殖，調整胃腸道菌群平衡。乳酸菌通過粘附素與腸粘膜細胞嚴密結合，在腸粘膜外表定植占位，成為生理屏障的主要組成局部，從而到達恢復宿主抵抗力，修復腸道菌群屏障、治愈腸道疾病的作用。如果這個屏障遭到抗生素或其他因素的破壞，宿土喪失了對外來菌抵抗力，會使具有耐藥性的腸內菌異常增殖而取代優勢菌的位置，造成腸道內微生態平衡的失調。第三、改善免疫能力乳酸桿菌和雙歧桿菌一方面能明顯激活巨噬細胞的吞噬作用，另一方面由于它能在腸道定植，相當于天然自動免疫。它們還能刺激腹膜巨噬細胞、誘導產生干擾素、促進細胞分裂、產生抗體及促進細胞免疫等，所以能增強機體的非特異性和特異性免疫反響，提高機體的抗病能力。Pergidon等(1988)報道，口服乳酸菌后，對巨璇細胞的半乳糖甙酶活性、巨噬細胞的吞噬活性等具有顯著的激活和促進作用。當異物侵入機體時，免疫細胞被乳酸菌激活，增強了機體對異物產生抗體的作用。Chndra(1984)認為，乳酸菌之所以具有有激機體產生抗體的作用，是由于菌體通過淋巴結、粘膜刺激淋巴細胞承受刺激的淋巴細胞再通過腸系膜淋巴結(MIN)循環到血流中，并分布全身，從而調節機體的免疫應笞。第四、抗菌作用研究資料說明：乳酸菌對一些腐敗菌和低溫細菌有較好的抑制作用。可用于防治腹瀉、下痢、腸炎、便秘和由于腸道功能紊亂引起的多種疾病以及皮膚炎癥。其抗菌機制主要表現在以下幾個方面：①產生的乳酸等有機酸能顯著降低環境pH值和Eh(氧化復原電位)值，使腸內處于酸性環境，對于致病菌如痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、彎曲桿菌、葡萄球藺等有拮抗作用；②產生的過氧化氫能夠激活牛乳中的“過氧化氫酶-硫氰酸〞系統，抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌如假單胞菌屬、大腸桿菌類和沙門氏菌屬等；③產生類似細菌素的細小蛋白質或肽類〔抗菌肽〕，如各種乳酸桿菌素和雙歧菌素，對葡萄球菌、梭狀芽孢桿闊以及沙門氏菌和志賀氏菌有拮抗作用。另外，雙歧桿菌等還可將結合的膽酸分解為游離的肌酸，后者對細菌的抑制作用比前者更強。1.7乳酸菌的國內外開展現狀1.7.1乳酸菌的開展歷史早在五千年前，人類就已經在使用乳酸菌。到目前為止，人類日常食用的酸奶、泡菜、調味品醬油等，都是應用乳酸菌這種原始而簡單的又容易得到的天然發酵的代謝產物[13]。早在20世紀初，俄國著名的生物學家，諾貝爾獎獲得者梅契尼柯夫〔Mechnikoff,1845-1916〕，在他的“長壽學說〞里已明確指出，保加利亞的巴爾干島地區居民，日常生活中經常飲用的酸奶中含有大量的乳酸菌，這些乳酸菌能夠定植在人體內，有效地抑制有害菌的生長，減少由于腸道內有害菌產生的毒素對整個機體的毒害，這是保加利亞地區居民長壽的重要原因。這個具有劃時代意義的“長壽學說〞，為人類利用乳酸菌生產安康食品開創了新紀元。今天，利用乳酸菌生產的安康食品已經一躍成為全世界關注的安康食品。1.7.2乳酸菌的開展現狀在發酵型乳酸菌奶飲品已有上百年歷史的歐美國家，發酵型乳酸菌奶飲料在乳制品市場的比例高達80%。隨著消費者安康意識的提高，中國乳酸菌市場開展迅猛，目前產業規模已經超過200億元人民幣，中國的乳酸菌產業正處于快速開展期,正以每年25%的速度遞增。中國乳酸菌奶飲品的年總產量已突破100萬噸。隨著消費者的需求增長，繼世界最大的乳酸菌飲品養樂多進入中國后，國內乳品企業也開場發力乳酸菌產品市場。未來五年將是中國乳酸菌行業快速開展的黃金時期。1.8乳酸的生產及應用1.8.1乳酸的概述乳酸又名丙醇酸或α-羥基丙酸〔2-hydroxypropanoicacid〕，分子式CH3CHOHCOOH，是一種天然存在的有機酸，廣泛存在于人體，動植物，微生物中，因含有不對稱C原子，而具有光學異構現象。分為L—型，D—型，外消旋體的DL—型。易溶于水，乙醇和甘油，微溶于乙醚，但不溶于氯仿，苯，汽油，二硫化碳等。外消旋體為無色糖漿狀液體或晶體，無臭，有酸味，有吸濕性，光學性不活潑，在極冷條件下也不凝固，相對密度為1.4392〔20?40℃〕。熔點18℃，沸點122℃。有防止腐敗發酵的作用，不侵犯健全的組織，但對病變組織敏感[18]。自從1780年Scheele發現乳酸以來，乳酸及其衍生物，廣泛的應用于食品醫藥、飼料、化工等領域。由于人體只能吸收L—乳酸，過多地食用D—乳酸或DL—乳酸可導致人體代謝功能的紊亂，因此世界衛生組織〔WHO〕限制成人每天攝入D—乳酸不得超過100mg/kg.而對L—乳酸則不加限制。L—乳酸是世界公認的三大有機酸之一，其最具應用潛力的是生產聚乳酸(PLA)。PLA除具有和聚苯乙烯相似的光澤度及加工性能外，還可以生物降解，可替代化工合成包裝材料，消除白色污染，由于PLA具有良好的生物相容性，可廣泛應用于醫用材料，如藥物緩釋材料、組織工作材料、手術縫合線、骨折固定等，被認為是最具開展前途的生物可降解材料，其市場潛力巨大，開展前景十分誘人。1.8.2L—乳酸的生產化學合成法化學合成法包括乳腈法和丙烯腈法兩種。乳腈法是將乙醛和冷卻的氫氰酸連續送入反響器生產乳腈，再用泵將所得乳腈參加水解釜中，注入硫酸和水，使乳腈水解得到粗乳酸，將粗乳酸送入酯化釜，參加乙醇酯化生成乳酸酯，經精餾，再送入分解濃縮罐內熱分解得精乳酸。美國的斯特林化學公司和日本的武藏野化學公司之前均采用化學合成法[19]。丙烯腈法是將丙烯腈和硫酸送入反響器中，生成粗乳酸和硫酸氫銨的餛合物，再把混合物送入酯化反響器中與甲醇反響生成乳酸甲酯，把硫酸氫銨分出后，粗酯送入蒸餾塔，塔底獲精酯，將精酯送入第二蒸餾塔，加熱分解，塔底得稀乳酸，經真空濃縮得產品。化學合成法中采用較多的是乳腈法。該法可連續生產，生產本錢低，能耗低，但由于該法所用的原料為乙醛和劇毒的氫氰酸，致使生產的乳酸食用較難為人們所承受，因此，應用受到一定的限制。酶法(1)氯丙酸酶法轉化日本東京大學的本崎等，研究了用酶法催化合成乳酸，分別從惡臭甲單孢菌和假單孢菌的細胞中提取純化了L—2一鹵代酸脫鹵酶和DL—2—鹵代酸脫鹵酶，作用于底物DL—2—氯丙酸，制得L—乳酸或D—乳酸。L—2—鹵代酸脫鹵酶催化L—2—鹵代酸脫鹵；而DL—2—鹵代酸脫鹵酶既可催化L—2—鹵代酸脫鹵，又可催化D—2—鹵代酸脫鹵，在催化時可發生構型轉變。(2)丙酮酸酶法轉化Hummel等人從D—乳酸脫氫酶活力最高的混亂乳桿菌DSM20196菌體中得到了D—乳酸脫氫酶，以無旋光性的丙酮酸為底物制得到D—乳酸。微生物發酵法由于化學合成法所使用的原料有乙醛和劇毒物質氫氰酸，因而合成法生產乳酸大大受到限制，在食品工業中使用也不被民眾承受，此外其生產本錢也較高。酶法生產乳酸雖然可以專一性旋光乳酸，但工藝比照復雜，應用到工業上還有待于進一步研究。微生物發酵法生產乳酸，可通過菌種選育和培養條件的選擇而得到具有專一性的L—乳酸，D—乳酸或DL—乳酸，完全可以滿足聚乳酸的生產需求。微生物發酵法生產乳酸因其原料來源廣泛，生產本錢也較低，產品光學純度高和安全可靠性好等優點而成為目前國內外生產乳酸的主要方法。在乳酸發酵工藝上除了可采用根霉生產L—乳酸外，目前國內外都展開了對細菌發酵生產L—乳酸的研究。原因在于雖然根霉發酵產乳酸存在對營養要求簡單，可以直接利用大量廉價原料以及能夠得到光學純度很高的L—乳酸等優點，但也存在產酸，對糖利用率都較低，發酵需要通氧，能耗大，時間長，副產物多等缺點，而細菌厭氧發酵雖然存在營養要求高，原料本錢高等缺點，但有產酸量大，發酵時間短，無需通氧，能耗低，對糖的轉化率較高，理論上可達100%等優點而同樣受到研究人員的青睞，。Zhang等研究了食淀粉乳桿菌NRRLB4542直接從淀粉發酵生產L—乳酸的條件，淀粉的起始濃度為120g／L，從液化淀粉出發，可在20h生產出濃度為96.2g／L的乳酸。Hujanen等對干酪乳桿菌NRRLB—441產L—乳酸進展優化，在葡萄糖濃度為160g／L時，乳酸濃度最高可到達118.6g／L，他們采用廉價的大麥芽提取物加少量酵母膏(4g／L)取代單獨使用酵母膏(22g／L)，較大的節省了生產本錢。最近幾年來芽孢桿菌發酵生產乳酸受到人們的關注。Danner等采用嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株FA6和IFA9，以葡萄糖為碳源，分批培養發酵生產L—乳酸，糖的轉化率分別為84.0％和98.7％。Poyat等報道：篩選得到能在52℃生長的一株凝結芽孢桿菌TB04，能在培養基不滅菌的條件下發酵生產乳酸，經發酵條件的優化，乳酸的最終濃度55g／L，糖的轉化率為92％。路福平等[發表了芽孢乳酸菌凝結芽孢桿菌TQ33的篩選及產酸條件的研究結果，其最適生長溫度45℃—50℃，厭氧條件下，以葡萄糖為碳源發酵L—乳酸，72h產酸量最高到達67.8g／L，其中L—乳酸含量占96％以上。發酵中和劑新興的發酵工藝如提取與發酵相偶聯的原位別離ISPR技術等，發酵的同時提取乳酸，減輕產物抑制，又不產生廢棄副產物，但對設備要求較高，工藝復雜，設備投資大，因此對成熟低本錢的傳統發酵工藝進展改良后仍可在現階段繼續用于生產。傳統乳酸發酵常用中和劑消除終產物乳酸的抑制，如碳酸鈣，氫氧化鈣，氨水，氫氧化鈉等。其中碳酸鈣本錢低，簡單易用，應用廣泛，但最終會產生硫酸鈣對環境不利；氫氧化鈣則難于添加且不利于局部pH控制，最終也產生硫酸鈣因此應用不多；氨水不產生副產物，容易控制，但發酵存在糖酸轉化率偏低，發酵殘糖偏高等缺點；應用氫氧化鈉則本錢偏高，菌體活性較差。1.8.3乳酸提取工藝L—乳酸發酵液的成分復雜，除L—乳酸外，還包括菌體、殘糖、蛋白質、色素、膠體、有機雜酸、無機鹽等，所以L—乳酸的提取比照復雜。常用的方法有如下幾種。鈣鹽法乳酸鈣結晶—酸解工藝是傳統的別離方法。其流程見圖4圖4乳酸鈣結晶一酸解工藝流程圖該工藝雖具有易于控制、工藝成熟的優點，但其流程長，硫酸及活性炭的用量大，副產物量大，勞動強度高，不能有效別離殘糖，且產品收取率低。也有濃縮液不結晶而直接用硫酸酸解乳酸鈣提取乳酸的工藝。萃取法萃取法是使用不溶或微溶于水的有機溶劑，通過物理或化學萃取方式從粗乳酸中提取乳酸，然后再反萃取，把乳酸從萃取相中別離出來。萃取法不用石灰或石灰石和硫酸，所以不產生CaSO4廢渣，有利于環境保護，操作簡便,占地面積少,對設備腐蝕性小,無細菌污染和操作過程可自動化等優點。應用萃取法的關鍵是尋找高效、無毒、水溶性小、經濟可行的萃取劑。用于乳酸萃取效果較好的載體為一種水不溶性的長鏈叔胺,并將載體溶于油醇后去萃取乳酸,于是載體與乳酸形成乳酸胺絡合物,后被有機相萃取別離,再經反萃取,即可獲得純潔的稀乳酸液,濃縮蒸發后即為成品L—乳酸。近年來，國內外開發出許多新的萃取技術，如雙水相萃取、膜萃取和超臨界萃取等。酯化法經鈣鹽法提取的乳酸不能滿足一些對乳酸有耐熱性要求的工業用途,如用于聚合物工業、焙烤食品以及其他一些附加值高的乳酸產品。將鈣鹽法提取后的乳酸產品在高溫條件下進一步同乙醇或甲醇反響,產生乳酸乙酯或甲酯,再蒸餾別離出乳酸酯,然后水解乳酸酯、提純回收乳酸,水解時釋放出的醇則可重復利用。稀乳酸經濃縮蒸發就可制成高純度、耐熱性好的乳酸,日本武藏野公司已成功將該法運用于L—乳酸的工業生產中,該方法缺點是能耗較高,裝備的投資也較大。吸附法離子交換樹脂、活性炭和聚乙烯吡啶都被用作吸附劑，不過活性炭吸附容量小，選擇性差，重復性差，而離子交換樹脂選擇性高、交換容量大、操作簡單、易于自動控制。吸附法的缺點在于不具備高度專一性，且脫附困難。分子蒸餾法分子蒸餾屬于高真空蒸餾技術，它抑制了常規蒸餾別離效率低、操作溫度高、受熱時間長導致有效成分的聚合、分解等缺點，特別適合于高沸點、熱敏性及易氧化物質的別離。通過分子蒸餾提純L—乳酸，可以到達蛋白質、重金屬離子去除、脫臭、脫色、提純等目的，得到的乳酸也具有較好的耐熱性。電滲析法電滲析技術不僅可以用于偶聯發酵，也可單獨用于發酵液別離提純乳酸。電滲析法是在離子交換技術與膜技術根基上開展起來的一種新的別離提純技術。歐美率先將該技術運用于L—乳酸等有機酸的提取,在L—乳酸的提取過程中使用單極電滲析的目的是別離電解質和非電解質;濃縮乳酸鹽,用雙極電滲析的目的是最終將乳酸鹽變成高純度的乳酸,并回收堿回用到發酵罐中調pH值。該技術的最大優點是別離提純效果好、回收率高、產品質量好,其缺點是能耗高,可以說是極具前景的方法。目前采用該技術的最大困難是日本和美國壟斷了離子交換膜,特別是雙極膜的生產技術,將裝備的售價提得較高。1.9本課題的目的及研究的意義乳酸菌作為一種絕大多數為益生菌的菌種對人類的安康起著重要作用，而選育出優良的乳酸菌菌株對生產有特殊的意義，能夠更突出的表現出乳酸菌的優點和成效。然而目前被運用到生產的乳酸菌種十分的固定，自然界中還有許多未知的乳酸菌種值得我們去尋找篩選、提純并且誘導。本實驗研究目的在于從自然界篩選及鑒定未知的乳酸菌，使其生理生化特征可以表現出來，從而判斷是否能夠在醬油、酸奶、陳醋等發酵產品生產中更好發揮乳酸菌的作用，更好的到達發酵的效果，能夠培育出人類生產中所需要的優質的乳酸菌，方便的應用于發酵產品的生產中2實驗局部2.1實驗材料與儀器2.1.1實驗材料自制酸菜汁中篩選出的4株乳酸菌:R1、R2、R3、R42.1.2實驗儀器設備名稱生產廠家721E型可見分光光度計上海光譜儀器電熱恒溫培養箱〔DHP-9162〕上海－恒科學儀器立式壓力蒸汽滅菌器〔LDZX-50KB〕上海申安醫療器械廠空氣振蕩器〔HZQ-C〕哈爾濱市東聯電子技術開發振蕩器〔DZP-102〕哈爾濱市東聯電子技術開發電子天平〔FA1104〕上海天平儀器廠SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺杭州凈化設備生化培養箱〔LRH-70F〕上海－恒科學儀器電熱恒溫鼓風枯燥箱〔DHG-9203A〕上海－恒科技PH計〔PHS-3C〕上海精科紫外分光光度儀〔W1000〕上海天美可見分光光度計〔721〕天津市普瑞斯儀器光學顯微鏡〔Motic-BA200Digital〕日本尼康公司電爐子〔SX2-4-10〕天津市中環實驗電爐子其他儀器：pH酸度計、試管、容量瓶、量筒、玻璃棒、燒杯、紗布、報紙、錐形瓶、鐵架臺、酒精燈、涂布棒、鑷子等。2.1.3實驗試劑實驗藥品名稱級別生產廠家蛋白胨生物試劑北京奧博星生物技術有限責任公司牛肉粉生物試劑北京奧博星生物技術有限責任公司干酪素生物試劑北京市海淀區微生物培養基制品廠葡萄糖分析純天津市天力化學試劑氯化鈉分析純天津基準化學試劑硫酸銨分析純天津市天力化學試劑磷酸氫二鈉分析純天津市天力化學試劑磷酸二氫鉀分析純天津市博迪化工硫代硫酸鈉分析純天津市百世化工氫氧化鈉分析純天津市博迪化工股份可溶性淀粉生物試劑北京市海淀區微生物培養基制品廠明膠生化試劑天津市風船化學試劑科技L-酪氨酸生化試劑天津市光復精細化工研究所石蕊分析純天津市巴斯夫化工溴甲酚紫分析純天津市光復精細化工研究所1-萘酚分析純天津市光復精細化工研究所酚酞分析純天津市永太化學試劑開發中心對二甲氨基苯甲醛分析純上海試劑工廠酸性品紅生物染色劑北京化工廠無水乙醇分析純天津市天力化學試劑95%乙醇分析純天津市天力化學試劑2.1.4實驗培養基乳酸菌別離培養基別離培養基〔BCP培養基〕配方：5g乳糖、5g酵母浸粉、15g-20g瓊脂、5%溴甲酚紫2.5ml、1000mlH2O、PH6.8-7.0、121℃高壓滅菌15分鐘。根基培養基：葡萄糖0.5g，(NH4)2SO40.2g，檸檬酸鈉0.1g，MgSO4·7H2O0.02g，K2HPO40.4g，KH2PO40.6g，蒸餾水100mL，調PH7.0-.2乳酸菌的生理生化鑒定培養基產硫化氫試驗培養基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏10g，半胱氨酸0.5g，蒸餾水1000ml，pH值為7.0～7.4，121℃滅菌20分鐘。石蕊牛乳試驗培養基：2.5%石蕊水溶液4ml，脫脂牛奶100ml，115℃滅菌20分鐘。硝酸鹽復原試驗培養基：葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7\o"氫"H2\o"氧"O0.5g，酵母膏0.2g，KNO37.8g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20分鐘。檸檬酸鹽試驗培養基：NaCl5.0g，MgSO4·7H2O0.2g，(NH4)H2SO41.0g，K2HPO4·3H2O1.0g，檸檬酸鈉2.0g，溴百里酚藍1%水溶液10ml，水洗瓊脂12.0g，蒸餾水990ml，pH值為7.0，121℃滅菌20分鐘。糖發酵根基培養基：蛋白胨20g，NaCl5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，糖10g，蒸餾水1000mL，121℃下滅菌15分鐘。2.2實驗方法2.2.1從自制酸菜汁中別離提純乳酸菌的思路和原理酸菜發酵是多種細菌共同作用的結果。本實驗利用BCP培養基變色原理，BCP培養基中酵母浸粉提供氮源；葡萄糖是可發酵的糖類；溴甲酚紫為pH指示劑。乳酸菌通過反響使菌落周圍的PH發生改變，從而使培養基變色。在乳酸菌菌落附近培養基會從紫色變成黃色。

因此通過在BCP培養基上不斷的別離培養，可以得到乳酸菌單一菌種。2.2.2培養條件所有平板和斜面均在37℃下恒溫培養，所有液體菌株均在37℃，150rpm的搖床中震蕩培養。2.2.3菌種儲藏將菌種劃線培養于BCP培養基斜面上，于4℃冰箱中保藏，約四周左右，定期轉接。2.2.4樣品采集選擇酸菜缸中的酸菜汁，用消毒針筒抽取100ml液體，裝入干凈塑料瓶中，密封好，并標注采集時間、地點、2.2.5乳酸菌的別離和篩選將各代活化的樣品用無菌生理鹽水稀釋10-1~10-6倍,分別吸取0.1mL涂布于培養皿中,,于37℃恒溫培養48h.挑取長勢優良且單一的菌落反復進展別離純化,直至得到純菌落為止,并將得到的菌落編號保存備用。平板涂布法：平板涂布法是將樣品經稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋液接種到平板上，經過培養，由每個單個細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個但菌落代表原樣品中的一個單細胞。2.2.6乳酸菌的產酸定性定量試驗菌株產乳酸試驗乳酸定性試驗-紙層析法：紙層析法依據極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結合水為固定相，而以有機溶劑作為流動相。由于樣品中各物質分配系數不同，因而擴散速度不同，從而到達別離的目的[20]。乳酸定量試驗通過測定乳酸生成量來確定高產酸的菌株。利用酸和堿在水中以質子轉移反響為根基的滴定分析方法。可用于測定酸、堿和兩性物質。其根本反響為H﹢+OH﹣=H2O也稱中和法，是一種利用酸堿反響進展容量分析的方法。乳酸生成量測定：取乳酸發酵液10mL參加過量CaCO3，然后參加指標劑鈣黃綠素，蒸餾水稀釋至25mL，用0.05mol/L的EDTA-Na2滴定，并以新鮮發酵培養基為空白對照，計算乳酸含量。乳酸含量計算公式：乳酸含量〔%〕=90.083×0.05×VEDTA-Na/102.2.7乳酸菌的生理生化鑒定乳酸菌的形態學鑒定〔1〕菌落形態：觀察別離培養基平板上的菌落形態，并且記錄。(2)菌株形態：將所別離的菌株進展革蘭氏染色，于100倍油鏡下觀察，并且記錄。乳酸菌的生長過程鑒定菌株最適生長起始pH值確實定用乳酸將BCP液體培養基調至pH5.0、6.0、7.0、8.0的不同pH值梯度系列，將培養18h的菌株接種于其中，37℃培養，以空白培養基作為對照，每隔2h測定其OD值(λ=600nm)。菌株耐鹽性確實定用NaCl將MRS液體培養基調至0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％的不同鹽濃度梯度系列，將培養18h的菌株接種于其中，37℃培養，以空白培養基作為對照，每隔2h測定其OD值(λ=600nm)。乳酸菌的生理生化鑒定對別離的菌種分別進展糖發酵產酸試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽復原試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、硫化氫產生試驗和多種糖源實驗。3結果與討論3.1乳酸菌的形態學鑒定3.1.1初步別離〔1〕取酸菜汁1mL，依次參加到裝有9mL生理鹽水的試管中，將菌液稀釋為10-1，取稀釋液1ml,參加到裝有9ml生理鹽水的試管中，將菌液稀釋為10-2，以此類推，稀釋到10-3、10-4一共4個稀釋度，然后分別取0.2mL，涂布于BCP固體培養基上，37℃培養48h．〔2〕對所有使培養基變色的菌落進展編號，并劃線別離4次，最后選擇單菌落，觀察菌落特征，鏡檢確認為純培養，采用革蘭氏染色法。觀察其細胞形態．圖3-1R1菌的顯微鏡觀察圖3-2R3菌株的顯微鏡觀察3.1.2乳酸菌的復篩〔1〕選擇4株安康的遠離其他菌落的菌株再進展培養，分別編號為R1、R2、R3、R4。〔2〕確保R1~R4平板為純菌落培養為止，接種試管斜面。37℃恒溫培養48h。作為保存菌種。〔3〕將編號斜面菌種分別接種到BCP液體培養基的三角瓶中，37℃恒溫培養48h。〔4〕分別取四只三角瓶菌種做革蘭氏染色，觀察并記錄。圖3-2乳酸菌的液體培養圖3-3乳酸菌的菌落形態表3-1菌落的形態學特征菌株染色結果菌落特征R1G+扁平、邊緣光滑、外表粗糙、圓形、乳白色、外表濕潤、直徑為2mmR2G+呈凹透鏡狀突起、圓形、不透明、灰白色、直徑0.5～1.5mmR3G+呈凹透鏡狀突起，光滑、圓形、乳白色、半透明、直徑為1～2mmR4G+扁平、邊緣光滑、外表粗糙、圓形、微黃色、外表濕潤、直徑1mm3.1.3菌株形態將所別離的菌株進展革蘭氏染色，于100倍油鏡下觀察，并且記錄。菌株染色結果細胞形態R1G+菌體表現長桿狀、少量短鏈、無芽孢R2G+菌體呈球狀或豆狀，單個或鏈狀、無芽孢R3G+菌體呈短桿狀，成對或鏈狀排列、無芽孢R4G+菌體呈球狀或豆狀，單個或短鏈排列、無芽孢表3-2菌株的形態學特征3.2乳酸菌的產酸定性定量試驗3.2.1菌株產乳酸試驗所別離菌株在發酵培養基中30℃培養12h，以4%接種量接種至盛有250mL發酵培養基的500mL三角瓶中，30℃靜置培養24h，得乳酸菌發酵液。乳酸定性試驗-紙層析法：展開劑:正丁醇:甲酸:水=80:15:5；用毛細管分別吸取乳酸發酵液，屢次點樣于新華濾紙上，以1.5%的標準乳酸作為對照，平衡2h后進展層析，以1%溴甲酚藍顯色，并計算Rf值。表3-3菌株的乳酸定性實驗結果工程1.5%乳酸R1R2R3R4Rf0.8300.8230.8240.8250.8323.2.2乳酸定量試驗取乳酸發酵液10mL參加過量CaCO3，然后參加指標劑鈣黃綠素，蒸餾水稀釋至25mL，用0.05mol/L的EDTA-Na2滴定，并以新鮮發酵培養基為空白對照，計算乳酸含量。乳酸含量計算公式：乳酸含量〔%〕=90.083×0.05×VEDTA-Na/10表3-4不同菌株產酸含量和酸度結果工程R1R2R3R4pH乳酸含量/%吉爾涅爾度/°T3.656.61213.924.5983.476.81244.564.881對別離所得到的菌株進展紙層析檢測發酵產物中是否產生乳酸，結果見表3-3；進一步試驗定量檢測菌株的產酸能力，結果見表3-4。表3-3菌株的乳酸定性試驗結果由表3-3數據可知，4株菌株發酵液與標準乳酸紙層析具有相近的Rf值，說明菌株發酵產物中含有乳酸。定量試驗說明R1、R3株菌株的產乳酸含量較高，產酸能力也較強。3.3乳酸菌的生長過程鑒定3.2.1乳酸菌在37℃恒溫培養pH值變化將四株菌株液體培養基放置于37℃恒溫培養，分別每2h檢測pH值并記錄。圖3-4四株菌株在37℃中24h的pH變化由圖3-4可以看出，在2~8小時內，四株菌株的pH變化最為明顯。R2菌株在2-8小時內pH最低但和其他菌株差距不明顯。在后期pH根本不變，表示乳酸菌根本代謝穩定。3.2.2菌株最適生長起始pH值確實定用乳酸將BCP液體培養基調至pH5.0、6.0、7.0、8.0的不同pH值梯度系列，將培養18h的菌株接種于其中，37℃培養，以空白培養基作為對照，每隔2h測定其OD值(λ=600nm)。根據4株乳酸菌的表現，我選擇R1號和R2號做不同pH對菌種的生長影響。圖3-5菌株R1在不同pH的生長曲線圖3-6菌株R2在不同pH的生長曲線圖3-2和圖3-3分別為菌株R1和菌株R2在不同pH值培養基中的生長情況，結果說明：兩株菌在初始生長pH值為5~8期間均能生長，菌種1最適初始生長pH值為6.0~8.0，菌種2則最適初始生長pH值為7．0。3.2.3乳酸菌株耐鹽性確實定用NaCI將BCP液體培養基調至0％、2％、4％、6％、8％、10％的不同鹽濃度梯度系列，將培養18h的菌株接種于其中，37℃培養，以空白培養基作為對照，每隔2h測定其OD值(λ=600nm)。圖3-7菌株R1在不同鹽濃的生長曲線圖3-8菌株R2在不同鹽濃的生長曲線圖3-7和圖3-8分別為菌株R1和菌株R2在不同鹽濃度中培養的生長情況，結果說明，菌種1能在小于6％的鹽濃度中生長，當鹽濃度到達8％時幾乎不生長，菌種2能在小于8％的鹽濃度中生長，當鹽濃度到達10％時幾乎不生長。根據以上兩株菌的耐鹽能力，以上兩株菌均能用于需要一定鹽濃度的腌制發酵。3.2.4乳酸菌的不同溫度生長鑒定將培養18h的四株菌株接種于BCP液體培養基中，置于30℃、37℃中恒溫培養，以空白培養基作為對照，