關于細胞工程之核移植技術與動物克隆第1頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日Wilmutetal.1997,Science（1996.6誕生）2第2頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日什么是克隆**？克隆(Clone)***有兩個方面的含義：一是指用無性方式進行無性繁殖的技術。二是指經過無性方式繁殖所得到的后代群體。J.B.S.Haldane，1963，“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克隆

(Clone)”的術語。Clone起源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。3第3頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日什么是克隆**？克隆的生物范疇分子克隆：如基因克隆細胞克隆：如雜交瘤細胞克隆動物克隆：包括核移植技術（核心）卵裂球培養胚胎分割技術4第4頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日什么是動物克隆？動物克隆是一種通過核移植過程進行無性繁殖的技術。基本手段或步驟：1.獲得“供體細胞的細胞核”：早期胚胎細胞、成年體細胞2.獲得無核卵母細胞。3.將目標細胞核經顯微手術移植到去核卵母細胞中4.適當的條件下，移植卵母細胞重新發育成正常胚胎。5.胚胎被移植到適當母體中，獲得與供核個體遺傳性狀已知的個體。5第5頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日第1節核移植技術6第6頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日核移植技術就是利用顯微操作技術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或者將兩個細胞的細胞核（或細胞質）進行交換，從而可能創造無性雜交生物(新品種)的一項技術。一、核移植技術***（Nucleartransfer）概念：7第7頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日1.核移植技術的類型一、核移植技術（Nucleartransfer）胚胎細胞核移植干細胞核移植體細胞核移植類型8第8頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日1.核移植技術的類型1.1b胚胎干細胞核移植

優點：91.1a胚胎細胞核移植優點：分化程度低分化潛能大核移植容易成功具有胚胎細胞上述優點體外培養壽命長，培養更方便第9頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日1.2體細胞核移植特點：1.核移植技術的類型10核供體為成體體細胞范例：克隆綿羊“多莉”體細胞核全能性的恢復第10頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日1.2體細胞核移植----克隆綿羊“多莉”1.核移植技術的類型11第11頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日1.2體細胞核移植----“多莉”的意義1.核移植技術的類型促進生物學和醫藥學的研究獲得更多的優秀動物個體可以復制生產高價藥物的動物12第12頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日為何是突破性的工作：解決了使供體細胞與核受體細胞(去核卵細胞)同步的方法。解決了用體細胞做核供體與轉基因的問題。13第13頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日克隆羊多莉的重要生物學意義***：第一，它證明了：14一個已經完全分化了的動物體細胞核仍然保持著當初胚胎細胞的全部遺傳信息分化了的體細胞具有再分化的全能性（可恢復發育過程中失去的全能性）

遺傳物質是可逆變化的第14頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日第二，多莉的成功提示：15在培育體細胞成為核供體之前，利用“基因靶”技術精確地植入外源目的基因，誘發核基因的遺傳改變再用選擇技術準確地挑選那些含目的基因的細胞作為核供體，從而生產出基因克隆體。第15頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日第三，多莉羊的誕生標記：人類可以對基因進行有規律地控制而解決更多的問題利用克隆技術復制哺乳類動物的最后技術障礙已被突破，在理論上已成為可能。16第16頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日1.2體細胞核移植----“多莉”的后續影響1.核移植技術的類型產生克隆人的倫理問題促進克隆技術的變革2002年，時年6歲的多莉因“老齡性”肺部感染而安樂死，再次引發克隆動物是否“早衰”的爭論17第17頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日2.哺乳動物核移植技術的主要操作程序****(1)核受體的處理和制備18(3)細胞核移植(2)核供體的處理和制備(4)重組核的激活(6)核移植胚胎移入代孕母畜（即胚胎移植）(5)重組胚的體外或體內培養第18頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日克隆羊多莉產生的技術流程19第19頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日核受體細胞選擇：去核卵母細胞常常作為核移植的受體細胞。選擇的生物學依據(或為何選擇卵細胞為核移植受體細胞)：(1)

核受體細胞的準備20在卵母細胞的細胞質含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達程序發生重新排列。使已經分化了的細胞重新回到發育過程的原點，同受精卵一樣開始個體發育過程。第20頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日卵母細胞的來源：用激素對雌體進行超排處理，從輸卵管沖出體內成熟的MII

卵母細胞。從屠宰場收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細胞復合體(COCs)，在體外培養成熟后作為受體。冷凍保存的卵母細胞(1)

核受體細胞的準備21第21頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日卵母細胞的去核處理：(1)

核受體細胞的準備22

將MII卵母細胞置于含細胞松弛素(5-7.5ug/mL)的培養液處理10-20min.

顯微鏡下以持卵管吸住卵母細胞.以尖端去核針刺穿透明帶，吸出第一極體和極體下1/3胞質.第22頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日供體細胞核具備的條件：必須是完整的二倍體，保持有供體動物完整的基因組供體細胞核必須能夠在受體細胞質的作用下，產生細胞分化過程的逆轉，能重新完成從受精到發育成一個正常動物個體的全過程。(2)核供體細胞的準備23第23頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日供體細胞類型：胚胎卵裂球細胞體細胞胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞(2)核供體細胞的準備24第24頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日(3)細胞核移植胞質內注射透明帶下注射25胞質內注射是用一個外徑5～8μm

的注核針吸取供體核后直接注射進卵母細胞胞質內把供體細胞核注射在透明帶與卵母細胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進行細胞融合第25頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日固定針對準極體部位，將卵母細胞固定，去核微吸管對準極體插入透明帶，將極體和部分細胞質吸入吸管中26第26頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日吸管拉出時，細胞膜被拉長形成一個橋，吸管脫離透明帶，質膜被掐斷，擠推出管中的極體和細胞質27第27頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日體外受精卵形成的8細胞牛胚胎經透明質酸處理后，分離出8枚分裂球，吸取細胞核28第28頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日將胚胎細胞的細胞核移入去核卵母細胞的透明帶中29第29頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日(4)激活受精引起的卵母細胞激活人工的激活激活是胚胎發育所必需的人工激活:30是通過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從MII期中解放出來，并轉到“受精”的狀態瞬時直流電脈沖激活化學試劑激活：Ca2+載體、乙醇、SrCl2、放線菌酮、離子霉素人工激活的手段:第30頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日(5)重組胚的體內或體外培養核移植胚的體內培養：一般植入輸卵管4-7d，發育到桑椹胚或囊胚，如牛、羊、豬核移植胚的體外培養：體外培養基培養，發育到桑椹胚或囊胚，如大鼠、小鼠、兔31第31頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日(6)胚胎移植受體母畜的選擇：皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的當地品種移植部位：輸卵管、子宮角移植方法：同期發情處理常規法移植32第32頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日第2節核移植技術的應用33第33頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日二、核移植技術的應用1．制備轉基因克隆動物，

進行生物藥物生產2．培育優良畜種，擴大良種種群3．開展異種動物克隆，拯救瀕危動物轉基因克隆山羊生產：抗凝血因子III轉基因克隆羊、牛生產：a-1-抗胰蛋白酶轉基因克隆牛生產：膠原蛋白轉基因克隆豬生產：人生長激素培育品系更純的實驗動物培養優質畜種培育種間雜交動物，用于育種用兔卵母細胞獲得大熊貓早期胚胎34第34頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日二、核移植技術的應用4．與干細胞技術結合，開展治療性克隆治療性克隆***(Therapeuticcloning)利用核移植技術與轉基因和胚胎干細胞等生物技術結合，體外培養所需細胞、組織器官、以替代或修補患者損傷或患病的細胞、組織、器官的過程運用舉例：患者體細胞去核人卵母細胞重組胚囊胚ES細胞定向分化多巴胺神經元帕金森病胰島細胞糖尿病肝細胞肝纖維化CD4+T細胞艾滋病35第35頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日二、核移植技術的應用5．利用核移植技術，研究生物學的基本問題細胞分化基因調控核質關系基因組印記36第36頁，共40頁，星期日，2025年，2月5日克隆技術存在的問題理論問題分化的體細胞克隆對遺傳物質重編程的機理還不清楚

細胞核內關閉的基因如何重啟表達細胞如何重新恢復全能性及過程克隆動物的連續后代是否會累積突變基因克隆動物是否會記住供體細胞的年齡克隆過程中胞質線粒體所起的遺傳作用等問題不清楚