關于蛋白質分子的特殊運動折疊第1頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日分子生物學中心法則

蛋白質折疊問題又被稱為第二遺傳密碼第2頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日給定一序列，它將怎樣折疊成其特定結構？§9蛋白質的折疊第3頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質折疊研究的理論意義幾乎所有的生命活動都是由蛋白質完成的

而蛋白質鏈只有折疊成天然結構才有活性

生命從蛋白質折疊開始！第4頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質折疊研究的應用意義蛋白質工程的醫藥保健產品市場每年數十億美元

已知二十多種疾病與蛋白質的錯誤折疊有關

（老年癡呆癥、瘋牛病等）蛋白質折疊還是蛋白質組研究的瓶頸之一第5頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Prion疾病第6頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Amyloidosis淀粉樣變性病AttributedtoFrerichs,1862Amyloid淀粉狀蛋白1854RudolphVirchow第7頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日有關蛋白質折疊的幾項重要研究1930s吳憲指出蛋白質變性是肽鏈的構象變化而非共價鍵變化1960sC.Anfinsen

發現還原態RNaseA，在除去還原劑和變性劑后能夠自動氧化恢復活性，提出蛋白質的天然結構是其熱力學最穩態1960s人工合成牛胰島素1940sL.Pauling在蛋白質晶體結構解出之前，根據物理化學原理預測了蛋白質螺旋和折迭結構NobelPrize,1973第8頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日變性條件1.溫度2.

pH3.鹽4.變性劑有機溶劑脲鹽酸胍去垢劑尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28M胍：HN=C(NH2)26M第9頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日NativeProteinDenatured第10頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日變性原理破壞次級鍵不破壞共價鍵溫度：較高時導致蛋白質交聯聚沉，凝固，不可逆pH：破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質鹽：活度，溶解度脲：競爭氫鍵第11頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質的功能決定于它們的天然構象，因而過去研究工作集中在蛋白質的天然構象上，而對變性態沒有給予足夠重視。近來，人們已知道蛋白質的非天然構象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白質折疊和穩定性2、蛋白質的跨膜運輸3、蛋白質的水解和更新第12頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日小分子蛋白質去折疊轉變是可逆的。在周圍環境的誘導下，小分子蛋白質發生去折疊，當將環境刺激因素去掉后，去折疊的蛋白質又可以在折疊。第13頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日第14頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日第15頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日一、問題的提出蛋白質的高級結構是由什么決定的？蛋白質如何由一級結構形成高級結構？如何由一級結構預測三級結構？上述提法實際上要解決相同的問題分子內、分子間的相互作用折疊過程中是否存在中間態第16頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日

絕大多數的小蛋白質的去折疊與再折疊是可逆的“一級結構不僅為空間結構編碼，而且以某種方式規定指導著達到這種空間結構所經歷的途徑”——蛋白質折疊的密碼／立體化學密碼／第二密碼。折疊密碼的復雜性：序列相近的蛋白取相同的空間結構；序列相同的肽段可以取不同的二級結構。 第17頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日兩個主要的考慮方向１．熱力學條件２．動力學條件化學反應觀點； 相變觀點第18頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Milestone第19頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日

Anfinsen對Ribonuclease的研究提出了蛋白質一級結構決定高級結構的假說。Anfinsen'swork,1957-63:formationofnativedisulfidebondsinribonucleaseAandotherproteins.

Keydiscovery:theinformationneededforfoldingiscontainedintheaminoacidsequence.第20頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日二、蛋白質折疊的熱力學考慮Anfinsen的經典熱力學假說：

Anfinsen認為天然蛋白質多肽鏈所采取的構象是在一定環境條件下（如溶液組分、pH、溫度、離子強度等），整個系統的總Gibbs自由能取最低，所以處于變性狀態的多肽鏈能夠在這樣的環境下自發折疊成天然構象。第21頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Anfinsen實驗

變性蛋白的復性實驗從二硫鍵入手,提出假設,實驗驗證其正確性:材料:牛胰核糖核酸酶含4對二硫鍵26-84 40-9558-110 65-72-S-S-交聯方式:7x5x3x1=105種,天然只占其中一種第22頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日牛胰核糖核酸酶第23頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Anfinsen實驗模型1：空間障礙，只允許一種構象（二硫鍵配對）模型2：生物合成的結果模型3：先形成了熱力學穩定構象，然后形成二硫鍵加固實驗否定了前兩種假設，肯定了第三種第24頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Anfinsen實驗實驗一：1.脲變性。RNAase+8M脲+巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2.透析除脲和巰基乙醇，3.pH~8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中，重新氧化復性，酶活力重新獲得第25頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日巰基乙醇第26頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日脲變性過量巰基乙醇導致還原第27頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Anfinsen實驗實驗二1.

脲變性。RNAase+8M脲+巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2.透析除巰基乙醇，然后通O2，再透析除脲結果：酶活性恢復到~0.01第28頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日錯配的二硫鍵只需要加一點點巰基乙醇就可復性第29頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Anfinsen實驗1.由實驗一可知，模型２（生物合成的結果）不成立，因為離體條件下復性的蛋白具有全部酶活性（后來又有實驗證明體外解折疊是完全的，全人工合成）2.由實驗二可知，模型１（空間障礙，只允許一種構象（二硫鍵配對））不成立，否則，復性的蛋白應該具有幾乎全部酶活性3.模型３（先形成了熱力學穩定構象，然后形成二硫鍵加固）能夠解釋both結果。結論：蛋白質一級結構決定三級結構形成三級結構所需要的所有信息包含在一級結構中。第30頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日Anfinsen實驗Anfinsen實驗的啟示：1.成功需要一點點運氣（簡單的單結構域蛋白）2.抓住主要矛盾，善于洞察問題的本質3.

嚴謹的推理不是得到正確結論的必要條件正確的前提＋正確的推導＝正確的結論正確的前提＋錯誤的推導＝正確或錯誤的結論錯誤的前提＋正確的推導＝錯誤的結論（大概率）錯誤的前提＋錯誤的推導＝正確或錯誤的結論Model1and2都有實驗支持第31頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日同時代取得的其它一些結果折疊是以結構域為單位進行的。

ribonucleaseA去除5C-末端殘基后,蛋白質就喪失了正確形成二硫鍵的能力。(H.Taniuchi,J.Biol.Chem.245,5459-5468;1970)含有兩個或多個結構域的蛋白質，相鄰結構域的解折疊是近似相互獨立的。第32頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日LevinthalParadox對一個100個氨基酸殘基的小蛋白質鏈假設：只有主鏈二面角和可以轉動每個二面角只有3個可能值則：總構象數為3200如果：每轉動一次時間為10-15秒則：歷遍所有構象約需1072年而：宇宙年齡為1.5

1010第33頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日三、折疊的動力學考慮有無中間體？最低自由能構象能否達到？折疊過程是怎樣的？第34頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日單一結構域的蛋白質，不存在平衡中間態。兩態折疊第35頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日折疊中間態的發現首先在折疊、去折疊的早期動力學時(快速反應)中發現。(Cytochromec:A.IkaiandC.Tanford,Nature230,100-102;1971;ribonucleaseA:T.Y.Tsong,R.L.BaldwinandE.L.Elson,PNAS68,2712-2715;1971)第36頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日折疊中間態?無輔基肌紅蛋白(Apo-Mb)變性圖（圓二色譜CD結果）第37頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日快速檢測蛋白質折疊的方法第38頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日通過二硫鍵捕捉中間體

－－捕獲二硫鍵碘乙酸抑制二硫鍵的生成，在不同的時間加入碘乙酸，得到二硫鍵數目不同，構象不同的蛋白質，然后利用柱層析分離第39頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日牛胰蛋白酶抑制劑的二硫鍵折疊途徑中間體限速第40頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質折疊過程的時間尺度第41頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日多肽鏈能夠采取的構象個數是個天文數字，平均每個Aa可以有10種構象，100Aa的多肽鏈有10100種可能的構象。從一個構象轉變為另一個構象所需最短時間10－13s，則該蛋白嘗試所有的構象的時間是1085s=1077y，而人們觀察到蛋白質體內、體外折疊的時間是10-1～10-3s.

結論：蛋白質的折疊不是隨機嘗試所有可能的構象直到遇到某個自由能最低的構象，而是沿著某些確定的途徑進行的。蛋白質的天然構象未必是最低自由能的構象，而是動力學途徑中所能得到的穩定的構象。LevinthalParadox第42頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日能量偏移限制了折疊過程中對不合理構象的嘗試第43頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日對蛋白折疊過程的共識

－－兩種過程成核：小蛋白多步：大蛋白，以結構域為單位第44頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質折疊的啟動疏水塌縮經熔球中間態（moltenglobulestate）二級結構生成框架結構模型特殊作用的啟動Disulfidebonds去折疊態中的殘留有序結構第45頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日第46頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日1、局部肽段形成一些構象單元（

螺旋、

折疊和轉角等）——Motifs——三級結構；

2、肽鏈內部的疏水作用引起一個塌陷過程，然后經調整，形成不同層次的結構。3、“熔球態”的中間狀態。在熔球態中，蛋白質的二級結構已基本形成，蛋白質的整體空間結構也初具規模。在熔球態時，分子立體的結構再作一些局部調整，最后形成正確的立體結構第47頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質折疊的現代研究從頭算(abinitio

)預測1D->3D目標：疏水表面埋藏最大，loop熵減最小設計新的蛋白質結構構象病的研究蛋白質錯誤折疊產生淀粉樣纖維，導致構象病，eg:Alzheimer'sandParkinson'sdiseases(J.W.Kelly,NatureStruct.Biol.9,323-325;2002).第48頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日第49頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日折疊過程的動力學模擬動力學模擬能夠成功的再現折疊過程的細節，例如過渡態的結構(D.Baker,Nature405,39-42;2000)和折疊中間體

(C.Clementi,P.A.JenningsandJ.N.Onuchic,PNAS97,5871-5876;2000)第50頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日BakerD.等認為，如果多肽鏈所采取的構象中只有一個低自由能狀態，即天然構象，則所有非天然構象多肽鏈將遵循經典熱力學假說，由高能態向低能態轉變，最終形成天然構象。但有些蛋白，天然構象也許并非是多肽鏈自由能最低的構象或唯一的低能構象，多肽鏈采取非天然的構象也很穩定，而這兩種構象之間轉變需要克服很高勢壘而難以實現，那么蛋白質在折疊過程中就會有兩種途徑的競爭，一種是正確折疊形成天然構象，一種是錯誤折疊形成非天然構象。蛋白質之所以能夠形成正確的構象，是由于一些因素在蛋白質折疊的動力學過程中起驅動作用。第51頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日“輔助性組裝學說”相對于“自組裝”學說，認為蛋白質多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質分子的幫助，分子伴侶與折疊酶一起，構成了兩種重要的輔助折疊分子。第52頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日折疊酶折疊酶催化蛋白質折疊過程中共價鍵的異構化，主要有有PDI和PPI。PPI，脯胺酰順反異構酶PDI，二硫鍵異構酶第53頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日四、分子伴侶（chaperone）

許多蛋白質的多肽單體在離體條件下能折疊、組裝成具有生物學功能的聚合體，但在體內絕大多數新生肽三維結構的形成，需要一類稱為分子伴侶的輔助蛋白的存在。分子伴侶是能夠結合和穩定另外一種蛋白質的不穩定構象，并能通過有控制的結合和釋放，促進新生多肽的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸等的一類蛋白。在動物、植物、細菌內廣泛分布和存在，其功能是介導其它蛋白質的折疊和裝配，而本身卻不是最終功能蛋白質分子的組成部分。第54頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日定義一類在序列上沒有相關性但有共同功能的蛋白質，它們在細胞內幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質結構執行功能時的組份.第55頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日分子伴侶的特征

從參與促進一個反應而本身不在最終產物中出現這一點來看，分子伴侶具有酶的特征。但從以下三方面來看，分子伴侶和酶很不同。1、分子伴侶對靶蛋白沒有高度專一性，同一分子伴侶可以促進多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結構、性質和功能都不相關的蛋白質。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構象，釋放底物，進行再循環。3、它和肽鏈折疊的關系，是阻止錯誤折疊，而不是促進正確折疊。4.多能性（脅迫保護防止交聯聚沉，轉運，調節轉錄和復制，組裝細胞骨架）5.進化保守性第56頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日分子伴侶的分類伴侶素家族(Charperonin,Cpn)GroE(Hsp60)家族和Tric家族熱休克蛋白70家族(Hsp70)熱休克蛋白90家族(Hsp90)其它種類的分子伴侶應激蛋白第57頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日第58頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日第59頁，共71頁，星期日，2025年，2月5日五、蛋白質折疊/去折疊的實驗研究方法Fast/Ultrafastmixing

Stopped-flow,quenchflow,continuousflow,..