關(guān)于蛋白翻譯后修飾第1頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日1定義

翻譯后修飾（英語：Post-translationalmodification，縮寫PTM；又稱后轉(zhuǎn)譯修飾）是指蛋白質(zhì)在翻譯后的化學修飾。對于大部份的蛋白質(zhì)來說，這是蛋白質(zhì)生物合成的較后步驟。第2頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2蛋白質(zhì)翻譯后修飾的類型

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是一個復雜的過程，目前在真核生物中20種以上的修飾類型，比較常見的為甲基化、乙酰化、糖基化、泛素化、磷酸化以及近年發(fā)現(xiàn)的SUMO化。第3頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.1甲基化

蛋白質(zhì)的甲基化修飾是在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下,在賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈氨基上進行的甲基化。是指從活性甲基化合物(如S－腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核酸等進行化學修飾形成甲基化產(chǎn)物。第4頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日組蛋白甲基化

是發(fā)生在組蛋白合成之后,以硫代腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體,在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的(histonemethyltransferase,HMTases)的催化下,將基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的Lys或Arg殘基上。

組蛋白甲基化組蛋白賴氨酸甲基化.組蛋白精氨酸甲基化第5頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日組蛋白甲基化1.組蛋白賴氨酸甲基化

組蛋白賴氨酸甲基化發(fā)生在H3-K4,H3-K9,H3-K27,H3-K36,H3-K79和H4-K20上,還可發(fā)生于H1N端。H3-K9,H3-K27,H4-K20的甲基化與染色體的鈍化過程有關(guān),而H4-K9的甲基化可能與大范圍的染色質(zhì)水平的抑制有關(guān)。H3-K4,H3-K36,H3-K79位的甲基化與染色體轉(zhuǎn)錄激活過程有關(guān),其中H3-K4的單甲基化修飾可以對抗H4-K9甲基化所導致的基因抑制。第6頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日第7頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日組蛋白的甲基化2.組蛋白的精氨酸甲基化

組蛋白精氨酸甲基化位點為H3-R2,H3-R8,H3R17,H3-R26,H4-R4它們都可以增強轉(zhuǎn)錄。第8頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日第9頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.2乙酰化

乙酰化其主要講把一種乙酰官能基團添加到另一種有機化合物上,并進行結(jié)合的過程。乙酰化也是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要形式。組蛋白等許多蛋白都可以發(fā)生乙酰化。第10頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.2乙酰化

乙酰化修飾過程主要發(fā)生在組蛋白上，是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)催化的，其反過程去乙酰化由組蛋白去乙酰酶(histonedeacetylases，HDs或者HDACs)催化的。核心組蛋白的N-末端富含賴氨酸，生理條件下帶正電，可與帶負電的DNA或相鄰的核小體發(fā)生作用，導致核小體構(gòu)象緊湊及染色質(zhì)高度折疊。乙酰化使組蛋白與DNA間的作用減弱，導致染色質(zhì)構(gòu)象松散，這種構(gòu)象有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的接近，從而可以和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進基因的轉(zhuǎn)錄;去乙酰化則抑制基因轉(zhuǎn)錄。第11頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日蛋白質(zhì)乙酰化示意圖第12頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.3糖基化

蛋白質(zhì)的糖基化是低聚糖以糖苷的形式與蛋白上特定的氨基酸殘基共價結(jié)合的過程。

糖基化的過程主要是在糖基轉(zhuǎn)移酶的幫助下，使低聚糖以糖苷的方式移動到蛋白質(zhì)分子上，并與蛋白質(zhì)分子上特定的氨基酸殘基進行共價結(jié)合作用而構(gòu)成糖苷鍵的經(jīng)過。

第13頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.3糖基化

在真核細胞中普遍存在低聚糖通過糖苷鍵與蛋白質(zhì)上特定的氨基酸共價結(jié)合的形式，主要包括O糖基化、N糖基化、C甘露糖化和GPI(glycophosphatidlyinositol)錨定連接。2.3.1O糖基化發(fā)生部位：O糖基化多發(fā)生在臨近脯氨酸的絲氨酸或蘇氨酸殘基上；

構(gòu)型：糖基化位點處的蛋白多為β構(gòu)型；

過程：O多聚糖以逐步加接單糖的形式形成低聚糖，主要在高爾基體與細胞核或細胞質(zhì)中形成。第14頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.3糖基化

發(fā)生在高爾基體上：起始于絲氨酸和蘇氨酸羥基上連接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及海藻糖等的還原端;

發(fā)生在細胞核和細胞質(zhì)中：在絲氨酸或蘇氨酸殘基上連接一個單糖——N-乙酰葡萄糖胺。在哺乳動物體內(nèi)最常見的O糖基化形式是由GalNAc轉(zhuǎn)移酶催化的O-GalNAc糖基化，進而連接Gal，GalNAc或者GlcNAc部分。第15頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.3糖基化2.3.2N糖基化

N糖基化是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由糖基轉(zhuǎn)移酶催化，在內(nèi)分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白的天冬酰氨殘基的氨基上結(jié)合寡糖的過程。普遍認為N位糖基化發(fā)生在蛋白Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa為除脯氨酸外的所有氨基酸殘基)序列上,少數(shù)情況下Asn-Xaa-Cys序列也作為糖基化位點。2.3.3C甘露糖化 C甘露糖化是將一分子α-mannopyranosyl殘基通過C-C鍵連接到色氨酸吲哚環(huán)C-2上，這種糖基化方式多發(fā)生在模體W-X-X-W，W-XX-C或者W-X-X-F的第一個色氨酸殘基上。

第16頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.3糖基化2.3.4

GPI錨定連接 GPI錨定連接指的是磷脂酰－纖維糖組在靠近蛋白C端部位結(jié)合，將蛋白連接到細胞膜上。 蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應，從而有糖蛋白這種物質(zhì)的產(chǎn)生，此過程一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生，并且糖基化擁有很多功效，主要是對調(diào)控蛋白質(zhì)發(fā)生修飾和改善蛋白質(zhì)的生物作用。第17頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.3糖基化細胞中涉及糖基化的蛋白質(zhì)第18頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化

泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子，并對靶蛋白進行特異性修飾的過程。

泛素由76個氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細胞內(nèi)，故名為泛素。 共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶識別并降解,這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑.與消化道內(nèi)進行的蛋白質(zhì)水解不同,從泛素與蛋白的結(jié)合到將蛋白水解成小的肽段,整個水解過程需要能量參與。第19頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化2.4.1泛素-蛋白酶系統(tǒng)

泛素-蛋白酶系統(tǒng)是存在于所有真核生物細胞的調(diào)控系統(tǒng)。降解過程中需要三種酶的參與:泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素蛋白質(zhì)連接酶(E3)。泛素化降解蛋白的過程中對蛋白的特異性識別依賴E3.由E2s和E3s介導的泛素化過程可以被去泛素化酶(DUBs)逆轉(zhuǎn).。第20頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化

目前發(fā)現(xiàn)的DUBs可分為兩大類:泛素碳端水解酶(ubiquitinC-terminalhydrolases,UCHs)和泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-spicificprocessingproteases,UBPs)，兩者都是半胱氨酸水解酶。泛素化降解蛋白的過程中對蛋白的特異性識別依賴E3.由E2s和E3s介導的泛素化過程可以被去泛素化酶(DUBs)逆轉(zhuǎn)通常情況下,UCHs主要水解羰基端的酯和泛素的氨基鍵,也可以分解泛素前體,生成活潑的泛素分子;UBPs分解泛素多聚體鏈。第21頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化2.4.2泛素化在生命體中的作用

泛素化對于細胞分化、細胞器的生物合成、細胞凋亡、DNA修復、新蛋白生成、調(diào)控細胞增殖、蛋白質(zhì)輸運、免疫應答和應激反應等生理過程都起到很重要的作用。

Bence等發(fā)現(xiàn),蛋白的沉積可直接削弱泛素-蛋白酶系統(tǒng)的功能.兩種不相關(guān)但有聚合傾向的蛋白的瞬時表達,幾乎可以完全抑制泛素-蛋白酶系統(tǒng).由于泛素介導的蛋白質(zhì)水解在調(diào)節(jié)細胞活動中的重要地位,引起蛋白聚集的潛在機制將導致細胞的紊亂和細胞凋亡。第22頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化

泛素化也是組蛋白修飾的一種重要形式,組蛋白的H2A和H2B是泛素化多發(fā)位點,已經(jīng)找到了組蛋白H2B泛素化酶[13~15],并且發(fā)現(xiàn)組蛋白H2B泛素化和組蛋白甲基化存在關(guān)聯(lián)。

激活子的泛素化對于轉(zhuǎn)錄激活是十分重要的。2001年Salghetti等[19]提出,泛素化可以作為激活作用和激活子重新構(gòu)造的雙信號,調(diào)節(jié)TAD功能。E3Met30使轉(zhuǎn)錄激活子VP16TAD泛素化。第23頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化泛素-蛋白酶系統(tǒng)對蛋白特異性水解機理第24頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.4泛素化DUBs參與的泛素調(diào)控第25頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.5磷酸化

磷酸化是通過蛋白質(zhì)磷酸化激酶將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白的特定位點上的過程。

在有機體內(nèi)，磷酸化是蛋白翻譯后修飾中最為廣泛的共價修飾形式，同時也是原核生物和真核生物中最重要的調(diào)控修飾形式。磷酸化對蛋白質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著重要調(diào)節(jié)作用，涉及多個生理、病理過程，如細胞信號轉(zhuǎn)導、腫瘤發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等。第26頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.5磷酸化磷酸化的過程作用位點：蛋白上的Ser,Thr,Tyr殘基

大部分細胞過程實際上是被可逆的蛋白磷酸化所調(diào)控的,至少有30%的蛋白被磷酸化修飾。可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細胞信號轉(zhuǎn)導、腫瘤發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等.Fisher和Krebs因其在蛋白質(zhì)可逆磷酸化作為一種生物調(diào)節(jié)機制方面的研究而獲得1992年諾貝爾生理學及醫(yī)學獎。第27頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.5磷酸化磷酸化調(diào)節(jié)細胞的過程第28頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.5磷酸化細胞信號轉(zhuǎn)導過程：一些激素或細胞因子與細胞膜受體或細胞內(nèi)受體結(jié)合并被激酶激活,激素或信號因子隨著激酶的磷酸化也被磷酸化,引起細胞內(nèi)的信號效應。癌癥研究中：微管蛋白的磷酸化可能導致癌癥的發(fā)生.細胞中使用“最后檢驗點策略”(LCP)控制細胞凋亡,即將含有硝基化酪氨酸的α-微管蛋白組裝到微管上,這將導致微管功能失常而最終導致細胞凋亡.但如果微管蛋白酪氨酸連接酶(TTL)被磷酸化,將可能使細胞“躲過”LCP控制的細胞凋亡,從而最終發(fā)展成為癌細胞.第29頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日2.5磷酸化DNA新陳代謝的研究中：細胞中DNA損傷可導致人的復制蛋白A(RPA)32kD亞基N端的過度磷酸化,這有助于調(diào)控DNA的新陳代謝,促進DNA修復.有數(shù)據(jù)顯示,過度磷酸化會導致RPA構(gòu)象改變,降低DNA復制的活性,但不會影響DNA的修復。2.6SUMO化SUMO為小泛素相關(guān)修飾物(smallubiquitin-relatedmod-ifier，SUMO)分子，是一種近年發(fā)現(xiàn)的泛素樣分子，也參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾，但是不介導靶蛋白的蛋白酶體降解，而是可逆性修飾靶蛋白，參與靶蛋白的定位及功能調(diào)節(jié)過程。第30頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)3.1甲基化研究方法及關(guān)鍵技術(shù)甲基化特異性的PCR：其基本原理是把所有的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理，如此做是因為尚未發(fā)生甲基化修飾的胞嘧啶都會被作:用變?yōu)槟蜞奏ぃM行甲基化修飾的胞嘧啶則不會發(fā)生改變。由上面的原理可知，采用不同種類的引物做PCR，即可檢測出這種微弱的變化，這樣就能確定基因是否存在甲基化。亞硫酸氫鹽測序法：利用重亞硫酸鹽對DNA進行處理，此過程會使沒有進行甲基化的胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃM行甲基化的基團則不會。然后把經(jīng)作用的物質(zhì)為基礎(chǔ)，加入甲基化特異性的物質(zhì)(primerI)或者非甲基化的物質(zhì)(primerII)，使其進行特異性的擴增。高分辨率熔解曲線法第31頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)3.2乙酰化研究方法及關(guān)鍵技術(shù)通過生物質(zhì)譜鑒定乙酰化修飾位點：質(zhì)譜技術(shù)通過檢測到的肽段的質(zhì)量與預測的肽段的質(zhì)量進行對比，如果二者質(zhì)量相差42amu則認為在氨基酸殘基或在蛋白質(zhì)末端發(fā)生乙酰化修飾。通過從鑒定到的肽段的N末端或C末端逐個分析得到的b離子或y離子，就可以確定發(fā)生乙酰化修飾的氨基酸位點。第32頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)基于特異性識別乙酰化賴氨酸殘基的乙酰化抗體：對于賴氨酸的乙酰化修飾，Kim及其同事用免疫親和純化技術(shù)富集賴氨酸乙酰化修飾的肽段，在Hela細胞的細胞質(zhì)、細胞核和線粒體中發(fā)現(xiàn)了195種賴氨酸乙酰化修飾蛋白。但是，賴氨酸乙酰化抗體只能特異性識別賴氨酸殘基發(fā)生修飾的蛋白質(zhì)或肽段，不能檢測到絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾。用特異性識別絲氨酸或蘇氨酸乙酰化修飾的抗體將大大有利于絲氨酸和蘇氨酸乙酰化修飾的蛋白質(zhì)組學分析。第33頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)以標記底物為基礎(chǔ)的方法：Yu及其同事在酶GNAT的作用下，用氯代乙酰化CoA與其作用底物L12反應，導致氯代乙酰化L12的生成。然后將氯代乙酰化L12與熒光素His18俘獲的肽段一起孵育，經(jīng)過氯消除后，純化后的標記的底物通過熒光自顯影便可看到。3.3糖基化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)放射性標記法：其過程分為以下幾步進行:首先，是對所需的糖進行特殊標記;其次，把處理好的糖加入培育好的細胞或組織中;最后，就利用放射性自顯影技術(shù)對其進行鑒定。第34頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)分子熒光標記法：鑒定糖基化蛋白最為普遍和最具效率的技術(shù)當屬熒光分子標記法，其基本原理是因為一部分的糖蛋白擁有自發(fā)光特點，所以能直接采用所檢測的熒光值說明蛋白進行糖基化修飾的程度，熒光值是利用熒光分光計來測量的。電泳法：最古老對糖蛋白進行鑒定的技術(shù)便指電泳法，其包含單、雙向電泳兩種，這兩種技術(shù)能夠鑒定出糖蛋白。日常使用親和電泳比色法和SDS－PAGE法對糖基化程度的高低及糖基化中是否發(fā)生血紅蛋白的隔離進行鑒定。第35頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)凝集素標記法：對糖蛋白進行鑒定，最普遍使用的方法就是這種，因為凝集素具有特異功能，能主動吸附糖蛋白，且操作原理簡單易懂，因此得到廣泛的認可。抗體標記法：抗體標記法是針對糖蛋白所帶糖鏈的類型制備各種抗體，對糖蛋白進行檢測。化學酵素法：半乳糖基轉(zhuǎn)移酶能使糖蛋白自動地攜帶含酮基的蛋白毒素抗體。第36頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)3.3磷酸化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)免疫沉淀法：此技術(shù)的作用機制是要制備出一種特殊的抗體，它能對所有含磷酸化殘基的蛋白進行免疫沉淀，從而能高效地鑒定磷酸化蛋白。流式細胞儀：實驗證明，流式細胞儀不僅可以測試轉(zhuǎn)錄活化基因STAT的活躍性和檢測信號傳導的作用，還能利用它檢測熒光強度，來分析酪氨酸磷酸化蛋白的濃度大小。雙向凝膠電泳法：現(xiàn)今國際上一般是利用2D凝膠電泳對磷酸化蛋白進行鑒定的，此項技術(shù)已經(jīng)在得到科學家的廣泛認可，及得到普遍的應用。第37頁，共42頁，星期日，2025年，2月5日3研究方法及關(guān)鍵技術(shù)固相金屬親和色譜：研究發(fā)現(xiàn)，這種方法最開始是被應用在磷蛋白進行親和純化的過程中，固相金屬和磷蛋白中的磷酸殘基之間具有不錯吸引力，從而使得這些離子能夠被固定在糖蛋白上，最后利用IMAC柱就可以聚集那些進行磷基化的蛋白質(zhì)，從而對磷蛋白進行了鑒定。3.4泛素化與SUMO化修飾的研究方法 一般先利用6xHis這種物質(zhì)對泛素蛋白進行標記處理，再