QB/TXXX—20XX蛋白酶活力的測定本文件規定了醬油和黃豆醬的菌種、種曲、成曲酶活力的測定方法。本文件適用于醬油和黃豆醬的菌種、種曲、成曲酶活力的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義3.1中性蛋白酶活力單位neutralproteaseactiveunit在溫度為40℃、pH值為7.2的條件下，在1min內水解酪蛋白產生相當于1μg酪氨酸的酶量，定義為1個中性蛋白酶活力單位。3.2酸性蛋白酶活力單位acidicproteaseactiveunit在溫度為40℃、pH值為3.0的條件下，在1min內水解酪蛋白產生相當于1μg酪氨酸的酶量，定義為1個酸性蛋白酶活力單位。3.3堿性蛋白酶活力單位alkalineproteaseactiveunit在溫度為40℃、pH值為10.5的條件下，在1min內水解酪蛋白產生相當于1μg酪氨酸的酶量，定義為1個堿性蛋白酶活力單位。4原理蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪蛋白底物產生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等在堿性條件下，可將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍與鎢藍，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。采用分光光度計（波長660nm）測定其吸光度，進而計算蛋白酶活力。5試劑和材料5.1試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的三級水。5.1.1鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）。QB/TXXX—20XX5.1.2鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）。5.1.3硫酸鋰（Li2SO4）。5.1.4溴（Br）。5.1.5無水碳酸鈉（Na2CO3）。5.1.6三氯乙酸（CCl3COOH）。5.1.7磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H20）。5.1.8硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）5.1.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。5.1.10干酪素。5.1.11氫氧化鈉（NaOH）。5.1.12酪氨酸（C9H11NO3）。5.1.13鹽酸（HCl）。5.1.14乳酸（C3H6O3）。5.1.15乳酸鈉（C3H5NaO3）。5.2試劑配制5.2.1福林試劑（Folin試劑可購買市售產品或自行配制，配制方式為：于2000mL磨口回流裝置內，加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸160mL，文火回流10h。取去冷凝器，緩慢加入硫酸鋰（Li2SO4）50g（防止過熱狀態下加入硫酸鋰反應劇烈，導致溶液噴出）、水50mL，混勻，加入2～3滴液溴，再煮沸15min，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加2～3滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000mL，用細菌漏斗（No4～5）或中性濾紙過濾，置于棕色瓶中保存，有效期為1年。此溶液使用時加2倍水稀釋，即成已稀釋的福林試劑，現配現用。5.2.2碳酸鈉溶液（0.4mol/L）：稱取無水碳酸鈉（Na2CO3）42.4g，定容至1000mL。5.2.3三氯乙酸（TCA）溶液（0.4mol/L）：稱取三氯乙酸（CCl3COOH）65.4g，定容至1000mL。5.2.4磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H20）31.2g，定容至1000mL，即成A液。稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.63g，定容至1000mL，即為B液。取A液28mL和B液72mL，再用水稀釋1倍，即為磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）。5.2.5乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）:稱取80%～90%乳酸10.6g，定容至1000mL，即成A液。稱取70%乳酸鈉16g，定容至1000mL，即為B液。取A液16mL和B液1mL，再用水稀釋1倍，即為乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）。5.2.6硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.025mol/L，pH10.5）：稱取硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）9.54g，氫氧化鈉（NaOH）1.60g，加水900mL，攪拌均勻，用1mol/L鹽酸溶液或0.5mol/L氫氧化鈉溶液調整pH至10.5±0.05，定容至1000mL。5.2.7酪蛋白溶液（0.2g/L準確稱取干酪素2g（精確至0.002g加入氫氧化鈉溶液（0.1mol/L）10mL并在水浴中加熱使溶解（必要時用小火加熱煮沸然后用磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）定容至100mL即成，此溶液用于檢測中性蛋白酶活力。配制時將磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）更換為乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）或硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.025mol/L，pH10.5），則對應的酪蛋白溶液分別用于檢測酸性蛋白酶活力、堿性蛋白酶活力。配制后應及時使用或放入冰箱內保存，否則極易繁殖細菌，引起變質，保存期不超過三天。5.2.8酪氨酸溶液（100μg/mL準確稱取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g（精確至0.0001g逐步加入6mL鹽酸溶液（1mol/L）使其溶解，用鹽酸溶液（0.2mol/L）定容至100mL，其濃度為1000μg/mL，再吸取此液10mL，以鹽酸溶液（0.2mol/L）定容至100mL，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也應及時使用或放入冰箱內保存，以免繁殖細菌而變質。6儀器和設備6.1天平：感量為0.1mg。6.2分光光度計：波長660nm。QB/TXXX—20XX6.3恒溫水浴鍋。6.4移液管：1mL、2mL、5mL、10mL等。7分析步驟7.1中性蛋白酶活力的測定7.1.1標準曲線的繪制按表1配制不同濃度的酪氨酸溶液，并分別吸取1mL酪氨酸溶液于1～6號試管中，分別加入碳酸鈉（0.4mol/L）5mL、已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后于40℃±1℃水浴中保溫發色20min。保溫結束后立即取出，采用分光光度計（波長660nm）測定吸光度，測定三次并取平均值。將1～6號試管所測得的吸光度減去1號試管所測得的吸光度，則為凈吸光度。以凈吸光度為橫坐標，酪氨酸標準使用液濃度為縱坐標，繪制標準曲線。利用線性回歸方程計算吸光度為1時酪氨酸的量（即K值）。K值應在95～100范圍內，否則需重新按照6.1的要求進行操作。表1酪氨酸標準使用液配制成分成分試管編號123456100μg/mL酪氨酸溶液，mL02468用水定容的體積，mL86420酪氨酸最終濃度，μg/mL04060807.1.2樣品稀釋液的制備7.1.2.1酶制劑稱取酶制劑樣品0.100g（精確至0.001g加入磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）并定容至100mL；吸取稀釋液5mL，加入磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）稀釋至25mL，即成5000倍的樣品稀釋液。7.1.2.2成曲酶稱取充分研細的成曲樣品5g（精確至0.001g），加水至100mL，于40℃±1℃水浴中保溫1h，期間每隔20min攪拌1次。保溫結束后立即取出，用磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）定容至適當體積（根據酶活力確定定容體積），搖勻后采用中速定性濾紙過濾，濾液備用。7.1.3樣品測定取15×100mm試管3支，編號1、2、3（也可做2只），分別加入樣品稀釋液1mL，置于40℃±1℃水浴預熱2min，再加入經同樣預熱的酪蛋白溶液（0.2g/L）1mL，再次置于40℃±1℃水浴保溫并精確計時10min。保溫結束后立即加入三氯乙酸（0.4mol/L）2mL以終止反應，并繼續保溫20min，使殘余蛋白質沉淀后過濾。另取15×150mm試管3支，編號1、2、3，每管中加入濾液1mL，再加碳酸鈉（0.4mol/L）5mL、已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后于40℃±1℃水浴保溫發色20min后，立即取出，采用分光光度計（波長660nm）測定吸光度。7.1.4空白試驗取15×100mm試管3支，編號（1）、（2）、（3）（也可做2只），測定方法同7.1.3，唯在加酪蛋白溶液（0.2g/L）前先加三氯乙酸（0.4mol/L）2mL，使酶失活，再加入酪蛋白溶液（0.2g/L）。樣品的平均吸光度減去空白試驗的平均吸光度，則為凈吸光度。表2酶解酪蛋白步驟各溶液添加順序試劑試管編號試劑試管編號123QB/TXXX—20XX預熱酶液，mL111預熱酶液，mL111預熱0.2g/L酪蛋白溶液，mL1110.4mol/L三氯乙酸，mL22240℃±1℃水浴保溫并精確計時10min40℃±1℃水浴保溫并精確計時10min0.4mol/L三氯乙酸，mL222預熱0.2g/L酪蛋白溶液，mL1117.2酸性蛋白酶活力的測定將4.2.7及7.1中“磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）”改為“乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH3.0）”，其他操作與7.1相同。7.3堿性蛋白酶活力的測定將4.2.7及7.1中“磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH7.2）”改為“硼砂-氫氧化鈉緩沖液（0.025mol/L，pH10.5）”，其他操作與7.1相同。8分析結果的表述試樣的蛋白酶活力按式（1）計算：X=×4×N×……（1）式中：X