清單04PCR專題一次摘定PCR

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9（TC以上變性，DNA雙鏈解開

第“50。（:左右復性，引物與DNA結合

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進行第三次循環變性、復性

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L【PCR基因定點突變】重疊延伸PCR

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有個地方不清楚可沿引物3引物43'端延伸

我直接拿手寫這樣方便大家熟悉這個過程，以免高考題出信息情境題，所以這個方法還是要了解一下流程。

2.（實時）熒光定量PCR技術

先從樣本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同時也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生

物的RNA。通過逆轉錄酶將樣本的RNA逆轉錄為cDNA,并進行PCR擴增，在PCR反應體系中，包含一對特異性引物

以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核昔酸序列，兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針

完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；若反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚

合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，報告基團與淬滅基團分離，發出熒光。每擴增一條DNA鏈，就有一個

熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數（Ct值）與病毒核酸濃度有關，病毒核酸

濃度越高，Ct值越小（如圖）。

3.RT-PCR技術

如果想克隆一段已知mRNA序列的cDNA,可使用反轉錄酶PCR（reversetranscriptasePCR,RT-PCR）技術。

RT-PCR與剛才介紹的PCR技術的主要區別在于它是從mRNA而不是雙鏈DNA開始的。先利用反向引物在反轉錄酶催

化下將mRNA反轉錄成單鏈DNA；DNA-RNA雜交鏈變性后，再用正向引物將單鏈DNA轉換成雙鏈DNA；接著在DNA聚

合酶催化下，正向引物起始cDNA第二鏈合成，將單鏈DNA轉換成雙鏈DNA；最后用常規PCR技術擴增足量的cDNA

用于克隆。

5'（反向

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一、單選題

1.（24-25高三上?天津?階段練習）某種二倍體植物的Pi和P2植株雜交得Fi,Fi自交得F?。對不同個體的DNA

進行PCR檢測，產物的電泳結果如圖所示，其中①?⑧為部分F?個體，上部兩條帶是一對等位基因的擴增產物，下

部兩條帶是另一對等位基因的擴增產物，這兩對等位基因位于非同源染色體上。下列相關敘述錯誤的是（）

ppFF

r1121___________________1____________

①②③④⑤⑥⑦⑧

電源負極

電源正極

A.①②個體均為雜合體，F,中③所占比例大于⑤

B.還有一種握個體的PCR產物電泳結果有三條帶

C.①自交子代的PCR產物電泳結果有1/2與④電泳結果相同

D.③和⑦雜交子代的PCR產物電泳結果與②⑧電泳結果相同

【答案】C

【分析】基因自由組合定律的實質是：位于非同源染色體上的非等位基因的分離或自由組合是互不干擾的；在減數

分裂過程中，同源染色體上的等位基因彼此分離的同時，非同源染色體上的非等位基因自由組合。

【詳解】A、由題可知，這2對等位基因位于非同源染色體上，假設A、a分別為上部兩條帶的等位基因，B、b分別

為下部兩條帶的等位基因，由電泳圖可知Pi為AAbb,P2為aaBB,F,為AaBb,F2中①基因型為AaBB,②基因型為Aabb,

都為雜合子，握中③基因型為AABb,占F2的比例為2/16,⑤基因型為AABB,占F2的比例為1/16,故F?中③所占比

例大于⑤，A正確；

B、由電泳圖可知，F?中①?⑧基因型依次為：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb,未出現的基

因型為aaBb,其個體PCR產物電泳結果有三條帶，B正確；

C、由電泳圖可知，①基因型為AaBB,自交子代為AABB（占比為1/4）、AaBB（占比為2/4）、aaBB（占比為1/4）,

因此①自交子代的PCR產物電泳結果有1/4與④（aaBB）電泳結果相同，C錯誤。

D、由電泳圖可知，③基因型為AABb和⑦基因型為aabb,雜交后代為Aabb、AaBb,其PCR產物電泳結果與②（Aabb）、

⑧（AaBb）電泳結果相同，D正確；

故選Co

2.（24-25高三上?湖北?期中）圖1是某單基因遺傳病的遺傳系譜圖，該病在人群中的發病率為1/8100。科研

人員提取了四名女性的DNA,用PCR擴增了與此病相關的基因片段，并對產物酶切后進行電泳（正?；蚝幸粋€

限制酶切位點，突變基因增加了一個酶切位點），結果如圖2。相關敘述正確的是（）

bpI-1n-3n-5

□正常男性

o正常女性

■?患者

A.該病的遺傳方式可能為伴X染色體隱性遺傳

B.II-1與II-2婚配生一個患病男孩的概率為1/91

C.該突變基因新增的酶切位點可能位于310bp或118bp中

D.擴增II-2與此病相關的基因片段，酶切后電泳將產生3種條帶

【答案】D

【分析】分析圖1，IT和I-2表現正常，但生下了II-2的患病女性,所以該病是常染色體隱性遺傳病，用A/a

表示控制該病的基因，所以，1-1和1-2基因型是人2。從圖2中可以看出，11-3、II-4和1-2電泳圖相同，所以

基因型都是Aa,II-5與他們不同，但表現正常，基因型是AA。

【詳解】A、1-1和1-2表現正常，但生下了II-2的患病女性，所以該病是常染色體隱性遺傳病，A錯誤；

B、該病在人群中的患病率為1/8100,則致病基因頻率為1/90,正?；蝾l率為89/90,根據基因平衡定律，II-1

表現正常，基因型為Aa的概率=Aa/（AA+Aa）=（2XA基因頻率Xa基因頻率）/（A基因頻率XA基因頻率+2XA基因

頻率Xa基因頻率)=(2X1/90X89/90)/(1/90X1/90+2X1/90X89/90)=2/91,其與II-2Aa婚配生一個患病男孩

的概率為2/91X1/4=1/182,B錯誤;

C、結合圖2可知，正?；蛎盖泻罂尚纬砷L度為310bp和H8bp的兩種DNA片段，而基因突變酶切后可形成長度

為217bp、93bp和118bp的三種DNA片段，這說明突變基因新增的酶切位點位于長度為310bp（217+93）的DNA片

段中，C錯誤；

D、基因突變酶切后可形成長度為217bp、93bp和H8bp的三種DNA片段，H-2基因型是aa,只含有突變基因，所

以酶切后電泳將產生三種條帶，D正確。

故選Do

3.（23-24高三上?浙江?階段練習）實時熒光定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）是指先逆轉錄得到DNA,然后進行PCR

擴增。加入的Taqman熒光探針與模板DNA的某條鏈互補結合，每復制一次，就有一個熒光分子生成，當熒光強度

達到一定程度就可以被儀器檢測到，原理如圖所示。下列敘述錯誤的是（）

（注：Ct值是指PCR擴增過程中，緩沖液中的熒光強度首次超過設定閾值時，PCR反應所需的循環數。）

A.圖中的TaqDNA聚合酶具有5'外切酶活性

B.熒光報告基團連接在Taqman探針的5'端

C.該PCR過程只需要加入1種足量的引物

D.Ct值越小，說明體系中目標RNA越多

【答案】C

【分析】實時熒光定量PCR技術中，TaqDNA聚合酶有兩個作用，一是形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是水解探針，破壞

磷酸二酯鍵；破壞探針導致熒光出現。

【詳解】A、在該反應中TaqDNA聚合酶有兩個作用，一是形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是水解探針，破壞磷酸二酯鍵，

R端是5'端，TaqDNA聚合酶具有5'外切酶活性，A正確；

B、因為引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核甘酸，從圖中引物的方向可以分析出，熒光

報告基團連接在Taqman探針的5'端，B正確；

C、該PCR過程需要加入2種引物，C錯誤；

D、Ct值越小，達到熒光閾值所經歷的循環次數越少，說明體系中目標RNA越多，D正確。

故選Co

4.（22-23高三下?河南焦作?階段練習）RT-PCR是將RNA逆轉錄（RT）成cDNA（與mRNA互補的DNA單鏈）和聚

合酶鏈式反應（PCR）相結合的技術，具體過程如圖所示，下列敘述正確的是（）

A.過程I獲得cDNA的過程與DNA復制過程中存在的堿基配對方式相同

B.圖中A、B兩種引物的核甘酸序列不同，但參與子鏈合成的酶均相同

C.圖中子鏈的合成均是以四種核糖核甘酸為原料從引物的一端開始的

D.過程II中，若進行6輪循環，則共需要加入引物的數量為63個

【答案】D

【分析】PCR技術是聚合酶鏈式反應的簡稱，利用DNA復制的原理，RT-PCR需要先完成逆轉錄過程再進行DNA復制，

逆轉錄和DNA復制都遵循堿基互補配對原則。

【詳解】ABC、過程I是以四種脫氧核糖核甘酸為原料，以mRNA為模板逆轉錄合成DNA的過程，催化該過程的酶是

逆轉錄酶，存在的堿基配對方式是U—A、A—T、C—G、G-C；過程H是DNA單鏈復制過程，是以四種脫氧核糖核昔

酸為原料，以DNA單鏈為模板合成DNA單鏈的過程，催化該過程的酶為TaqDNA聚合酶，該過程中存在的堿基配對

方式是A—T、G—C,ABC錯誤；

D、過程H中，若進行6輪循環，最終產生的DNA單鏈數為26=64（條），新合成的子鏈數為63條，則進行6輪循環，

共需要加入引物的數量為63個，D正確。

故選Do

二、多選題

5.（24-25高三上?湖北?階段練習）某科研小組利用PCR定點突變技術培育抗凍番茄新品種。設計含有非特異性

堿基配對的引物，將突變位點引入編碼抗凍蛋白的基因中，獲得抗凍能力更強的突變基因。下列敘述正確的是（）

擬突變位點

遍，/艮5'3幽,

3淺9---------3'5'-------------A------------3'

—T-------------5'3'-------------T-------------5'

5'-----3,

引物11②弓?物斗③

f3'5。3'

3人5'

出除變性后，雜交

5'-

3ys-------------5’

（⑤

5'-_____A________a，

3人--------A-------------5-

突變后的基因

注:引物突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點。

A.過程②還需要四種脫氧核甘酸和耐高溫的DNA連接酶

B.過程③至少需要進行2次循環才能得到兩條鏈等長的DNA分子

C.過程④獲得的2種雜交DNA中只有一種經過程⑤能獲得目的基因

D.常采用顯微注射法將獲得的目的基因導入番茄細胞培育抗凍新品種

【答案】BC

【分析】PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。原理：DNA復制。前提條

件：要有一段已知目的基因的核甘酸序以便合成一對引物。過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物

結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解

開。

【詳解】A、PCR過程需要的是四種脫氧核昔酸和耐高溫的DNA聚合酶，A錯誤；

B、過程③擴增一次得到的是長鏈和短鏈，第二次擴增才能得到兩條等長的短鏈，B正確；

C、根據引物的延伸方向是5'-3'方向，且過程④是利用已有的模板作引物，因此過程④獲得的2種雜交DNA中

只有一種經過程⑤能獲得目的基因，C正確；

D、將目的基因導入動物細胞常用顯微注射法，而將目的基因導入植物細胞采用農桿菌轉化法或花粉管通道法，D

錯誤。

故選BC=

三、非選擇題

6.（2024?廣東深圳?模擬預測）膠原蛋白在維持器官、組織、細胞等方面發揮著關鍵性作用?？茖W家將合成膠

原蛋白的基因kit導入大腸桿菌構建基因工程菌，過程如下圖所示。請據圖回答下列問題：

（1）若導入到原核生物大腸桿菌中，但由于原核細胞中缺少（細胞器），影響表達產物進一步加工，可能會影

響蛋白質的功能。

（2）已知kit基因的部分序列如下圖，采用PCR技術進行擴增時，選用的引物為（填字母）。為使基因與質粒

成功連接，需要在引物的端添加兩種限制酶識別序列。

-5-CGGGATCCA...................................AGAATTCCG-3'

3-GCCCTAGGT.....................................TCTTA_4GGC-5'

A.5'-GCCCTAGGT-3，B.5'—CGGAATTCT-3)

C.5'-CGGGATCCA-3，D.5'—GCCTTAAGA-3'

(3)酶切kit基因，并與質粒中長度為170bp片段進行置換，構建重組質粒pET-28a(+)-kit,用HindIII酶分

別酶切pET-28a(+)和pET-28a(+)-kit,獲得如下表所示片段，

質粒類型pET—28a(+)pET—28a(+)—kit

Hindlll酶切片段lOOObp、2550bp1000bp>2000bp>700bp

則kit基因長度為,由此判定kit基因上有個Hindlll酶切位點。

(4)菌液PCR是直接以菌體熱解后的DNA為模板、以目的基因兩端序列為引物進行擴增的方法，PCR產物需要用一

法進行鑒定，若結果出現大量雜帶，其原因可能有。(答出兩點)

【答案】(1)內質網、高爾基體

(2)BC5'BamHI和EcoRI

(3)320bp2

(4)瓊脂糖凝膠電泳模板受到污染；引物的特異性不強；復性溫度偏低。

【分析】限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核甘酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。選擇合

適的限制酶對目的基因和質粒進行切割的原則：①不能破壞目的基因；②不能破壞所有的抗性基因(至少保留一個)；

③最好選擇兩種限制酶分別切割質粒和目的基因，防止目的基因和質粒反向連接，同時要防止目的基因自身環化和

質粒的自身環化。

【詳解】(1)若導入到原核生物大腸桿菌中，由于原核細胞中缺少內質網、高爾基體等細胞器，這些細胞器在真

核細胞中負責蛋白質的進一步加工和修飾，因此原核細胞表達的蛋白質可能會缺少某些加工步驟，從而影響蛋白質

的功能。

(2)在PCR中，引物與模板鏈的3'端堿基互補配對，并且引物的方向與模板鏈走向相反，因此與圖中kit基因上

面一條鏈結合的引物，其序列應為5'-CGGAATTCT-3',與kit基因下面一條鏈結合的引物其序列應為5'

-CGGGATCCA-3,,綜上所述，AD錯誤，BC正確；由于。ri復制原點中含有限制酶Hindlll的識別序列，因此不能用限

制酶Hindlll來切割質粒，否則會破壞復制原點，只能用限制酶BamHI和EcoRI對質粒pET-28a(+)進行雙酶切，這

樣可以防止目的基因與質粒的自身環化以及任意連接；同時要在kit基因兩端也連上限制酶BamHI和EcoRI的識

別序列，由于DNA聚合酶只能從引物的31端連接脫氧核甘酸延伸子鏈，因此必須將限制酶BamHI和EcoRI的識別

序列連接至引物的5'端。

(3)觀察質粒pET-28a(+)圖可知，在該質粒上有兩個Hindlll的識別序列，一個在啟動子和終止子之間，一個在

復制原點ori中，因此用Hindlll切割質粒pET-28a(+)后，可得到兩個片段，通過表格可知，這兩個片段長度分別

為lOOObp和2550bp,說明質粒pET-28a(+)總長度是1000bp+2550bp=3550bp；利用雙酶切法將kit基因與質粒

pET-28a(+)長度為170bp片段進行置換后，形成的重組質粒pET-28a(+)-kit能被Hindlll切割成三個片段，長

度分別是lOOObp、2000bp,700bp,說明置換后的kit基因上含有兩個Hindlll的識別序列，再加上復制原點ori

中的一個Hindlll的識別序列，共三個Hindlll的識別序列，經Hindlll酶切后才能將重組質粒pET-28a(+)-kit切

成3段。利用這三段的長度可計算出重組質粒pET-28a(+)-kit的總長度為1000bp+2000bp+700bp=3700bp,由于

kit基因與長度為170bp片段進行置換，設kit基因長度為n,可列出等式：3550+n-170=3700bp,故可計算出kit

基因長度為n=320bp。

(4)PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。若結果出現大量雜帶即獲得的產物有非目的DNA序列，原因可能

是：模板受到污染，里面混有其他DNA；引物的特異性不強，與非目的序列結合；復性溫度偏低，導致引物特異性

降低；Mg?"濃度過高，導致PCR特異性不強等。

7.(24-25高三上?天津濱海新?階段練習)四尾柵藻是一種淡水藻類，繁殖快、適應性強，可作為制備生物柴油

的重要原料之一。為提高四尾柵藻油脂含量，研究人員將從含油量高的紫蘇中獲得的二酰甘油?；D移酶基因

(DGAT1)與pBH21質粒構建表達載體，經轉化成功獲得高產油脂四尾柵藻，主要研究過程如下圖，其中DGAT1-F

(5'—GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3')和DGATl-RC5Z-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-)

是以DGAT1基因為依據設計的一對引物，lacZ基因編碼產物在X-gal和IPTG存在下，可以產生藍色沉淀，使菌落

呈現藍色，否則菌落呈現白色。請回答下列問題。

①DGAT1

紫蘇總RNA—卡那霉素啟動子

RT-PCR抗性基因

DGAT1-F"PBI121

DGAT1-R載體終止子

復制原點(4349bp)力轉換DGAT1(14756bp)

箍選大腸桿菌I復制原點

氨節青霉素

抗性基因④

限制牌識別序列及切割位點

轉化

Z表達

BamHI5,GfGATCC3四尾柵藻—-載體

SacI5'GAGCTfC3'

Xbal5'TlCTAGA3'

EcoRI5'GfAATTC3'

(1)過程①中需要的酶有和,過程②應選用的限制酶是和

(2)在保存DGAT1基因時，將克隆載體導入大腸桿菌的優點有(多選)。

①穩定保存②準確復制③快速表達④方便取用

(3)過程③經轉化的大腸桿菌通過(方法)接種到培養基上繼續培養。為篩選獲得目標菌株，培養基應加入

的成分有。

(4)為檢測表達載體轉化四尾柵藻的情況及確定目的基因是否表達，研究人員進行了如下實驗，請完成下表。

實驗步驟簡要操作過程

經轉化后的四尾柵藻接種于含①_____的BGH固體培養基并放置于人工氣候箱培養，一段時間后觀

初篩培養

察其生長情況

擴大培養在BG11固體培養基上分別挑取數個單藻落接種至BG11液體培養基中光照搖床培養，編號備用

收集四尾柵藻藻體，提取基因組DNA,以DGAT1-F和DGAT1-R為引物，進行PCR驗證，未轉化的四尾

PCR驗證

柵藻作對照

油脂含量測

利用索氏抽提法，分別測定②_____的油脂含量

定

結果處理統計并比較PCR驗證結果及藻體中油脂的含量

【答案】(1)逆轉錄酶耐高溫的DNA聚合酶BamHIXbaI

⑵①②④

(3)稀釋涂布平板法氨葦青霉素、X-gal>IPTG

(4)卡那霉素(等量的)轉化后和未轉化的四尾柵藻

【分析】1、基因工程的基本工具：限制性內切核酸酶，識別雙鏈DNA分子的特定核昔酸序列，并且使每一條鏈中

特定部位的磷酸二酯鍵斷開。DNA連接酶，將兩個DNA片段連接起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。載體，將

外源基因送入受體細胞。

2、基因工程的基本過程：目的基因的篩選與獲取，基因表達載體的構建，將目的基因導入受體細胞，目的基因的

檢測和鑒定。

【詳解】(1)過程①包括逆轉錄和PCR,逆轉錄需要逆轉錄酶的參與，PCR過程需要耐高溫的DNA聚合酶；限制酶

的作用是識別雙鏈DNA分子的特定核昔酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，對比幾種限制酶的

結合位點和DGAT1-F、DGAT1-R的堿基序列，可知過程②應選用的限制酶是BamHI（切割DGAT1-R所在序列）和Xba

I（切割DGAT1-F所在序列）。

（2）將克隆載體導入大腸桿菌，可以與外界環境隔離，能夠穩定保存，準確復制，大腸桿菌比基因方便取用，故

選①②④。

（3）根據培養基上菌落的分布（各菌落分散分布）可知所用接種方法是稀釋涂布平板法；克隆載體中含有氨茉青

霉素抗性基因、lacZ基因，氨革青霉素抗性基因用于篩選成功導入質粒（含目的基因的重組質粒和不含目的基因的

空白質粒），由圖可知，經過程②質粒上的LacZ基因被目的基因破壞，故LacZ基因可用于篩選導入含目的基因的

重組質粒，lacZ基因編碼產物在X-gal和IPTG存在下，可以產生藍色沉淀，使菌落呈現藍色，否則菌落呈現白色，

所以為篩選獲得目標菌株，培養基應加入的成分有氨革青霉素、X-gal、IPTGo

（4）PBI121質粒中含有卡那霉素抗性基因，所以經轉化后的四尾柵藻接種于含卡那霉素的BG11固體培養基并放置

于人工氣候箱培養，一段時間后觀察其生長情況；上一步驟中用未轉化的四尾柵藻作對照，所以利用索氏抽提法分

別測定（等量的）轉化后和未轉化的四尾柵藻的油脂含量，從而檢測表達載體轉化四尾柵藻的情況及確定目的基因

是否表達。

8.（24-25高三上?江西贛州?階段練習）番茄不耐寒，冬季容易凍壞，難以儲藏。我國科研人員從某植物中提取

了種抗凍基因AtC0R15a,經過?系列過程獲得轉基因抗凍的番茄新品種，操作流程如圖。回答下列問題：

質粒

（1）用PCR技術擴增AtCORl5a基因時需要添加引物，引物的作用是。

（2）如果要將AtC0R15a基因與質粒構建重組DNA分子，一般采用雙酶切法，據圖分析選用的兩種限制酶組合

是.0

（3）圖中是采用法將目的基因轉移到番茄細胞中，并將其整合到該細胞的上。

（4）為了提高AtC0R15a基因的表達能力，可將AtCORl5a基因與外源強啟動子連接，如下圖所示。

①一②一

-------1強啟動子------1AtC0RI5建因-------（注：圖中①、②、③、④表示引物）

利用PCR檢測上述連接是否正確，可選擇的引物組合是（填字母），該PCR反應體系中需加入—

酶。

A.①+②B.①+③C.②+③D.③+④

【答案】（1）使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始復制

⑵HindIII和BamHI

（3）農桿菌轉化法染色體DNA

（4）BTaqDNA聚合（耐高溫DNA聚合）

【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的獲取；第二步：基因表達載體的構建（核心）；第三步:

將目的基因導入受體細胞1、轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程；

第四步：目的基因的檢測和表達。

【詳解】（1）用PCR技術擴增AtCORl5a基因時需要添加引物，引物是根據已知一段目的基因的核甘酸序列設計

的，其能與目的基因兩端的堿基序列實現互補配對，進而使PCR擴增過程中子鏈的延伸發生在引物的3'端，即引

物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始復制。

(2)為了能篩選重組DNA分子，必須保留抗生素抗性基因，不能選擇Smal,若選擇EcoRI,則目的基因兩端具

有相同的黏性末端，目的基因會自身環化，綜上分析，采用雙酶切法，據圖分析選用的兩種限制酶組合是HindIII

和BamHI?

(3)將目的基因轉移到植物細胞常使用農桿菌轉化法，即當②農桿菌侵染番茄細胞后，利用農桿菌轉化法將目的

基因轉移到番茄細胞中，并且將其整合到受體細胞的染色體DNA上。

(4)為了提高AtC0R15a基因的表達能力，可將AtC0R15a基因與外源強啟動子連接，如圖示，在利用PCR檢

測連接是否成功，應當將強啟動子和AtC0R15a基因都擴增出來，所以可選擇的引物組合是①+③。故選Bo該PCR反

應體系中需加入TaqDNA聚合(耐高溫DNA聚合)酶，以此來擴增DNA。

9.(22-23高二下?江蘇揚州?階段練習)引起新冠肺炎的新冠病毒是一種帶包膜的RNA病毒，包膜表面有與人體

細胞膜表面的ACE2受體結合的S蛋白。疫苗接種和病毒檢測是當前新冠肺炎疫情防控工作的重要舉措。請回答下

列問題：

I、疫苗的研發和接種

(1)滅活疫苗。工業生產上利用Vero細胞能無限增殖的特性培養新冠病毒，可實現的目的。

(2)腺病毒載體疫苗。該疫苗主要成分是活的、有復制缺陷、能表達S蛋白的重組人5型腺病毒。這種方式生產的

疫苗由于重組腺病毒,從而提高了疫苗的安全性。

(3)重組亞單位疫苗。其技術線路是：提取新冠病毒RNA-通過RT酶PCR(反轉錄酶聚合酶鏈式反應)技術擴增篩

選RBD蛋白(S蛋白中真正與ACE2結合的關鍵部分)基因一構建基因表達載體一導入CH0細胞并培養一提取并純化

RBD蛋白一制成疫苗。利用RT酶PCR技術，獲取S蛋白基因時，需加入酶；擴增RBD蛋白基因時，應選擇的

引物為。PCR的產物可通過電泳鑒定，設置如下：1號泳道為標準(Marker),2號泳道是以為材料做的

陽性對照組，3號泳道為實驗組。圖3中3號泳道出現雜帶，原因一般有(至少答出兩點)。基因表達載體構

建中為提高目的基因和運載體的正確連接效率，研究人員應在圖1中選擇的限制酶是。

123

EcoRISmaIEcoRI

［弓建2標記基因BamHIHindDIEcoRI

引物1引物斗引物4

5'3'

■4引物6引物71引物8圖2運載體片段示意圖

、

BamHIRBD蛋ZZWY基因~'HindID

圖1RBD蛋白基因結構與引物位置示意圖

圖3

II、新冠病毒的檢測

(4)核酸檢測

圖4是我國自主設計的新冠病毒核酸檢測平臺示意圖，圖5為RT-PCR(實時熒光逆轉錄聚合酶鏈式反應)示意圖。

當探針完整時，熒光基團(R)發出的熒光信號被淬滅基團(Q)吸收而不發熒光；當Taq酶遇到探針時會使探針水

解而釋放出游離的R和Q,R發出的熒光信號被相應儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產物數量完全同步。

病毒樣品RNA

Ia的困§@Q

洋大+病毒?樣本信?自動化+自動%+自動WR.RTP「R雙鏈DNA=

樣本.滅活十息錄入*分裝?核酸提取+體系配置.RT-PCR

引物、探針與模板鏈結合TaqMan探針

引物1

施

全自動分杯全自動核酸自動化液體

處理系統提取純化儀處理系統新鏈延伸遇到探針

I，I

Taq酶切割探針

L樣放熒光

醉\

實驗室信息管理系統儀器檢測

力蝙I荷一

圖4新鏈聚合完成

圖5

①在自動化PCR體系配置中加入引物和探針，引物和探針與模板結合發生在PCR循環中的階段。

②利用熒光定量PCR儀可監測待測樣液中病毒的核酸數量。若每斷裂一個TaqMan探針，設置R發出的熒光信號的

值為L若經n次的PCR擴增，實時熒光信號強度(填“增強”“減弱”或“不變”)，說明樣液中病毒的核

酸數量為0；

(5)抗原和抗體檢測：為了及早發現新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原檢測試劑盒及抗體檢測試劑盒作為核酸檢測

的有效補充措施。對于已注射過滅活疫苗的人員，應選擇(填字母)檢測。

a、核酸檢測b、抗原檢測c、抗體檢測

【答案】(1)獲得大量新冠病毒，降低生產成本

(2)無法在人體宿主細胞內復制(增殖)

(3)逆轉錄酶、Taq酶引物4、引物5(提純的)RBD蛋白基因片段模板受到污染；引物的特

異性不強；退火溫度偏低BamHI和HindIII

(4)復性(或退火)不變

(5)ab

【分析】常見的疫苗種類有：

(1)滅活疫苗，首先滅活病毒，使其失去傳染性和致病性，但保留了病毒完整結構，具有能夠讓免疫系統識別的

抗原性。

(2)腺病毒載體疫苗是選擇一種對人體無害的，不致病的腺病毒作為載體，利用基因工程技術將病毒基因經過一

定的安全處理，使其成為一種只能對人體有一個細胞周期侵染能力的復制缺陷性病毒，然后將新冠病毒侵入人體的

關鍵基因植入到這種復制缺陷的腺病毒基因中，利用這種技術制成疫苗，可使新冠病毒的抗原搭載腺病毒之船進入

人體，因此這類疫苗被稱為腺病毒載體疫苗。

(3)重組亞單位疫苗通過各種方式培養病毒抗原蛋白，將特異性抗原的基因插入易于增殖的病毒或細胞，以表達

有效特異性抗原，經純化后制備的疫苗。在研發過程中會使用到RT-PCR技術，將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚

合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，在DNA聚合酶

作用下擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含

量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

【詳解】(1)vero細胞是指非洲綠猴腎細胞，可用于檢查大腸桿菌毒素，作為培養病毒的細胞宿主和真核寄生蟲

的宿主細胞。之所以選擇vero細胞生產病毒，是因為它容易培養，傳播穩定，可以無限分裂，所以vero細胞用于

生產許多疫苗。如工業生產上利用Ver。細胞能無限增殖特性培養新冠病毒，可實現獲得大量新冠病毒，降低生產

成本。

(2)腺病毒載體疫苗，是利用基因工程技術，把致病病毒的關鍵基因片段植入到改造后的無害病毒中，重組成疫

苗。這個疫苗和無害病毒B一樣不致病，卻擁有致病病毒的長相，能使免疫系統認識致病病毒，并產生免疫記憶，

從而阻斷致病病毒的入侵。在疫苗研發中，改造后的腺病毒不能在體內復制，也無法整合進宿主細胞基因組中，所

以，從理論性上來講，對人體不會造成危害。

（3）RT-PCR技術是將RNA的反轉錄和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。重組亞單位疫苗的技術線路

是：提取新冠病毒RNA一利用RT酶PCR技術擴增篩選RBD蛋白（S蛋白中真正與ACE2結合的關鍵部分）基因一構

建基因表達載體一導入CHO細胞并培養一提取并純化RBD蛋白一制成疫苗。利用RT酶PCR技術，獲取S蛋白基因

時，需加入逆轉錄酶、Taq酶。擴增RBD蛋白基因時，應選擇的引物為引物4、引物5,因為通過這兩種引物能擴增

出帶有限制酶序列的目的基因。PCR的產物可通過電泳鑒定，設置如下：1號泳道為標準（Marker）,2號泳道是以

RBD蛋白基因片段為材料做的陽性對照組，3號泳道為實驗組。PCR技術受到溫度，酶，所用蛋白材料等因素的影響，

因此，圖3中3號泳帶出現雜帶原因可能是引物的特異性不強，結合到模板的其他地方；模板不純受到污染，結合

到其他模板；目的片段與引物有多處結合；退火溫度偏低等。根據圖1可以分析出基因表達載體構建中為提高目的

基因和運載體的正確連接效率，研究人員應在圖1中選擇的限制酶是BamHI和HindIII。

（4）①PCR原理是體外DNA復制，其過程包括變性、復性和延伸，復性指的是引物與模板鏈之間形成氫鍵的過程；

加入自動化PCR體系配置中的引物和探針的設計依據是新冠病毒的基因對應的部分核甘酸序列。引物和探針與模板

結合發生在PCR循環中的復性（或退火）階段。

②利用熒光定量PCR儀可監測待測樣液中病毒的核酸數量。若每斷裂一個TaqMan探針，設置R發出的熒光信號的

值為1,可見熒光強度與核算數量相對應，則經n次的PCR擴增，樣液中病毒的核酸數量為0,則說明實時熒光信

號強度不變。

（5）為了及早發現新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原檢測試劑盒及抗體檢測試劑盒作為核酸檢測的有效補充措施。

這兩種試劑盒的檢測原理為抗原抗體的特異性結合，即抗原-抗體雜交。對于已注射過滅活疫苗的人員，由于其體

內發生了相應的特異性免疫反應。因而體內含有較多的抗體，因此，應選擇核酸檢測和抗原檢測。

10.（22-23高三上?江蘇揚州?階段練習）科研人員發現在人類腫瘤細胞中LMNA基因表達異常，LMNA基因編碼

的核纖層蛋白與維持細胞核的正常形態有關?？蒲腥藛T利用CRISPR/Cas9技術對體外培養的HepG2（人源肺癌細胞）

細胞株進行基因編輯，獲得了LMNA基因敲除的穩定細胞系。

（l）Cas9是一種核酸內切酶，它與sgRNA（向導RNA）構成的復合體能與DNA分子特定堿基序列結合，如圖1。作用

時sgRNA與DNA單鏈進行堿基互補配對，然后Cas9催化水解，從而使DNA在PAM序列（幾乎存在于所有

基因中）的（填“上游”或“下游”）被切斷。

TCas9

.3Z一

口5,―fsgRNA

NGGPAM序列

（N表示任意堿基）

JEE基因組DNA

ACasM〃&

圖1

⑵一般來說，在使用CRISPR/Cas9系統對不同基因進行編輯時，應使用Cas9和（填“相同”或“不同”）

的sgRNA結合構成復合體進行相關基因的編輯，其中Cas9對DNA的切割（填“具有”或“不具有”）

類似于限制酶的“限制性”。

（3）HepG2細胞中沒有編碼Cas9的基因，需將Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并與質粒結合導入HepG2

細胞，sgRNA的合成需要酶的催化。

⑷用圖2中的質粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段構建表達載體時，應選用進行酶切。將構建好的表

達載體與用處理的細菌置于適宜反應體系中培養。然后將培養的細菌涂布于含的平板培養

基上，37℃培養，24h后挑取菌落，提取質粒作為模板，選擇圖3中引物組合和,通過PCR和電

泳技術鑒定是否重組成功。

拼接基因插入位置

II

5'-“CCGTGT”.~^~.“ATGCCT…-3'5-...GGGATG-3'

3GGCACA--H--TACGGA"-5'3'—"CCCTAG--5'

I_______________?______________III

插入部位兩端拼接基因

i-I5'-…GATCCC…-3'

EcoRIEcoRIBamHI

*W3種引物-115'—'AGGCAT?“-3'

■III5'--CCGTGT--3'

Cas9-sgRNA拼接基因

圖3

圖2

（5）用鑒定成功的工程菌對HepG2細胞進行轉染，培養三天后收集HepG2細胞，從分子水平和細胞水平檢測導入是

否成功。

①提取HepG2細胞的基因組，對DNA分子的序列進行檢測。

②請寫出細胞水平的一項檢測指標：o

【答案】（1）磷酸二酯鍵上游

（2）不同不具有

（3）RNA聚合酶

2+

（4）EcoRICa（CaCl2）喋吟霉素I皿（兩空位置可調換）

（5）堿基（或核甘酸）HepG2細胞的細胞核形態或單位時間內細胞數目的增長量等

【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核甘酸序列，并且使每一條鏈中特

定部位的兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。（2）DNA連接酶：連接的是兩個核昔酸之間的磷酸二酯鍵。（3）運

載體：常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

2、基因工程的基本操作程序包括：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導人受體細胞、目

的基因的檢測與鑒定。通常利用PCR獲取和擴增目的基因。在構建基因表達載體時，首先會用一