考向09基因工程

1.(2023?江蘇揚州?揚州中學校聯考模擬預測)土壤鹽漬化影響水稻生長發育，將水稻耐鹽堿基因OsMYB56

導入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿水稻新品種，其操作流程及可能用到的限制酶如圖，其中

bar為抗除草劑基因，Tetr為四環素抗性基因，Amp「為氨芳青霉素抗性基因，①?⑦表示操作過程。

?------------OH

AGACAACTTATAGTACGTTC

HO。

放大

⑤一水稻愈傷

組織細胞-1

⑥

耐鹽堿水稻<⑦水稻幼苗<—

限制酶BamHIBelISmaISau3AI

識別位點及切割位點-G；GATCC--T；GATCA--CCCJGGG--；GATC-

⑴OsMYB56基因游離的磷酸基團側為(“5”，或“3，”)端，過程①PCR擴增OsMYB56基因時加

入的酶催化鍵的形成，還需要添加引物，應選用引物組合=

?5'-CTTGGATGAT-3'?5'-TAAGTTGTCT-3'③S-TAGTAGGTTC-3'

@5'-TCTGTTGAAT-3'@5'-ATTCAACAGA-3'@5'-ATCATCCAAG-3'

(2)根據基因表達載體的結構組成分析，Ti質粒中的CaMV35s是,其功能是?；?/p>

因表達載體中，OSMYB56基因和bar基因編碼鏈的方向(填“相同”或“相反”)。

(3)過程③應選用限制酶切割質粒，利用所選限制酶進行操作的優勢是，切割后需要

用進行連接才能獲得重組質粒。

(4)為了篩選出含重組質粒的受體細胞，④過程應在添加的選擇培養基上培養。培養后獲得的

菌落不能判定是否含有重組質粒，原因是o

【答案】⑴5,磷酸二酯(鍵)①④

(2)啟動子RNA聚合酶識別和結合的部位，(啟動轉錄過程)相反

(3)Bell和Smal防止酶切后的質粒自身環化，保證OsMYB56和酶切后的質粒定向連接

T4DNA連接酶（僅答出DNA連接酶不得分）

（4）四環素含未重組Ti質粒（或普通Ti質粒）的受體細胞也能正常生長

【分析】PCR技術可特異性的擴增DNA片段，關鍵在于引物可以和特定DNA片段的3,端特異性結合，

使耐高溫的DNA聚合酶酶沿引物的3,端延伸子鏈?；虮磉_載體一般包括啟動子、終止子、目的基因、

標記基因、復制原點等元件。

【詳解】（1）DNA分子有2條鏈構成，每一條鏈都有3,端與5,端，-OH端為3，，磷酸基團的末端為S,因

此OsMYB56基因游離的磷酸基團側為5端，羥基端為3端。過程①PCR擴增OsMYB56基因時加入的酶

是Taq,該酶能催化磷酸二酯鍵的形成。在進行PCR操作時，引物應分別基因兩條鏈的3端根據堿基互補

配對原則結合，根據圖中兩端序列，通常選擇5，-CTTGGATGAT3（上面鏈的引物）和5，-TCTGTTGAAT3（下

面鏈的引物）作為引物對，①④正確。

（2）根據基因表達載體的結構組成分析，在每個目的基因的前面要有啟動子，后面要有終止子，因此

CaMV35S是啟動子，其功能是RNA聚合酶識別并結合的位點，驅動轉錄的進行。轉錄從啟動子到終止子，

CaMV35s是啟動子，圖中OsMYB56基因和bar基因的終止子位于不同方向，因此基因表達載體中，

OsMYB56基因和bar基因編碼鏈的方向相反。

（3）據圖可知,質粒中的兩個標記基因TeF和Ampr中都含有限制酶BamHI識別序列,如果用限制酶BamHI,

會破壞質粒中的兩個標記基因，為防止質粒自身環化，保證OsMYB56和酶切后的質粒定向連接，需要用

雙酶切，因此過程③可以選擇限制酶Bell和SmaL酶切后的質粒和目的基因片段，通過DNA連接酶作

用后獲得重組質粒。

（4）據圖可知，目的基因和質粒連接后，破壞了氨葦青霉素抗性基因，只保留了四環素抗性基因，為了

篩選出含重組質粒的受體細胞，應在添加四環素的選擇培養基上培養；含未重組Ti質粒的受體細胞也會

正常生長，所以培養后獲得的菌落不能判定是否含有重組質粒。

2.（2023春?江蘇南通?高三江蘇省如皋中學統考階段練習）人呼吸道合胞病毒（HRSV）是一種單鏈RNA

病毒，下圖是構建人呼吸道合胞病毒基因組載體的示意圖，下表是相關限制酶的識別序列及切割位點，請

回答:

限制酶BelIEcoRIXbaISau3AIBamHI

識別序列及切割位點TJGATCAGJAATTCTJCTAGAJGATCG；GATCC

（l）HRSV的基因組為-RNA,入侵細胞后在_____的催化下合成+RNA。

（2）過程②設計引物時在兩種引物的5,端分別添加酶的識別序列。過程③需要用酶切割質粒A.

(3)過程④將質粒B導入大腸桿菌，有利于,需要用處理大腸桿菌。

(4)為制備減毒突變株，科研人員將單個突變堿基引入HRSV基因組eDNA質?？寺≈?，流程如下圖。已

知在細菌體內合成的DNA分子有甲基化修飾，通過PCR擴增的DNA鏈無甲基化修飾。

做提質粒，

C,RDp②nl轉化

①If酶切、測

序鑒定

在大腸桿菌細胞在大腸桿菌細胞

內完成缺刻修復內完成鏈的置換

替換出單鏈DNA

①以可識別甲基化的GATC四個堿基序列，因此其能將水解消化掉。在大腸桿菌細胞內完成缺刻

修復需要酶。

②己知質粒B為a個，經過程①擴增15個循環，需要突變引物個，將過程②形成的產物全部轉入

大腸桿菌后復制n輪，得到雙鏈突變的DNA個。

【答案】(l)RNA聚合酶

(2)Xbal和BamHIXbal和Bell

(3)質粒B準確復制，穩定保存，方便提取CaCh(Ca2+)

(4)a、b鏈DNA連接酶15a15aZ-

【分析】基因工程技術的基本步驟：(1)目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增

和人工合成。(2)基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、

終止子和標記基因等。(3)將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。(4)目

的基因的檢測與鑒定。

【詳解】(1)HRSV的基因組為-RNA,入侵細胞后在RNA復制酶的催化下合成+RNA。

(2)據圖分析，BamHI會破壞復制原點，而EcoRI會破壞抗性基因，均不應選擇，為避免目的基因的自

身環化和重組質粒的反向連接，應選擇兩種不同的限制酶，形成黏性末端，故過程③切割質粒A應選擇

Xbal和BclL由于Bell會破壞目的基因，故在切割目的基因時，不應選擇該酶，應選擇與其有相同末

端的BamHL故在過程②設計引物時在兩種引物的5,端分別添加XbaI和BamHI的識別序列。

(3)將重組質粒導入大腸桿菌的原因是質粒B準確復制，穩定保存，方便提取；大將目的基因導入微生

物細胞時，需要用Ca2+處理，使其轉化為感受態細胞。

(4)①分析題意，示①過程是將a鏈作為模板鏈，突變引物與a鏈結合，PCR之后，a鏈與新生成的鏈為

突變的雜交質粒，替換成原來的b鏈，②過程將原來DNA的a、b兩條鏈水解消失掉，就剩下③過程的新

生成的突變體，并將鏈中缺失的一部分修復完整，再將這條鏈放在大腸桿菌細胞中生成互補鏈，最后提取

這條鏈，酶切后再測定序列，而Dpnl識別甲基化的GATC四個堿基序列，因此其能將原來的a、b鏈水

解消化掉，在大腸桿菌細胞內完成缺刻修復需要DNA連接酶，將片段DNA連成環形鏈。

②質粒B為a個，每循環1次，需要a個突變引物來合成新鏈，因此，循環15次，就需要15a個突變引

物，那么這15a個有突變堿基的DNA鏈，放入大腸桿菌中每復制第一輪，先由DNA單鏈變成DNA雙鏈,

之后每復制一輪，雙鏈DNA分子數會增加一倍，即數目乘2,因此只有n-1輪會使DNA雙鏈分子數加倍,

雙鏈突變DNA為15ax2n-*o

3.（2023.江蘇南京.統考二模）煙草易受煙草花葉病毒（TMV）感染而大幅度減產。絞股藍（一種植物）

細胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人員利用轉基因技術培育出了抗TMV煙草。

（1）下表是相關研究中的一些步驟，請結合所學基因工程知識完成以下表格（在答題卡上的①~⑥處填寫）

實驗步驟方法要點

篩選合適的目的基從絞股藍細胞中提取總RNA,通過逆轉錄過程獲得DNA；再通過①__________技術

因擴增出大量目的基因片段

②____________將目的基因插入Ti質粒

轉化細胞常用③__________方法將重組質粒導入受體細胞

④__________在含有卡那霉素的培養基上培養受體細胞

獲得再生植株運用⑤__________技術培育

轉基因植株分析從分子水平與⑥_________水平，上對轉基因植株進行檢測與鑒定

（2）為研究干旱脅迫基因LEA和VOC對絞股藍油脂的積累機制，科研人員構建了兩個基因表達載體。其中

基因LEA與熒光素酶基因（Luc）構建成基因表達載體甲，基因VOC和標記基因構建成基因表達載體乙，

相關序列及酶切位點如圖所示。箭頭表示轉錄方向。

部分載體結構:LEA基因序列：

多酶切位點5，ATGGGC........CACTAG3，

3，TACCCG........GTGATC5;

啟動子）Luc基因彩^^一多酶切位點："

5'GATATC---TCTAGA???GGATCC3'

BamHI終止子\____/\______/X______,

EcoRVXbalBamHI

①利用PCR擴增LEA基因時，需要在引物的（填“3,端”或“5,端”）添加限制酶識別序列，

添加序列對應的限制酶是o

②為了構建基因表達載體甲，依據圖中已知堿基序列，在PCR擴增儀中加入的引物的堿基序列為

擴增代后會得到等長的8條DNA片段。

③乙酰-CoA竣化酶基因（AC）是油脂合成過程的關鍵酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分

解過程的關鍵酶基因。將基因表達載體甲、乙分別導入植物細胞培養成轉基因植物A、B,在干旱脅迫的

環境下培養兩種轉基因植物和正常植物，分別檢測植物體內AC和ATGL基因的表達水平，結果如下圖。

正常植株轉基因A植株轉基因B植株

AC酶

ATGL酶

I在分子水平上，用方法檢測AC酶和ATGL酶的含量可得到上述結果。

II基于以上研究，干旱脅迫基因LEA和VOC在絞股藍油脂積累中的機制是o

【答案】(1)PCR基因表達構建/構建重組質粒農桿菌轉化篩選轉基因細胞植物

組織培養個體生物學

(2)5端EcoRV和Xbal5，-GATATCATGGGC-3,和5'-TCTAGACTAGTG-3,4抗原-

抗體雜交在干旱脅迫的環境下，LEA通過促進AC的表達使植物油脂增加；VOC通過抑制ATGL的

表達減弱油脂的降低

【分析】基因工程的操作步驟：

(1)目的基因的獲?。环椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成；

(2)基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟。基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基

因等；

(3)將目的基因導入受體細胞；根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣，將目的基因導入植物細胞的方法

有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目

的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；

(4)目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因：DNA

分子雜交技術;②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA：分子雜交技術;③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：

抗原-抗體雜交技術；

個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

【詳解】(1)獲取目的基因：從絞股藍細胞中提取RNA,以RNA為模板通過逆轉錄過程獲得DNA,再通

過PCR技術擴增出大量目的基因片段；

構建重組質粒：將目的基因插入Ti質粒，利用基因重組形成重組DNA；

轉化細胞：常用農桿菌轉化方法將重組質粒導入受體細胞，這是導入植物細胞最有效的方法；

篩選轉基因細胞：在含有卡那霉素的培養基上培養受體細胞，通過標記基因將目的基因篩選出來；

獲得再生植株：利用植物細胞的全能性，運用植物組織培養技術培育；

轉基因植株分析：利用植物細胞的全能性，運用植物組織培養技術培育從分子水平與個體生物學水平上，

對轉基因植株進行檢測與鑒定；

(2)耐高溫的DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從引物的3,端延伸DNA鏈，因此PCR擴增

需要引物。引物與目的基因所在DNA分子遵循堿基互補配對原則，所以擴增LEA基因時，需要在引物的

5'端添加限制酶的識別序列；由于Luc中存在BamHI識別序列，BamHI會將Luc切斷；一種酶切會導致

載體、LEA自身環化及LEA反向連接，因此選擇的限制酶是EcoRV和Xbal。

根據已知序列，由于引物只能引導子鏈從5-3延伸，根據堿基互補配對原則，用PCR擴增時的兩個引物

對應的序列為：51GATATCATGGGC-3,和5'-TCTAGACTAGTG-3',擴增次數與得到等長DNA片段數之間

的關系為2n-2n,得到等長的8條DNA片段，2口-2n=8,應該擴增4次；

檢測酶(蛋白質)分子水平上采用抗原-抗體雜交技術進行檢測；根據檢測結果，轉基因A植株的AC酶

變高了，B的ATGL酶變低了，可以推測在干旱脅迫的環境下，LEA通過促進AC的表達使植物油脂增加；

VOC通過抑制ATGL的表達減弱油脂的降低。

【點睛】本題考查了DNA分子的結構和基因工程的相關知識，意在考查考生的識記能力和分析能力。

4.(2023?江蘇?校聯考模擬預測)白細胞表面抗原2(SLA-2)在抗原呈遞、機體器官移植以及免疫應答方

面有著重要作用。為進一步研究SLA-2的結構與功能，科研人員以能穩定傳代的豬腎上皮細胞為材料，構

建了穩定高表達SLA-2基因的細胞株，過程如下圖。其中，Ampr表示氨葦青霉素抗性基因，Puro「為喋吟

霉素抗性基因，BclLNothXbaLSan3Al為限制酶酶切位點，括號內數值表示距復制原點的長度。請回

答下列問題。

豬腎上皮細胞

［篩選

Purcf產抗原肽豬

腎上皮細胞

限制酶BelINotIXbaISan3AI

識別序列及切割位點TJGATCAGCJGGCCGCTJCTAGA1GATC

(1)過程①需要的酶有與細胞內基因相比，過程①獲得的SLA-2基因在結構上不具有

為使獲得的SLA-2基因與質粒1定向連接，擴增時應選用的1對引物為

a.5，-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC-3'

b.5'-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC-3

c.5'-GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC-3'

d.5'-GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC-3'

(2)過程②為酶切、連接后的重組質粒轉化處于的大腸桿菌，轉化后采用含的平板篩

選。篩選獲得的大腸桿菌需擴大培養，其目的是。

(3)過程⑤需將SLA-2基因插入啟動子與終止子之間，目的是=為鑒定與驗證重組質粒3,研

究人員用Notl和Sar3AI完全酶切質粒2和重組質粒3后電泳并比較。請在答題紙相應位置畫當可能得到

的電泳條帶。

(4)研究中，一般利用最小致死濃度(使某種細胞全部死亡的最小濃度)的喋吟霉素溶液浸染細胞以篩選出

轉化的豬腎上皮細胞。為確定最小致死濃度，科研人員利用未轉化的豬腎上皮細胞進行了相關實驗.結果

如下圖。根據結果，應使用濃度為的喋吟霉素溶液浸染，理由是。

i

.

勺

。

一

1晌

囂

【答案】（1）逆轉錄酶、耐高溫的DNA聚合酶啟動子、終止子、內含子等b、d

(2)感受態氨年青霉素擴增重組質粒

重組

(3)

【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增

和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、

終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。（4）目

的基因的檢測與鑒定。

【詳解】（1）由mRNA獲得基因，以RNA為模板合成DNA,需要通過逆轉錄過程。逆轉錄獲得的基因

與細胞內的胰島素基因相比在結構上缺少啟動子、終止子和內含子（非編碼序列）。引物之間不能進行配

對，引物需與經內切酶剪切過的黏性末端互補配對，為防止基因發生自身環化和反向鏈接，需要雙限制酶

切，經分析表格中相關內切酶的切割位點和引物序列，氨革青霉素抗性基因可被Bell識別，San3Al為

Bell的同尾酶，也可切割氨茶青霉素抗性基因，故選擇Xba和NotI兩種限制酶，對應引物中的bd。

故選bdo

（2）導入微生物的方法是感受態細胞法，所以重組質粒轉化處于感受態的大腸桿菌，質粒含有氨葦青霉

素抗性基因，則轉化后采用含氨葦青霉素的平板篩選。篩選獲得的大腸桿菌需擴大培養，可擴增重組質粒。

（3）基因位于啟動子與終止子之間才能正常表達，所以過程⑤需將SLA-2基因插入啟動子與終止子之間。

根據酶的識別序列可知，San3A也能切割Bell所識別的序列，則用Notl和Sar3AI完全酶切質粒2后獲得

的序列為177、963、3305,用Notl和Sar3Al完全酶切重組質粒3獲得的序列為963、1277、3305,則對

應的電泳圖如下：

重組

（4）最低致死濃度既可以讓大部分沒有抗性的細胞死亡又不會讓具有抗性的細胞死亡；在該濃度下未發

生轉化的細胞全部死亡，能存活生長的即為己轉化的細胞，根據實驗結果分析，最佳的喋霉素篩選濃度為

4.0|ig-mL1o

5.（2023秋?江蘇南京?高三南京市中華中學校聯考期末）亨廷頓舞蹈癥（HD）患者是由于編碼亨廷頓蛋白

的基因（H基因）序列中的三個核甘酸（CAG）發生多次重復所致。

（1）某HD家系圖（圖1）及每個個體CAG重復序列擴增后，電泳結果如圖2。

1

—9確診患者

口白6，￡*DO表現正常

12345

注：n-i暫未發病，n代5個個體的年齡在15?2。歲之間。

圖1

個體IT1-2II-1II-2II-3II-4II-5

重復次數

100—*一

75—?

50——一

25—二——————

圖2

①僅據圖1判斷HD不可能是遺傳病。

②結合圖1和圖2推測，當個體的所有H基因中CAG重復次數25次時才可能不患病。與1-1比較，

II-1并未患病，推測該病會伴隨_____呈漸進性發病。

③與1-1比較，II』、11-3、11-4、II-5的H基因中CAG重復次數均有增加，這表明患者1-1在_____過

程中異常H基因中的CAG重復次數會增加。若H-2（紅綠色盲患者）成年后與一正常男性婚配，他們所

生的孩子最好是（選填“男”或“女”）性。

④若D-1是白化病基因的攜帶者，與一個攜帶有紅綠色盲基因和白化病基因的正常女性婚配，所生正常女

兒中為純合子的概率為（用分數表示，只考慮本小題提及的兩種疾?。?。

（2）由于缺乏合適的動物模型用于藥物篩選，HD患者目前尚無有效的治療方法。我國科學家利用基因編輯

技術和體細胞核移植技術，成功培育出世界首例含人類突變H基因的模型豬，操作過程如圖3。

/AG重復18次CAG

豬H基因-重復150次

人基因片段

H含有目的

CAG重復150次基因的體細胞

圖3

①篩選含有目的基因的體細胞，將細胞核移植到中，構建重組細胞，再將重組細胞發育來的早期胚

胎移植到代孕母豬體內，獲得子代Fo,此過程依據的原理是。

②將Fo與野生型雜交得到Fi,Fi再與野生型雜交得到F2.在Fo、Fi、F2中，更適合作為模型豬的是F2個

體，理由是o

（3）近年來，HD的治療研究取得了一些重要進展。下列可作為HD治療策略的有o

A.誘導HD致病蛋白在細胞內特異性降解B.殺死神經系統病變細胞

C.干擾異常H基因mRNA的翻譯D.基因治療改變異常H基因

【答案】（D伴X染色體顯性和伴Y色體均不超過年齡增長減數分裂形成配子

女1/6

（2）去核卵母細胞動物細胞核具有全能性隨著繁殖代數增加后個體的H基因中CAG重復

次數更高，發病更早或更嚴重

(3)ACD

【分析】1、基因突變是指DNA分子中發生堿基對的增添、缺失和替換，而引起的基因結構的改變。

2、哺乳動物核移植包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。體細胞核移植是將供體細胞核植入通過顯微操

作去除細胞核的卵母細胞中，經培養獲得克隆動物，該過程沒有受精作用，屬于無性繁殖。

3、根據圖1和圖2分析,當個體的所有H基因中CAG重復次數均小于或均不超過25次時才可能不患病。

【詳解】（1）①僅據圖1可看出，父親患病，后代女兒有患病的，也有未患病，所以該病一定不是X染色

體顯性遺傳病，也不是Y染色體遺傳病，有可能是常染色體顯性、隱性或X染色體隱性遺傳病。

②由圖2可知，當個體的所有H基因中CAG重復次數均小于或均不超過25次時才可能不患??；II-1重

復次數比1-1高，但H-1并未患病，估計與年齡較小有關，推測該病會伴隨年齡增長呈漸進性發病。

③11-1、11-3、11-4、II-5是1-1的孩子，所以推測在1-1減數分裂產生配子時，有DNA的復制，可以

進行CAG的重復，所以推測患者I-1在減數分裂形成配子過程中異常H基因中的CAG重復次數會增加。

若II-2（紅綠色盲患者）成年后與一正常男人婚配，由于紅綠色盲是伴X隱性遺傳病，他們所生的孩子中

男孩都患病，因此最好生女孩。

④若II-1是白化病基因（用A、a表示）的攜帶者，與一個攜帶有紅綠色盲基因（用B、b表示）和白化

病基因的正常女性婚配,即AaXBYxAaXBX二所生正常女兒為A_XBX一,其中為純合子的概率為l/3xl/2=l/6o

（2）①動物的核移植技術需要將細胞核移植到動物的去核卵母細胞中，構建重組細胞，再將重組細胞發

育來的早期胚胎移植到代孕母豬體內，獲得子代Fo,由于重組細胞能發育成完整個體，體現了動物細胞核

具有全能性。

②由于親代在減數分裂形成配子過程中異常H基因中的CAG重復次數會增加，即隨著繁殖代數增加后個

體的H基因中CAG重復次數更高，從而導致子代發病更早或更嚴重，能夠更早的進行研究，因此更適合

作為模型豬的是F2個體。

(3)A、研究發現，患者神經細胞內亨廷頓蛋白結構異常，在細胞內過度聚集無法被清除，故誘導HD致

病蛋白在細胞內特異性降解，是HD治療策略之一，A正確；

B、神經細胞是高度分化的細胞，成年人一般不能進行分裂、分化形成，因此殺死神經系統病變細胞，會

使神經細胞數量減少，不能作為治療HD的手段，B錯誤；

C、干擾異常H基因mRNA的翻譯，會降低HD致病蛋白的含量，可以作為治療手段，C正確；

D、基因治療改變異常H基因，使其合成正常蛋白質，可以作為治療HD的手段，D正確。

故選ACD?

6.(2023?江蘇南通?統考模擬預測)利用轉基因的工程菌生產藥用蛋白，近些年在我國制藥行業中異軍突

起。圖1是基因工程常用的一種質粒；圖2是利用該質粒構建的一種基因表達載體。各限制酶質粒上分別

只有一處識別序列，將質粒和重組質粒用相應的限制酶酶切后，得到的DNA片段長度如表中數據。請回

答下列問題：

□氨芳青霉素抗性基因

圖1

質粒重組質粒

Bglll6.Okb7.Ikb

Clal6.Okb2.3kb,4.8kb

PstI6.Okb1.5kb,5.6kb

(1)在基因工程中作為載體的質粒應具備的基本條件有一,而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，

還需具有一O

(2)為了獲得更多的目的基因，可用PCR擴增，PCR的原理是oPCR反應體系中加入dNTP后，這些

物質既可以作為,也可以為反應提供-0

(3)PCR中通常會得到不同的DNA產物，常采用法鑒定，不同DNA片段因____等不同，在電場中

的遷移速率也不同，因而可以形成不同條帶。

(4)已知質粒被切除的片段長度為0.5kb,則與質粒結合的目的基因長度為kb。質粒上ClaI與PstI

區域之間的長度為2.4kb(如圖1所示)，結合圖2分析，目的基因上ClaI、PstI兩種限制酶的切割位

點分別為(在a、b兩點中選填)。

(5)培養受體菌時，在培養基中應加入適量的,可以將導入重組質粒和普通質粒的受體菌都篩選出來。

【答案】(1)在受體細胞中能自我復制(或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制)、具有標記

基因、有一個至多個限制酶切割位點啟動子和終止子)

(2)DNA的半保留復制原料能量

(3)瓊脂糖凝膠電泳相對分子質量、所帶電荷

(4)1.6a和b

(5)氨茶青霉素

【分析】基因工程技術的基本步驟：

(1)目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成。

(2)基因表達載體的構建：是基因工程的核心步強，基因表達截體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基

因等。

(3)將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法

有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目

的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

(4)目的基因的檢測與鑒定分子水平上的檢測。

【詳解】(1)作為載體的質粒應具備的基本條件：在受體細胞中能自我復制(或整合到受體DNA上，隨

受體DNA同步復制)、具有標記基因、有一個至多個限制酶切割位點。作為基因表達載體，除滿足上述基

本條件外，還需具有啟動子和終止子。

(2)PCR的原理是DNA的半保留復制，PCR反應體系中加入dNTP后，這些物質既可以作為原料，也可

以為反應提供能量。

(3)PCR中通常會得到不同的DNA產物，常采用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定，不同DNA片段因相對分子質

量、所帶電荷等不同，在電場中的遷移速率也不同，因而可以形成不同條帶。

(4))根據表格信息，質粒為6.0kb,減去被切除的長度為0.5kb的片段，則剩余的為5.5kb,而重組質粒

為7.1kb,說明插入的目的基因長度為7.1-5.5=1.6(kb)；質粒上含抗四環素基因的Clal與PstI區域長度為

2.4kb,減去被切取的片段長度為0.5kb后為1.9kb,插入的目的基因長度為1.6kb,所以重組質粒上含抗四

環素基因的Clal與PstI區域長度為1.9+1.6=3.5(kb),又根據表格信息，通過ClaI切割重組質粒，產生

了2.3kb片段，通過PstI切割重組質粒，產生了1.5kb片段。設PstI切割位點為a,Clal切割位點為b,

則會出現圖3中所示結果，而2.3+1.5=3.83.8>3.6,說明a為ClaI切割位點、b為PstI切割位點，反之則

不成立。

(5)培養受體菌時，在培養基中應加入適量的氨葦青霉素，可以將導入重組質粒和普通質粒的受體菌都

篩選出來。

7.(2023?江蘇南京?統考二模)重組人纖溶酶原激活劑(hPA)能夠高效特異性地溶解血栓，目前已培育成

功rhPA轉基因兔，作為乳腺生物反應器批量生產藥物。某科研團隊構建的PCL25/hPA重組質粒如圖1所

示(該質粒以P—casein作為調控序列，以CMV為啟動子，圖1中SadI>XhoI、NotI所在位置表示相

關限制酶切點)，圖2為培育rhPA轉基因兔時用的乳腺特異性表達載體及PCR檢測原理圖(PCR—F、

PCR—R為引物序列)。請回答下列問題：

Sall

PCR-F：CGTGGATAGCGGTTTGA"PCR-R：GAGCCCTCCTTTGATGC

圖2

⑴據圖1推測，PCL25/rhPA重組質粒是在PCL25質粒的限制酶切位點處插入化學合成的

rhPAcDNA片段構建而成。rhPA基因上游的CMV能被識別并結合，從而開啟轉錄過程。

（2）為獲得圖2的乳腺特異性表達載體需用切割PCL25/rhPA重組質粒使之線性化。PCR—F

和PCR—R設計時依據的是_____________序歹U。

（3）對實驗得到的1?6號仔兔進行PCR及產物檢測，得到圖3所示結果，則成功導入rhPA基因的仔兔有

o（注：M道條帶可作為雙鏈線狀DNA分子量大小的參照，7道為顯微注射片段PCR擴增

產物作陽性對照）

（4）生長激素（GH）可促進動物細胞增殖和乳腺生長發育及維持泌乳。研究人員將GH基因導入rhPA單轉

基因兔體內，獲得rhPA/GH雙轉基因兔，以期提高免乳清中的rhPA表達量。

①完成下列表格:

實驗目的簡要操作過程

顯微注射用基將PCL25/GH質粒雙酶切而線性化，電冰分離不同大小分子量的基因片段，回收真核基

因片段的準備因片段待用

對兔進行選取3只未發情的rhPA單轉基因兔作為供體（標號a、b、c）,適量注射FSH/hCG（兩

_______和同期種促性腺激素），與正常公兔配種，在母兔的_____________（填部位）形成受精卵。在

發情處理供體兔配種的同時，選取成年健康新西蘭母兔作為受體，耳緣靜脈注射適量hCG。

雙轉基因免的

將顯微注射基因片段導入受精卵的原核內，適宜條件培養，胚胎移植。

制備

無菌剪取新生仔兔的耳尖組織少許，提取基因組。針對rhPA和GH兩種基因，設計

轉基因兔的整

_____________對引物進行PCR檢測。PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定條

合篩選

帶大小是否正確。

rhPA含量測定分別測定_____________乳清中的rhPA的表達量。

②分析實驗結果

樣本供體兔a供體免b供體免C

rhPA表達水平（|ig,mL-i）42.242.815.2

樣本雙轉基因兔al雙轉基因兔a2雙轉基因免bl雙轉基因兔C1

rhPA表達水平432444636248

（注：雙轉基因兔al、2親本來源為供體兔a,雙轉基因兔bl親本來源為供體兔b,雙轉基因兔cl親本來

源為供體兔c）

實驗結果表明，。

【答案】⑴XhoIRNA聚合酶

（2）SalI和NotICMV和rhPA基因的部分脫氧核甘酸序列

（3）2、3、5、6

（4）超數排卵輸卵管2rhPA單轉基因兔和rhPA/GH雙轉基因兔（答“單轉基因兔和雙

轉基因兔”給分）rh1公/GH雙轉基因兔乳腺表達rhPA水平明顯高于rhPA單轉基因兔，GH可協同促

進rhPA在轉基因兔乳腺中的高效表達

【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增

和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、

終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣.將目的

基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的

方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分

子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-DNA分子雜交技術；②檢測目的

基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質-抗原-抗體雜交技術。個體

水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

【詳解】（1）在構建圖1中的重組質粒時要保證目的基因（rhPAcDNA片段）被連接在質粒（PCL25質粒）

上特定的啟動子和終止子之間才能保證目的基因在受體細胞中被成功轉錄，而啟動子和終止子之間只有

XhoI識別序列，據此推測，PCL25/rhPA重組質粒是在PCL25質粒的XhoI限制酶切位點處插入化學合

成的rhPAcDNA片段構建而成。rhPA基因上游的CMV為啟動子，啟動子能被RNA聚合酶識別并結合，

從而開啟轉錄過程。

（2）據圖2可知，該乳腺特異性表達載體是由P—casein,CMV,rhPAcDNA片段等組成，沒有其他序列，

說明這是通過用Sall和Notl切割PCL25/rhPA重組質粒得到的。利用PCR技術擴增目的基因的前提，是

要有“一段已知目的基因核昔酸序列”，以便根據這一序列合成引物，據圖2可知，該PCR是要擴增CMV

和rhPAcDNA片段序列，PCR—F、PCR—R為引物序列，因此PCR—F和PCR—R設計時依據的是CMV

和rhPA基因的部分脫氧核甘酸序列。

（3）據題意可知,7道為顯微注射片段PCR擴增產物作陽性對照,說明要擴增的DNA片段為500kb左右，

2,3,5,6號仔兔的PCR產物片段為5Olkb,因此推測功導入rhPA基因的仔兔有2、3、5、6?

（4）①胚胎移植時，需要對兔進行超數排卵（用促性腺激素）和和同期發情（用孕激素）處理。受精卵

的形成在輸卵管。DNA是雙鏈結構，對目的基因PCR時，需要2個引物，本實驗要針對rhPA和GH兩種

基因PCR時，需要設計2對引物。根據實驗結果表格可知，本實驗的因變量為供體a（rhPA單轉基因兔）

和雙轉基因兔al的rhPA表達水平，因此在rhPA含量測定時，要分別測定rhPA單轉基因兔和rhPA/GH雙

轉基因兔乳清中的rhPA的表達量。

②據表格內容可知，rhPA/GH雙轉基因兔乳腺表達rhPA水平明顯高于rhPA單轉基因兔，GH可協同促進

rhPA在轉基因兔乳腺中的高效表達。

8.（2023?江蘇南通?統考二模）酵母雙雜交技術是篩選能與已知蛋白互作的蛋白質的方法，其主要原理如

圖1。黃瓜花葉病毒（CMV）可侵染200多種植物，病毒的外殼蛋白（CMVCP）直接參與病毒的細胞間

轉移、癥狀表現等。研究人員利用酵母雙雜交技術，從CMV感染的番茄葉片cDNA文庫中篩選出CMVCP

互作蛋白基因，圖2為構建CMVCP誘餌載體（能表達出BD-CP融合蛋白）的流程。請據圖回答下列問

題。

a_X與Y不發生相互作用（不能結合）

①提取感染CMV的番茄總RNA

j酵母菌菌落②構建CMVCP的cDNA

不表達一呈白色1

LacZ③構建CMVCP的誘餌載體

啟動子

b.X與理旨發生相互作用市旨結合）

BD序列

酵母菌菌落BamRl

一,表達呈藍色EcoRl

CPcDNA終止子

LacZ

卡那霆素

注：X代表已知蛋白（誘餌蛋白），Y代表靶蛋白;抗性基因

B〉弋表酵母轉錄因子GAL4的DNA結合結構域,

岫弋表GAL4的轉錄激活結構域

圖2誘餌載體的構建

圖1酵母雙雜交技術主要原理

M123

1.5kb

l.Okb

O.5kb

注：M：標準對照；1?3：

依次循環16、18和21次

圖3不同擴增循環數的cDNA電泳

(1)圖1中，獲得BD-X蛋白的關鍵是將相應序列連接形成融合基因，融合基因獲得過程屬于(變異

類型)。X與Y的結合能使轉錄因子的BD和AD同時結合到啟動子上，進而招募酶x催化LacZ基因的轉

錄，酶X是O

(2)圖2中，過程①提取總RNA時選擇有明顯感染癥狀葉片的原因是。過程②中通常利用RT-PCR

技術獲得cDNA,上述技術中不同循環次數的擴增產物電泳結果如圖3,則最適宜的循環次數是次，

依據是o

(3)圖2過程③構建誘餌載體時,為保證CPcDNA能定向插入到指定位置,需要在過程②設計PCR引物時，

o用獲得的誘餌載體先轉化大腸桿菌，再用法將菌液接種到含的選擇培養基上，挑取

陽性單菌落細胞進行測序，確認插入的基因序列正確。

(4)獲得CMVCP誘餌載體轉化的酵母菌后，研究人員進一步開展CMVCP互作蛋白的篩選研究，其主要

實驗流程是：構建感染CMV的番茄cDNA文庫一構建一系列靶蛋白載體-一接種培養，獲取呈

______色的菌落細胞一篩選、鑒定互作蛋白。

【答案】(1)基因突變RNA聚合酶

(2)癥狀明顯葉片細胞中含有大量CMV病毒，有豐富的CP基因182號條帶比1號條帶寬，

而3號條帶較彌散(或2號條帶明亮、整齊)

(3)在兩種引物的5端分別添加BamHI和氏oRI