第一章蛋白質化學1精選編輯ppt2精選編輯ppt第一節蛋白質概述第二節氨基酸的結構、分類和性質第三節蛋白質的結構第四節蛋白質分子結構和功能的關系第五節蛋白質的理化性質第六節蛋白質的分離純化技術第七節氨基酸序列測定3精選編輯ppt第一節蛋白質概述一、蛋白質的概念二、蛋白質的元素組成三、蛋白質的基本結構單位四、蛋白質的分類五、蛋白質在生命活動中的重要功能4精選編輯ppt一、蛋白質的概念蛋白質(Protein)是氨基酸通過肽鍵按一定順序連接而成的一條或幾條肽鏈，經彎曲折疊形成的具有特定空間構象和生物學功能的生物大分子。Proteinsarelargebiologicalmolecules

consistingofoneormorepolypeptidestypicallyfoldedintoaglobularorfibrousform,facilitatingabiologicalfunction.

5精選編輯ppt二、元素組成1.主要元素：C(50-55%)、H(6-7%)、O(19-24%)、N(13-19%)、S(0-4%)

其他元素：P、I、Se、

Fe、Zn、Mn、Cu、CoMo等。2.特點：N含量相對恒定，平均16%100克蛋白質中含16克N。

1克N相當于6.25克蛋白質應用：凱氏定氮法(Kjeldahldetermination)測定樣品中蛋白質的含量.6精選編輯ppt三、蛋白質的基本組成單位氨基酸（aminoacid，AA）是蛋白質的基本組成單位22種（已知）AA參與蛋白質的合成7精選編輯ppt四、蛋白質的分類根據組成分類：單純蛋白質（simpleprotein）和結合蛋白質（conjugatedprotein）。結合蛋白質（conjugatedprotein）：糖蛋白、脂蛋白、核蛋白血紅蛋白等。

Asimpleproteinisaproteinthatyieldsonlyaminoacidsortheirderivatives

uponhydrolysis；

Aconjugatedproteinisaproteinthatfunctionsininteractionwithotherchemicalgroupsattachedbycovalentbondsorbyweakinteractions.

根據分子形狀分類：纖維狀蛋白質(fibrousprotein）、球狀蛋白質（globularprotein）和膜蛋白（membraneprotein）。根據生物功能分類：結構蛋白、信息蛋白、受體蛋白、運輸蛋白、通道蛋白、免疫蛋白、酶等。8精選編輯ppt五、蛋白質在生命活動中的重要功能

1、是生物體的結構成分

1）參與生物機體各組織和器官的構成（如膠原蛋白、角蛋白）

2）參與收縮和運動功能（肌球蛋白和肌動蛋白，細菌的鞭毛和纖毛蛋白）

3）保護和支持功能：結締組織和骨骼中的膠原蛋白2、特殊生物學功能

1）催化功能：生物催化劑

2）運輸功能：紅細胞運輸O2、CO2要靠Hb,脂類運輸需要載脂蛋白9精選編輯ppt3）防御功能：抗體、溶菌酶、（腸道等分泌的）粘蛋白等4）信息傳遞功能：起接受和傳遞信息作用的受體蛋白等5）調節和調控功能：激素、調節因子

3、儲存和營養功能蛋中的卵清蛋白、乳中的酪蛋白、小麥種子中的麥醇溶蛋白等4、氧化供能

10精選編輯ppt第二節氨基酸的結構、分類和性質

一、氨基酸的結構通式二、20種普通氨基酸的結構式三、氨基酸的種類四、氨基酸的理化性質11精選編輯pptSidechainAminogroupCarboxylicacid一、Ｌ-α－氨基酸的結構通式：12精選編輯ppt13精選編輯ppt14精選編輯ppt二、20種普通氨基酸（commonaminoacids）的結構一）根據酸堿性分類:酸性氨基酸:2個–COOH、1個-NH2AspGlu堿性氨基酸:1個–COOH、

2個堿性基團：（氨基、胍基、咪唑基）

LysArgHis中性氨基酸:1個–COOH、1個-NH2（15種）

極性中性氨基酸和非極性中性氨基酸15精選編輯ppt非極性中性--脂肪族R基團16精選編輯ppt甘氨酸，Gly(G)唯一無手性碳原子的氨基酸無鏡象立體異構體直接和四個不相同的原子或原子團相連的碳原子

17精選編輯ppt丙氨酸，Alanine,Ala(A)R基團甲基accountingfor7.8%oftheprimarystructureinasampleof1,150proteins.

18精選編輯ppt脯氨酸，proline，Pro（P)

亞氨基酸側鏈R同時與Ca原子及氨基相連itisoftenfoundin"turns"ofproteins

β-吡咯烷基-a-羧酸）

19精選編輯ppt纈氨酸，Valine，Val（V）branched-chainaminoacidessentialaminoacid

20精選編輯ppt亮氨酸，Leucine，Leu（L）異丁基（isobutyl

）branched-chainaminoacidessentialaminoacid

21精選編輯ppt異亮氨酸，Isoleucine,Ile（I）有兩個手性碳原子branched-chainaminoacidessentialaminoacid

22精選編輯ppt蛋氨酸（甲硫氨酸），Methionine,Met（M）側鏈含甲硫基（甲基硫醚基

)essentialaminoacidanintermediateinthebiosynthesis

23精選編輯ppt芳香族R基團氨基酸24精選編輯ppt芳香族R基團氨基酸苯丙氨酸，Phenylalanine,Phe(F)a-氨基-β-苯丙酸

苯甲基（benzyl）EAA25精選編輯ppt芳香族R基團氨基酸酪氨酸tyrosineTyr（Y),EAAasareceiverofphosphategroupsa-氨基-β-對羥基苯丙酸

中性極性AA羥基是活性基團-OH-asareceiverofphosphategroups

26精選編輯ppt芳香族R基團氨基酸色氨酸，TryptophanTrp（W),亞甲基與吲哚環相連EAA27精選編輯ppt極性中性R基團28精選編輯ppt極性中性R基團絲氨酸，Serine，Ser（S）羥甲基29精選編輯ppt蘇氨酸，Threonine，Thr（T），有兩個手性碳原子EAAItissusceptibletonumerousposttranslationalmodifications

極性中性R基團羥基為活性基團30精選編輯ppt半胱氨酸，Cysteine,Cys(C)極性中性R基團亞甲基連接一個巰基強還原性31精選編輯ppt極性非帶電R基團天冬酰胺Asparagine,Asn(N)甲酰胺基（carboxamide

）32精選編輯ppt極性非帶電R基團谷氨酰胺，Glutamine，Gln（Q)33精選編輯ppt堿性氨基酸(帶正電R基團)+34精選編輯ppt賴氨酸，Lysine，Lys（K)側鏈連接一個氨基，為堿性氨基酸EAA堿性氨基酸35精選編輯ppt精氨酸，Arg（R)含胍基，堿性氨基酸堿性氨基酸36精選編輯ppt組氨酸，His（H)含咪唑基，堿性氨基酸EAA

+堿性氨基酸37精選編輯ppt酸性氨基酸-帶負電R基團天冬氨酸，Asp(D)酸性氨基酸谷氨酸，Glu(E)酸性氨基酸38精選編輯ppt39精選編輯ppt40精選編輯ppt二）R側鏈的特殊性及其作用1）Tyr\Ser\Thr\-OH：蛋白質的活性部位;2）Leu、Ile、Val、Met等：側鏈是較大（疏水力）;3）Pro：雜環，構象的靈活性差;4）Phe\Trp\Tyr:257nm\280nm\276nm41精選編輯ppt5）兩Cys殘基的巰基可以形成二硫鍵：對形成和穩定Protein的特定結構起著重要的作用。42精選編輯ppt6）Tyr、Cys、Asp、Glu、His、Lys和Arg帶有離子化的側鏈，可以接受或提供質子。7）Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr：側鏈可以參與形成氫鍵。43精選編輯ppt三、氨基酸的種類

已發現500多種1、標準氨基酸（proteinogenicorstandardaminoacids

）：合成蛋白質的22（23？）種AA

20種通用密碼子編碼的氨基酸

Selenocysteine(硒代半胱氨酸）：密碼子UGAPyrrolysine（吡咯賴氨酸）：密碼子UAG

N-Formylmethionine（N-甲酰蛋氨酸）：起始密碼子AUG44精選編輯ppt

硒代半胱氨酸，Selenocysteine,Sec(U)(R)-2-胺基-3-氫硒基丙酸

45精選編輯ppt吡咯賴氨酸，Pyrrolysine，Pyl

(O)46精選編輯pptN-甲酰蛋氨酸（N-Formylmethionine，fMet)47精選編輯pptselenocysteineandpyrrolysine,areincorporatedintoproteinsbyuniquesyntheticmechanisms.SelenocysteineisincorporatedwhenthemRNAbeingtranslatedincludesaSECISelement,whichcausestheUGAcodontoencodeselenocysteineinsteadofastopcodon.Pyrrolysineisusedbysomemethanogenic

archaeainenzymesthattheyusetoproducemethane.ItiscodedforwiththecodonUAG,whichisnormallyastopcodoninotherorganisms.ThisUAGcodonisfollowedbyaPYLISdownstreamsequence.N-Formylmethionine(fMet)isaproteinogenic

aminoacid.Itisaderivativeoftheaminoacid

methionineinwhichaformylgrouphasbeenaddedtotheaminogroup48精選編輯ppt2、修飾氨基酸（稀有氨基酸）：蛋白質合成后，氨基酸殘基的某些基團被修飾后形成的氨基酸。

沒有相應的密碼子修飾方式：甲基化、乙酰化、羥基化、羧基化、磷酸化等。如：4-羥脯氨基酸、5-羥賴氨酸49精選編輯ppt膠原蛋白中4-羥脯氨基酸50精選編輯ppt膠原蛋白中5-羥賴氨酸51精選編輯ppt肌球蛋白6-N-甲基賴氨酸52精選編輯ppt凝血酶原53精選編輯ppt3、非蛋白質氨基酸既不是合成氨基酸的原料，也不是蛋白質的水解產物。

D-氨基酸

β或γ，δ-氨基酸

瓜氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸等

54精選編輯ppt四、氨基酸的理化性質（一）兼性離子形式（二）兩性性質和等電點（三）其他理化性質55精選編輯ppt（一）兩性解離和等電點1、兩性電解質:既能接受質子（堿）又能釋放質子（酸）。2、等電點（pI）使氨基酸離解成陽性離子和陰性離子的趨勢和程度相等，總帶電荷為零（呈電中性）時的溶液pH值。

56精選編輯ppt兼性離子形式57精選編輯ppt中性氨基酸的pI等于a－羧基和a－氨基解離常數負對數和的一半

pI＝1/2(pK′1+pK′2)58精選編輯ppt酸性氨基酸的pI59精選編輯ppt堿性氨基酸的pI60精選編輯ppt61精選編輯ppt3、氨基酸在不同pH溶液中的帶電情況溶液pH<pI,氨基酸帶正電荷，在電泳時向負極運動。pH=pI，氨基酸所帶總電荷為零，在電泳時不移動。pH>pI,氨基酸帶負電荷，在電泳時向正極運動。62精選編輯ppt（二）其他理化性質

1.旋光性:能使偏振光振動平面旋轉2.構型：具有手性碳原子化合物的空間構象CAR走向（逆時針－L)63精選編輯ppt64精選編輯ppt65精選編輯ppt3.紫外吸收性質三種氨基酸（Trp、Tyr、Phe）

280nm66精選編輯ppt67精選編輯ppt68精選編輯ppt4.茚三酮反應

氨基酸＋水合茚三酮氨＋還原茚三酮＋CO2氨＋還原茚三酮＋水合茚三酮

藍紫色物質＋3H2OProline：orange/yellowcolour.

弱酸（共熱）69精選編輯ppt第三節蛋白質的結構70精選編輯ppt一、肽鍵和肽鏈（一）肽鍵（二）肽鏈71精選編輯ppt（一）肽鍵1.肽鍵（peptidebond）合成肽鏈時，前一個氨基酸的α－羧基與下一個氨基酸的α－氨基通過脫水作用形成的酰胺鍵.72精選編輯ppt73精選編輯ppt2.肽鍵的剛性：肽鍵具有部分雙鍵性質酰胺氮（含）孤對電子和羰基產生共振相互作用，形成共振雜化體74精選編輯ppt3.肽鍵平面（酰胺平面）參與肽鍵的六個原子位于同一平面，不能自由轉動,稱為肽平面。75精選編輯ppt（二）肽鏈（peptidechain）肽鏈：許多氨基酸通過肽鍵連接在一起形成的長鏈，即多肽鏈的主鏈（mainchain）76精選編輯ppt方向性：N端（氨基端）和C端（羧基端）氨基酸殘基（aminoacidresidue重復單位：N-Ca－C肽鏈有形成氫鍵的傾向77精選編輯ppt78精選編輯ppt二、寡肽、多肽和蛋白質（一）相關概念肽（peptide）：氨基酸通過肽鍵連接形成的產物1.寡肽（oligopeptide）:≦10AA

谷胱甘肽:3肽，還原劑促甲狀腺釋放激素：3肽血管加壓素、催產素（垂體后葉）：9肽腦啡肽（為神經肽）：5肽79精選編輯ppt谷胱甘肽(glutathione,GSH)結構:80精選編輯pptGlu、Cys和Gly組成的三肽Glu的

-羧基參與形成肽鍵－SH為活性基團81精選編輯pptGSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+主要功能:是體內重要的還原劑82精選編輯ppt2.多肽（polypeptide）:10AA<多肽≦50AA

促腎上腺皮質激素：39肽強啡肽等神經肽3.蛋白質（protein）:>50AA

天然的多肽鏈一般在50-200AA

27,000AA(肌聯蛋白）83精選編輯ppt三、蛋白質的結構84精選編輯ppt85精選編輯ppt（一）一級結構（Primarystructure）1概念是指多肽鏈從N端到C端的氨基殘基種類、數量和順序。2．主要的化學鍵：肽鍵,二硫鍵3．由遺傳物質DNA分子上相應核苷酸序列即遺傳密碼決定的86精選編輯ppt6－107－719－2087精選編輯ppt(二)二級結構(Secondarystructure)1、定義是指蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即蛋白質主鏈原子的局部空間排布（不涉及側鏈原子的位置）。88精選編輯ppt2、二級結構的主要類型α-螺旋(

-helix)

β-片層（β-折疊，

-pleatedsheet

）β-轉角(

-turn)無規則卷曲（randomcoil

）π-螺旋(π-helix)

維持二級結構的化學鍵：氫鍵89精選編輯ppt90精選編輯ppt（1）α－螺旋多肽鏈主鏈的一段（肽段），從N端到C端形成順時針方向的右手螺旋結構。91精選編輯ppt結構要點多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。每圈螺旋含3.6個氨基酸殘基（13個原子），螺距為0.54nm每個肽鍵的亞氨氫（N—H）和它前面（earlier）的第四個肽鍵的羰基氧（C=O）形成氫鍵；氫鍵方向與螺旋長軸基本平行。92精選編輯ppt93精選編輯ppt氨基酸殘基R側鏈在螺旋外側94精選編輯pptPro很少在該二級結構中出現；相鄰氨基酸殘基帶有相同電荷時會影響α－螺旋的穩定（多聚賴氨酸，pH7.0,pH12.0)；常見于肌紅蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白、跨膜蛋白、角蛋白中95精選編輯ppt（2）β-片層（β-折疊）（β-pleatedsheetstructure）常見于脂肪蛋白、絲心蛋白（無彈性）96精選編輯ppt2～數個肽段平行或反向平行聚積在一起；肽段之間走向可以相同或相反97精選編輯ppt相鄰肽段之間經C=O與N—H間形成的氫鍵來維系；氫鍵方向與肽鏈長軸方向相垂直；98精選編輯ppt肽鏈充分伸展，相鄰肽鍵平面略呈鋸齒狀側鏈交錯位于片層的上下兩側；99精選編輯ppt每個肽段以Cα為旋轉點100精選編輯ppt（3）β－轉角（β－turn）指肽鏈出現180o左右轉向回折形成的“U”形有規律的二級結構單元。含4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵，第二個AA多為Pro球狀蛋白質101精選編輯ppt（4）π-螺旋（π-helix）左手螺旋肽鏈以4.4個氨基酸殘基（18原子）盤旋一圈氫鍵與螺旋長軸基本平行膠原蛋白102精選編輯ppt（5）無規則卷曲（randomcoil）沒有確定規律性的肽鏈結構。103精選編輯ppt3.模體（motif）蛋白質分子中，二級結構單元有規則地聚集在一起形成混合或均有的空間構象，又稱超二級結構（asupersecondarystructure

）。αα、βββ、βαβ和αTα等104精選編輯ppt鈣結合蛋白中的鈣結合模體。105精選編輯ppt鋅指結構Twobetastrandswithanalphahelixendfoldedovertobindazincion.ImportantinDNAbindingproteins。106精選編輯ppt（三）三級結構（tertiarystructure）定義：是指整條多肽鏈中所有氨基酸殘基的相對空間位置(肽鏈上所有原子的相對空間位置).化學健：疏水鍵和氫鍵、離子鍵、范德華力等來維持其空間結構的相對穩定。

107精選編輯ppt108精選編輯ppt8個α－螺旋（75％aa）通過轉角、Loop或隨意卷曲連接，進一步卷曲形成三級結構。多數疏水性AA位于球形結構內部。肌紅蛋白109精選編輯ppt110精選編輯ppt結構域(domain)

蛋白質三級結構中，折疊緊湊、可被分割成獨立的球狀或纖維狀，具有特定功能的區域，稱為結構域。結構域通常是幾個超二級結構單元的組合；

是構成蛋白質三級結構的基本單元。111精選編輯pptAproteindomainisapartofproteinsequenceandstructurethatcanevolve,function,andexistindependentlyoftherestoftheproteinchain.

compactstructure、function、foldingautonomously（individualhydrophobiccore）

pyruvatekinase：anregulatorydomain,anα/β-substratebindingdomainandanα/β-nucleotidebindingdomain.112精選編輯ppt（四）四級結構（Quarternarystructure）概念1：蛋白質分子中幾條各具獨立三級結構的多肽鏈間相互結集和相互作用，排列形成的更高層次的空間構象。概念2：是指蛋白質分子中各亞基的空間排布和相互作用。亞基：蛋白質分子含有兩條或兩條以上多肽鏈，且每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為亞基（subunit)。作用力：亞基間以離子鍵、氫鍵、疏水力連接。此外，范德華力、二硫鍵(如抗體）。113精選編輯ppt114精選編輯ppt亞基數多為偶數亞基為同種或不同種α、β等命名具四級結構的蛋白質分子，亞基單獨存在不具有生物活性115精選編輯ppt116精選編輯ppt四、參與蛋白質的正確折疊的幾種物質Proteinfoldingisaveryactiveareaofresearchandiscertainlynotcompletelyunderstood.分子伴侶折疊酶117精選編輯ppt（一）分子伴侶(chaperone)定義：一類在序列上沒有相關性但有共同功能，在細胞中能夠幫助其他多肽鏈（或核酸）折疊或解折疊、組裝或分解的蛋白稱為分子伴侶。如熱休克蛋白*可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，使新生肽鏈正確折疊。*與錯誤聚集的肽段結合，誘導其正確折疊。*對蛋白質分子中二硫鍵的正確形成起重要的作用。作用：118精選編輯ppt（二）折疊酶定義：催化與折疊直接有關的化學反應的酶。肽酰脯氨酰順-反異構酶蛋白質二硫鍵異構酶：催化新生肽鏈中二硫鍵的相互轉換，保證正確二硫鍵的形成。119精選編輯ppt120精選編輯ppt第四節蛋白質分子結構和功能的關系

一、一級結構和功能的關系（一）一級結構是形成高級結構的分子基礎121精選編輯ppt例：鐮刀形紅細胞貧血N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val

·Glu·····C(146)（二）蛋白質一級結構的改變，可能引起其功能的異常或喪失（“分子病”）122精選編輯ppt這種由蛋白質分子發生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。123精選編輯ppt（三）同功能蛋白質序列的種屬差異與保守性1、蛋白質的活性中心的以及維持構象的氨基酸在不同種屬之間的保守性很高。2、同功能蛋白質在種屬之間的氨基酸序列差異程度與這些種屬在親緣關系遠近大體上平行。124精選編輯ppt二、空間結構和功能的關系（一）蛋白質分子的空間結構是其發揮生物學活性的基礎。血紅蛋白（homoglobin）1、

血紅蛋白的構象變化與結合氧氧飽和度變構蛋白協同效應125精選編輯ppt肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線126精選編輯ppt（二）蛋白質分子構象的改變影響生物學功能或導致疾病的發生

蛋白質構象病（折疊病）：蛋白質一級結構不變，但由于折疊錯誤，導致蛋白質構象改變而引起的疾病。

127精選編輯ppt瘋牛病朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)構象改變引起的神經退行性病變。正常的PrP（PrPc）富含α-螺旋（42%，片層僅占3%

）。瘋牛病的PrP（

PrPsc

）

β-片層占45%，α-螺旋30%。

PrPsc相互聚集，形成淀粉樣纖維沉淀而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病128精選編輯pptThemajorprionproteinisexpressedinthebrainandseveralothertissues；PrPCattachestotheoutersurfaceofthecellmembrane

；TheabnormalPrPScisoformhasadifferentsecondaryandtertiarystructurefromPrPC,butidenticalprimarysequence

，andisgenerallyquiteresistanttoproteases,heat,radiation,andformalintreatments,althoughtheirinfectivitycanbereducedbysuchtreatments；Mad-cowdisease

canbetransmittedtohumansbyingestionofbrain,spinal,ordigestivetracttissueofaninfectedcow.

129精選編輯ppt瘋牛病牛的腦部切片130精選編輯ppt病羊神經組織的海綿狀損傷131精選編輯ppt朊病毒的復制朊病毒的復制模式A：傳染型和散發型的朊病毒復制模式；B：遺傳型的朊病毒復制模式。132精選編輯ppt第五節蛋白質的理化性質一、蛋白質的兩性電離及等電點二、大分子親水膠體性質三、蛋白質的變性（denaturation）四、紫外吸收特征五、蛋白質的顯色反應六、蛋白質的分子量大小

133精選編輯ppt一、蛋白質的兩性電離及等電點1、兩性電離：來自側鏈（主要）末端α－氨基和α－羧基。2、等電點：多接近5.0，少數為堿性，胃蛋白酶為酸性。

134精選編輯ppt二、親水膠體性質

膠體分子：直徑在1－100nm親水膠體的穩定因素：水化層：分子表面的親水基團雙電層：分子表面的可解離基團

135精選編輯ppt三、蛋白質的變性變性（denaturation）：在某些理化因素的作用下，特定的空間結構被破壞而導致其理化性質改變及生物活性喪失的過程。因素：物理（高溫、高壓、紫外線），化學（強酸堿、有機溶劑、重金屬鹽）變性的本質：非共價鍵和二硫鍵斷裂136精選編輯ppt蛋白質的復性（renaturation）：在合適的條件下，變性蛋白質分子重新卷曲形成天然空間結構，并恢復其生物活性的過程。多數不可逆137精選編輯ppt

應用舉例消毒及滅菌。蛋白質制劑（如疫苗等）的有效地保存。

138精選編輯ppt四、紫外吸收280nm波長下有特征性吸收峰：定量分析五、顯色反應茚三酮反應：水解產生的氨基酸雙縮脲反應：是蛋白質肽鍵的特征反應，在稀堿中與硫酸銅共熱，生成紫色或紅色物質。139精選編輯ppt六、蛋白質的分子量大小變化范圍很大：6X103－106通過凝膠過濾層析、凝膠電泳、超離心等方法分離蛋白質混合物。140精選編輯ppt第六節蛋白質的分離純化一、原理利用不同蛋白質分子的溶解性（solubility）、分子大小（size）、帶電情況（charge）、親和能力（affinityproperty）等的不同。二、原則提取分離過程中防止蛋白質降解或失活（蛋白酶、pH、T）141精選編輯ppt三、一般程序

1.材料的選擇、預處理（如勻漿，細胞裂解）

2.粗提（crudeextract）：透析、鹽析、沉淀法等

3.精提：層析、電泳、離心4.質量鑒定：酶活力測定

142精選編輯ppt四、細胞裂解（Celllysis）細胞裂解是分離純化蛋白質的第一步根據不同生物（cellwall？）、不同樣品(cellsortissue),細胞類型（celltypes）亞細胞結構（subcellularstructures）或特殊蛋白（specificproteins）來選擇合適的裂解方法（一）裂解方法1.物理方法：勻漿法或聲波降解法缺點：需要較多的樣品，不能很好提取膜蛋白2.試劑裂解法（reagent-basedlysis）：usedifferentbuffers,detergents,saltsandreducingagents。即可裂解細胞，還可以提高蛋白質的溶解性143精選編輯ppt（二）防止蛋白質降解和被修飾細胞中含內源性的蛋白酶和磷酸酶等（endogenousproteasesandphosphatases）：加入酶抑制劑（proteaseand/orphosphataseinhibitors）抑制酶活性（三）保護蛋白的穩定性和功能試劑成分（如detergent）可能破壞酶活：后續分析過程中除去。144精選編輯ppt（四）蛋白成分的去除和富集（DepletionandEnrichment）1.蛋白成分的去除目的：除去高含量的蛋白質或分離出目的蛋白high-abundanceproteinscanmaskdetectionofthosefromlow-abundanceproteins.Depletionstrategiesutilizeimmunoaffinitytechniquessuchasimmunoprecipitationandco-immunoprecipitation缺點（drawback）：高含量蛋白可能和待研究的低含量蛋白結合在一起.2.富集親和層析等分離特定細胞器（Separationofdistinctsubcellularfractions）來富集目的蛋白：145精選編輯ppt五、蛋白質的分離純化技術（一）粗提方法1、透析（Dialysis

）：透析袋去除小分子物質去除帶電離子、鹽分（鈉鹽和磷酸鹽）2、鹽析溶液中加入無機鹽類而使蛋白質溶解度降低而析出的過程3、有機溶劑沉淀（丙酮、乙醇等，預冷）4、免疫沉淀法：抗原-抗體復合物146精選編輯ppt透析147精選編輯ppt（二）精提方法

一）層析法1.凝膠過慮層析：2.離子交換層析：3.親和層析：148精選編輯ppt1.凝膠過濾層析（分子篩）原理：分子大小和形狀不同固定相：多孔的凝膠珠149精選編輯ppt150精選編輯ppt2.離子交換層析

原理：在一定pH條件下蛋白質分子所帶電荷不同

固定相：樹脂顆粒（表面陽離子陰離子交換樹脂

表面陰離子陽離子交換樹脂）151精選編輯ppt表面陽離子陰離子交換樹脂（resin）表面陰離子陽離子交換樹脂152精選編輯ppt153精選編輯ppt154精選編輯ppt

3.親和層析原理：蛋白質與配體間特異的相互作用固定相：共價連接有配體的惰性基質如：抗體-抗原激素-受體酶-底物155精選編輯ppt156精選編輯ppt高壓液相層析基質株更小，孔徑更均一，基質填充更致密157精選編輯ppt二）電泳法蛋白質分子在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。薄膜電泳凝膠電泳158精選編輯ppt薄膜電泳159精選編輯ppt1、SDS電泳2、等電聚焦電泳3、雙向電泳

160精選編輯ppt1.SDS電泳161精選編輯pptSDSSDS:十二烷基硫酸鈉，陰離子去污劑PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS:十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟：破壞二硫鍵加入SDS上樣電泳染色回收原理：多肽鏈的遷移率與其分子量的對數成反比作圖：標準蛋白分子量對數遷移率（線性）

162精選編輯ppt163精選編輯ppt164精選編輯ppt原理：基于蛋白質分子大小以及形狀不同載體：聚丙烯酰胺凝膠165精選編輯pptThemigrationofaproteininagelduringelectrophoresisisthereforeafunctionofitssizeanditsshape.SDSbindstomostproteinsinamountsroughlyproportionaltothemolecularweightoftheprotein,aboutonemoleculeofSDSforeverytwoaminoacidresidues.TheboundSDScontributesalargenetnegativecharge,renderingtheintrinsicchargeoftheproteininsignificantandconferringoneachproteinasimilarcharge-to-massratio.Inaddition,thenativeconformationofaproteinisalteredwhenSDSisbound,andmostproteinsassumeasimilarshape.ElectrophoresisinthepresenceofSDSthereforeseparatesproteinsalmostexclusivelyonthebasisofmass(molecularweight),withsmallerpolypeptidesmigratingmorerapidly.166精選編輯ppt染色（Staining）銀染蛋白質中各種基團（如琉基、碳基等）與銀結合顯色，檢測極限是2～5.0ng／蛋白條帶染料染色如考馬斯亮藍Coomassieblue）：三苯甲烷類染料，可與蛋白質形成較強的非共價復合體。

167精選編輯ppt168精選編輯ppt2.等電聚焦（Isoelectricfocusing)等電聚焦：根據兩性電解質等電點的不同來分離不同物質的方法。169精選編輯ppt170精選編輯ppt171精選編輯ppt3.雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis)等電聚焦：pI不同基質：pH不同的凝膠柱雙向電泳：將等電聚焦技術和SDS技術結合起來172精選編輯ppt173精選編輯ppt174精選編輯ppt三）離心法速率區帶離心(密度梯度離心)原理：不同顆粒之間存在沉降系數差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。

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速率區帶離心法管口到管底密度逐步升高176精選編輯ppt177精選編輯ppt第七節氨基酸順序測定Sanger法1953年測定胰島素的氨基酸順序178精選編輯ppt氨基酸序列測定步驟1、確定蛋白質分子中多肽鏈的數目2、拆分并分離多肽鏈3、分析每條肽鏈的氨基酸組成測定4、每條肽鏈中氨基酸連接順序（1）肽鏈末端氨基酸殘基的測定（2）斷裂多肽鏈并分離各肽段（3）測定各肽段的氨基酸順序（4）確定每個肽段在多肽鏈中的位置

179精選編輯ppt一、多肽鏈數目的確定1、原理：確定N末端（或C末端）殘基2、方法：二硝基氟苯法（DNP法，Sanger試劑，

N末端）丹磺酰氯法（DNS,

強熒光劑，N-端α-氨基反應生成丹磺酰-肽)。

酶法（氨肽酶或羧肽酶）180精選編輯ppt二、拆分并分離