1DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄規模化奶牛場乳房炎防治技術規范本文件規定了奶牛乳房炎的術語和定義、診斷檢測、預防、治療及消毒方法。本文件適用于遼寧省行政區域內規模化奶牛場對奶牛乳房炎的防治。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB13078飼料衛生標準NY/T388畜禽場環境質量標準NY/T2962奶牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌分離鑒定方法NY5027無公害食品畜禽飲用水水質NY/T5030無公害食品畜禽飼養獸藥使用準則NY5032無公害食品畜禽飼料和飼料添加劑使用準則NY5047無公害食品奶牛飼養獸醫防疫準則NY/T5049無公害食品奶牛飼養管理準則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1規模化奶牛場intensivecowfarm規模化奶牛場是指經當地農業、工商等行政主管部門批準，具有法人資格，同時奶牛存欄量頭100以上的奶牛場。3.2奶牛乳房炎bovinemastitis又稱乳腺炎，指乳腺組織的各類炎癥，主要由病原微生物引起，按臨床表現分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎兩種類型。3.3臨床型乳房炎Clinicalmastitis在奶牛的乳房，乳汁，肉眼可見炎癥病理變化，乳汁排出不通暢或者困難，泌乳減少或停止，乳汁變性，乳汁稀薄或變稠。或患部乳房組織出現不同程度的充血、腫脹、溫熱和疼痛，乳房上淋巴結腫大。3.4亞臨床型乳房炎（隱性乳房炎）Subclinicalmastitis2DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄奶牛乳房炎的最常見形式，又稱亞臨床型乳房炎。臨床檢查無癥狀，乳房和乳汁均無肉眼可見的病理變化等，但如果采用體細胞計數方法，其乳汁中的體細胞數量＞3×105次個/mL。4預防4.1營養按照GB13078、NY5032和NY/T5049執行，根據奶牛各生長、生產階段的生理狀況，制定合理的日糧結構，供給奶牛優質飼料，禁止飼喂發霉變質飼料和冰凍飼料。4.2衛生管理選擇高效、低毒、腐蝕性低的消毒劑，制定科學合理的消毒程序，定期對牛舍、運動場和用具徹底清洗和消毒，消毒操作按照NY/T5049的規定執行。4.2.1人員進入生產區人員需要更換消毒后的工作服和鞋帽。4.2.2牛床每日及時清掃牛床內的糞便，并沖洗干凈，每周消毒一次。4.2.3牛舍通道每次搬運飼料后及時清掃牛舍內通道，每周消毒一次。4.2.4運動場每日定時清掃運動場糞便并清洗，每周消毒一次。4.2.5用具牛場用具每周消毒一次。4.3榨乳4.3.1乳房清洗和消毒榨乳前先用40℃~50℃的溫水將乳房擦拭干凈，并選用有效消毒藥液，浸泡消毒奶頭20s，用清洗消毒過的干毛巾擦拭干凈奶頭，做到一牛一巾，擦拭干凈牛體和乳房后及時擠奶。4.3.2手工榨乳乳房清洗消毒后，用清洗消毒過的干毛巾抹干凈乳頭，采用拳握法進行榨乳，榨乳速度為84次/min～120次/min，榨乳量以1kg/min～2kg/min，棄去前3把奶，榨乳期間不停頓，擠完奶后用藥浴液再次浸泡乳頭，進行消毒處理。3DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄4.3.3機械榨乳參照4.3.1清洗和消毒乳房后45s內套好奶杯,榨乳完成后關閉集乳器的真空2s～3s后移去奶杯，隨后用手工方法擠凈乳房內余奶，再用消毒藥液浸泡乳頭。4.4榨乳機的消毒4.4.1榨乳前用80℃至90℃的熱水對榨乳機管道消毒5分鐘。4.4.2榨乳后酸堿洗液交替循環清洗10min～15min，用適當濃度的消毒液循環清洗5分鐘。4.5乳房護理進行乳頭藥浴，自然干燥后，再用浸過75%酒精棉球擦拭乳頭，對乳區注射抗生素（或維生素油劑）。4.6品種選擇引進奶牛時，要查其系譜，選擇抗乳房炎病能力強的奶牛，布病和結核病檢測均為陰性，不用乳房炎遺傳系數高的公牛精液。5診斷5.1臨床診斷乳房炎按臨床表現可分為臨床型和亞臨床型（通常稱為隱性乳房炎臨床型又可分為急性型、亞急性型和慢性型。5.1.1急性乳房炎突然發病，乳房紅腫、變硬、疼痛，乳汁異常，出現全身癥狀。病牛體溫升高，食欲減退，反芻減少，脈搏增速，脫水，全身衰弱、沉郁。當病情發展很快且癥狀嚴重時可危及生命。5.1.2亞急性乳房炎病牛一般沒有全身癥狀，乳汁中有絮片、凝塊，并呈水樣。乳房有輕微發熱、腫脹和疼痛。5.1.3慢性乳房炎慢性乳房炎多由持續感染引起，或由于急性乳房炎轉至。長期存在最終可導致乳腺組織纖維化，乳房萎縮，出現硬結。慢性乳房炎易成為牛群中的感染源，治療價值不大，應及早淘汰。5.1.4隱性乳房炎乳房和乳汁肉眼觀察無異常，經檢測，乳汁體細胞數增加。隱性乳房炎病牛可攜帶病原，可以感染其它健康牛。5.2實驗室診斷4DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄5.2.1臨床型乳房炎臨床型乳房炎主要根據臨床癥狀進行診斷。病原微生物實驗室診斷見附錄A、B。5.2.2隱性乳房炎檢測方法包括乳汁體細胞計數法（CMT和體細胞直接計數法）、乳汁pH檢驗法、電導率值檢驗法、酶類檢測法和乳成分直接檢測法。本文件主要介紹體細胞計數法。檢測方法參見附錄A、B。6處置6.1臨床型乳房炎處置6.1.1隔離對病牛實施隔離，接觸過的用具及環境進行徹底消毒。6.1.2治療按照對癥治療、局部治療、抗感染和輔助性治療相結合的原則對確診的病牛進行有效治療措施，防止病原擴散。6.1.2.1抗感染治療選用抗感染藥物治療。治療前應進行乳汁采樣，進行病原培養，根據藥敏實驗結果選擇用藥6.1.2.2對癥治療解熱、鎮痛、抗過敏。6.1.2.3輔助性治療采用乳房基部封閉、乳房按摩、增加擠乳次數、乳房冷敷、外敷藥物等緩解乳房的腫脹。6.1.3牛奶處理病牛奶用專用容器集中銷毀，嚴格執行休藥期和棄奶規定。6.2隱性乳房炎處置6.2.1奶牛的處置對確診為隱性乳房炎的病牛應隔離觀察。對連續檢測CMT呈陽性、乳汁表現異常、產奶量低、反復發作的病牛，進行淘汰。干乳前10天進行隱性乳房炎監測，對陽性反應在“”以上的牛及時治療，干乳前3天再監測1次，陰性反應方可停乳。6.2.2牛奶的處置應嚴格執行休藥期和棄奶規定。5DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄6.3消毒選用適宜的藥物藥浴乳頭；對病牛污染的場所、用具、物品，特別是榨乳設備進行清洗和嚴格消毒，消毒方法見附件5。7預防措施7.1創造良好的衛生環境牛舍、運動場設計合理，空間寬敞，保持陽光充足；牛床保持清潔、干燥，墊草應干、軟、清潔、新鮮，經常更換。定期對牛舍和運動場進行消毒，乳房炎高發季節應加強消毒。7.2加強飼養管理根據奶牛的營養需要，各生產階段精、粗飼料搭配合理，增加青綠、青貯料的飼喂量，以乳定料，維持機體最佳生理機能。停乳后要隨時檢查乳房，發現異常應立即處理；在干奶后期應適當增加精料，適當控制鹽和多汁飼料的喂量，在飼養管理過程中避免應激。適當增加奶牛的運動，增強機體抗病力。干奶期，每頭奶牛每天供應1.0g維生素E，每公斤日糧不超過0.3mg的硒。7.3規范榨乳操作榨乳操作采用“兩次藥浴，紙巾干擦”。7.3.1榨乳前檢查先檢查乳房外表是否有紅、腫、熱、痛癥狀或創傷。7.3.2乳頭預藥浴選用專用的乳頭藥浴液，進行前藥浴，藥液作用時間應保持在20s～30s。（注：乳房污染嚴重時，用含消毒劑的溫水清洗干凈再進行藥浴）7.3.3擦干乳頭藥浴后用一次性紙巾擦干乳頭和基部。7.3.4驗奶將頭3把奶擠到專用容器中，檢查牛奶是否有凝塊、絮狀物或呈水樣，牛奶正常可榨乳；異常的，應及時治療，單獨榨乳。嚴禁將異常奶混入正常牛奶中。7.3.5上機榨乳套上榨乳杯組（套杯過程中盡量避免空氣進入杯組中，全過程在90s內完成）。榨乳過程中觀察真空穩定情況和榨乳杯組奶流情況，適當調整榨乳杯組的位置。榨乳接近結束，先關閉真空閥，再移走榨乳杯組。嚴禁下壓榨乳機，避免過度榨乳。67.3.6榨乳后藥浴榨乳結束后，迅速進行乳頭藥浴3s～5s。7.4定期檢查加強對乳房炎的監控，每月進行二次檢查。7.5干奶期預防進行隱性乳房炎檢測，陰性奶牛方可進行干奶。榨乳后，向每個乳區注入適量的干奶藥。7DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄（資料性）奶牛乳房炎病原菌分離鑒定方法A1.金黃色葡萄球菌的檢驗A1.1主要試劑和試驗方法：A1.1.1革蘭氏染色：A1.1.1.1涂片、火焰固定。A1.1.1.2草酸銨結晶紫染1min。草酸銨結晶紫染液的配制：溶液A：結晶紫2g，95%酒精20mL，溶液B：草酸銨0.8g，蒸餾水80mL。將A、B溶液混合，用濾紙過濾后即可使用。A1.1.1.3自來水沖洗。A1.1.1.4加碘液覆蓋涂面染約1min。A1.1.1.5水洗，用吸水紙吸去水分。A1.1.1.6加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20s后水洗，吸去水分。A1.1.1.7沙黃液（稀）染2min后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。革蘭氏陽性菌染色為藍紫色，革蘭氏陰性菌染色為紅色。A1.1.2觸酶試驗取槽置于潔凈的試管內或玻片上，然后加3%過氧化氫數滴；或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細菌培養物中，立即觀察結果。有大量氣泡產生者為陽性，無則為陰性。A1.1.3血漿凝固酶試驗吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌浸液肉湯24h培養物充分混勻，置36±1℃培養，每隔半小時觀察一次，連續觀察6h，出現凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。8DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄A1.2乳樣的采集選取出現臨床癥狀（或者懷疑為隱性乳房炎）乳房炎奶牛，先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭2～3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣5mL于無菌乳樣杯中，待檢。A1.3病原菌的分離培養初步診斷：將少量乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如發現圓球形革蘭氏陽性細菌可懷疑為葡萄球菌。分離培養：將乳樣搖勻，分別取適量接種于營養肉湯（10%血清）、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂培養基（平板）后，置于37℃溫箱培養24～48h。觀察每個平板中細菌生長的情況，記錄菌落生長表現。普通瓊脂平板上，37℃,24～72h培養后，可見到濕潤、光滑、隆起的圓形金黃色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢（鏡檢呈葡萄狀排列，無芽孢、莢膜，直徑0.5～1μm，革蘭氏染色陽性），并挑取單個可疑菌落移植于肉湯和斜面培養基，經37℃培養24～48h。24h后沒有長菌的平板，再用相應的增菌肉湯涂劃一次，繼續培養，24～48h后，再作檢查，以防漏檢。將剩余的乳樣存放于4℃冰箱內備用。營養肉湯中呈渾濁生長，管底有少量灰白色沉淀；血液瓊脂平板中菌落較大，呈金黃色、圓形，周圍出現明顯的β–溶血。A1.4生化鑒定觸酶試驗：觸酶陽性。血漿凝固酶試驗：凝固酶試驗陽性。糖發酵試驗：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖。色素產生情況：能產生金黃色色素。A1.5毒力試驗將上述經過生化試驗鑒定的細菌懸液用滅菌生理鹽水作適當稀釋，對隨機分組的小鼠進行腹腔注射接種，接種量為0.5mL/只（家兔皮下接種1.0mL或者靜脈接種0.1～0.5mL），能夠致死動物或者內臟出現膿腫可以確定有毒力。A1.6病原菌的重分離試驗9DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄對接種后發病、死亡小鼠（家兔）的肝臟進行病原菌重分離。進行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查，觀察所分離菌株是否為原接種菌。如果是則進一步確定病原菌為金黃色葡萄球菌。A2.鏈球菌的檢驗引起臨床型乳房炎或者隱性乳房炎的鏈球菌常見的有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌以及乳房鏈球菌。A2.1主要試劑和試驗方法CAMP試驗：在血瓊脂平板上用金黃色葡萄球菌培養物劃一條直線，然后將鏈球菌培養物劃一條線，與金黃色葡萄球菌培養物的劃線相互垂直，但不要接觸，二者相距3～5mm，各鏈球菌分離菌劃線間距10~20mm。置37℃溫箱內培養24h后觀察結果。在兩劃線交界處出現箭頭樣的溶血區為陽性。A2.2乳樣的采集選取出現臨床癥狀（或者懷疑為隱性乳房炎）乳房炎奶牛，先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭2～3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣5mL于無菌乳樣杯中，待檢。A2.3病原菌的分離培養初步診斷：將少量乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如發現圓球形革蘭氏陽性細菌可懷疑為鏈球菌。分離培養：將乳樣搖勻，分別取適量接種于營養肉湯（10%血清）、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂培養基（平板）后，置于37℃溫箱培養24～48h。觀察每個平板中細菌生長的情況，記錄菌落生長表現。普通瓊脂平板上，37℃,24～72h培養后，未見到菌落。鮮血瓊脂平板上長有灰白色、半透明表面光滑圓形隆起的小菌落，出現溶血現象，如果是β溶血則疑為無乳鏈球菌，如果為α溶血，疑為停乳鏈球菌或者乳房鏈球菌，如為溶血，則疑為乳房鏈球菌。血清肉湯中生長初呈均勻渾濁，管底出現絮狀沉淀，上清變得透明。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢，鏡檢如呈球狀，短鏈狀或者長鏈狀排列，無芽孢、莢膜，革蘭氏染色陽性則疑為鏈球菌。A2.4生化鑒定DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄鏡檢形態符合鏈球菌特性，且觸酶試驗陰性細菌，即鑒定為鏈球菌屬細菌。若細菌CAMP試驗陽性，不水解七葉苷和馬尿酸鈉，即鑒定為無乳鏈球菌；若細菌CAMP試驗陰性，不水解七葉苷和馬尿酸鈉，即鑒定為停乳鏈球菌；若細菌CAMP試驗陰性，水解七葉苷和馬尿酸鈉，即鑒定為乳房鏈球菌。A2.5動物試驗對實驗動物，只有停乳鏈球菌具有致病性，將其18h血清肉湯培養物0.5mL注入小白鼠腹腔，或給家兔靜脈接種1～2mL，可使動物在1周內死亡。對接種后發病、死亡小鼠（家兔）的肝臟進行病原菌重分離。進行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查，觀察所分離菌株是否為原接種菌。如果是則進一步確定病原菌為停乳鏈球菌。其他兩種鏈球菌并不能使試驗動物致死。DB!FORMTEXT21丄!FORMTEXTXXXXX丄—!FORMTEXTXXXX丄（資料性）奶牛乳房炎治療診斷方法B1.乳汁體細胞計數法推薦使用體細胞計數儀進行乳汁體細胞計數。體細胞計數法有直接計數法和間接計數法。直接計數法中簡便易行的方法是直接用顯微鏡進行體細胞計數（SCC），間接計數法就是后面提到的CMT法。B1.1主要試劑和材料美藍染色液：美藍乙醇飽和溶液30mL（美藍2g，95%乙醇100mL），10%氫氧化鈉溶液0.1mL，蒸餾水100mL，將上列溶液混合搖勻，過濾后備用。二甲苯、95%乙醇。生物顯微鏡、載玻片、10μL微量加樣器（或移液槍）等。B1.2操作方法B1.2.1涂片制備涂布：充分搖勻新鮮乳樣，用10μL微量加樣器吸取中部乳汁10μL，或用接種環蘸取等量的乳汁，將乳樣滴于玻片一端中側，仔細涂布成約1cm2面積的乳膜（為便于操作，可在玻片下墊襯一張硬紙板，紙板上用毛筆劃數個面積為1cm2的方格透視）。干燥、脫脂、固定：涂好乳膜的玻片于37℃溫箱中干燥，然后用二甲苯脫脂5min，再置95%乙醇中固定5～10min。染色：玻片干燥后，用美藍染色液染色5min。水洗，再用95%乙醇脫色數分鐘，水洗干燥后鏡檢。鏡檢及計數：在生物顯微鏡油鏡下觀察（最好用10×目鏡，其視野直徑