細菌內毒素檢查在藥品生產質控上的應用馮聚錦湛江安度斯生物有限責任公司2022年3月第二稿第一頁，共三十九頁。://zacb2一、鱟試驗對藥品生產質控的意義藥品生產企業實施GMP的意義在于使人們對藥品質量的控制從傳統的成品檢驗，上升到對藥品生產全過程進行有效監控的現代質量管理模式。美國食品及藥物監督管理局〔FDA〕自2004年起大力推行“過程分析技術〞(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)，更凸顯了醫藥興旺國家對藥品生產過程質控的高度重視。2025/2/27第二頁，共三十九頁。://zacb3在醫藥工業的GMP條件下，“熱原就是內毒素，控制內毒素就控制了熱原〞已成為共識。基于這種認識，許多國家的藥典已由細菌內毒素檢查項取代熱原檢查項并且成為了開展的趨勢，將會有越來越多的藥典品種使用鱟試劑檢查。不僅如此，鱟試驗法在醫藥工業上目前是注射藥品生產質控的最好方法，它為眾多的藥品生產企業帶來顯著的經濟效益。第三頁，共三十九頁。://zacb4

中國和美國是世界上應用鱟試劑最早的國家，也是鱟試劑產量及用量最多的國家。盡管如此，兩國在鱟試劑應用的水平、程度及范圍上仍有明顯的差異。中國藥典2005年版收載的BET品種有160多種，而USP收載的BET品種超過700種。2025/2/2770%＜30%生產質控應用領域的比較30%3%30%25%42%美國＞70%—

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—5%＞90%中國終產品檢驗終點顯色動態顯色動態濁度凝膠法方法學應用的比較在醫藥興旺國家，一個注射藥品生產體系的建立或GMP認證，都要求在生產質控上應用鱟試驗方法。我國目前的GMP認證還沒有這方面的要求，應該說是個缺陷，但開展趨勢必然會補充相應的要求。第四頁，共三十九頁。://zacb5二、生產質控的根本特點及要求按控制的時機分類：事前控制：對正在生產的產品質量控制有效；事后控制：對正在生產的產品質量控制無效，只對以后生產的產品質量控制有效。按控制的方式分類：靜態控制：對已完成的生產工序的質控無效，只對以后的生產工序的質控有效；動態控制：對正在進行或將要進行的生產工序的質控有效。2025/2/27第五頁，共三十九頁。://zacb62025/2/27生產質控對檢驗方法的要求采樣方便、微量操作簡單、快速檢查準確、靈敏結果可靠，數據處理自動化鱟試驗法目前是滿足藥品生產質控的最好方法鱟試驗的優點：采樣方便、微量：0.1~1ml操作簡便、快速：7~60分鐘靈敏、準確：最低可測0.001EU/mL的內毒素含量，定量檢測的范圍可涵蓋0.001~1,000EU/mL。技術成熟，自動化程度高鱟試驗是目前能使藥品生產的熱原控制實現動態監控和事前控制的唯一方法。第六頁，共三十九頁。://zacb7三、藥品生產過程內毒素的控制方法內毒素監控體系〔1〕監控對象重要的媒體及原料水是制藥工業最重要的媒體，是首要的監控對象使用量大的原料生產過程添加的各種輔劑與中間體接觸的各種用具、器皿及終產品的包裝容器2025/2/27第七頁，共三十九頁。://zacb8各工序前后中間體內毒素水平的變化

至少在生產過程的重要工序之間要設置檢測點，例 如在除熱原工序后設置檢測點，檢測該工序除熱原〔干烤、過濾、吸附〕的效果。又如在分裝工序前需抽檢，確保中間體內毒素水平不超出控制水平才進行分裝。烘箱等除熱原設備的驗證2025/2/27第八頁，共三十九頁。://zacb9生產原料生產用具、容器入庫清洗、除熱原備用工序1原料分裝輔劑工序2工序3終成品入庫水輔劑Δ1Δ2Δ3Δ6Δ8Δ4Δ5Δ7Δ9Δ10鱟試驗檢查Δ1Δ2Δ3Δ內毒素檢測點

工序運行路線

取樣 檢測結果反響2025/2/27〔2〕藥品生產過程細菌內毒素監控體系第九頁，共三十九頁。://zacb10建立內毒素監控體系的步驟確定藥品的內毒素限值L；分析藥品生產過程，合理設置內毒素監測點；制定各監測點合理的內毒素控制水平Lx；進行干擾性驗證試驗確定各監測點樣品的有效濃度或有效稀釋范圍，選擇所用鱟試劑的靈敏度。進行日常的內毒素監測檢查。2025/2/27第十頁，共三十九頁。://zacb11內毒素控制限值確實定如果終產品的內毒素限值為L，各監測點的內毒素控制水平為LX，那么LX＜L。某些原料或中間體在其后的生產工序中將要被稀釋，計算其稀釋后的內毒素含量ED，如果ED＜1/4L，可以允許該原料或中間體的內毒素控制水平LX＞L。例如，某種主要原料在生產時將要被稀釋10倍使用，如果L為0.5EU/ml，可以允許該原料的內毒素控制水平LX1.25EU/ml。2025/2/27第十一頁，共三十九頁。://zacb12

如果能確實保證在除熱原工序后的中間體的內毒素含量少于1/4L，可允許該工序前的LX適當大于L。在制定各監控點LX時，應注意熱原具有積累性。制藥企業需要根據自身的生產條件及工藝水平來制定合理的LX值。在歐美通常以1/10L~1/4L作為LX。2025/2/27第十二頁，共三十九頁。://zacb13

千萬不要以藥典的內毒素限值作為控制值

據了解，不少企業的質檢人員以藥典給出的該品種的內毒素限值作為產品質量的控制值或者作為產品出廠放行的合格值。這種做法其實不好，原因如下：

〔1〕藥典給出的藥品的內毒素限值是對藥品質量的最低要求。任何有一定質量能力的企業都不應以這最低的要求作為自己產品的標準。

〔2〕細菌內毒素檢查是一項生物檢查，有較寬的精確范圍。特別是凝膠法鱟試驗，精確度只有值的50~200%，當產品的內毒素含量值接近限值時，很容易出現結果的不確定性。

〔3〕理想的產品放行值應≤1/4藥典限值。2025/2/27第十三頁，共三十九頁。://zacb14各監控點樣品的干擾驗證目的：找出每個監測點的供試品的無干擾濃度抽取監測點的適量樣品選擇凝膠法鱟試劑的靈敏度或定量鱟試劑的標準曲線范圍；計算檢測樣品的最大有效稀釋倍數MVD樣品與鱟試劑相容性的初篩試驗；樣品與鱟試劑的干擾試驗2025/2/27第十四頁，共三十九頁。://zacb15干擾驗證舉例〔凝膠法〕：

某生物制品在冷凍枯燥前的分裝液〔S〕為120mg/ml,Lx<0.05EU/mg(L<0.2Eu/mg)。1〕Ls<0.05Eu/mg×120mg/ml＝6.0Eu/ml；2〕假設選用λ=0.125Eu/ml的TAL，最大有效稀釋；

第十五頁，共三十九頁。://zacb163〕取分裝液(S)用BET水作1:48倍稀釋，得供試液〔S48〕；4〕取λ=0.125Eu/ml的TAL對S48作干擾試驗；5〕如果干擾試驗結果說明S48對BET無干擾，就把這個濃度定為S的日常監測濃度，即每批產品分裝前，取S稀釋成S48，用λ=0.125EU/mL的TAL作檢查。如果檢查結果為陽性，說明S的內毒素含量超標〔≥0.05Eu/mg〕，不能進入分裝凍干工序；如果檢查結果為陰性，S可進行分裝凍干。第十六頁，共三十九頁。://zacb17生產過程細菌內毒素監控的常規檢查采樣把樣品制備成供試液〔如前S48〕鱟試驗檢查結果分析將信息反響至生產控制系統第十七頁，共三十九頁。://zacb18四、細菌內毒素的快速檢測方法鱟試驗在生產質控上應用的方法較靈活，不受藥典法規的限制，既可采用藥典法規接受的鱟試驗方法，也可采用更新更先進的技術和方法。以下介紹幾種有代表性的最新的快速鱟試驗方法。細菌內毒素快速檢測試劑盒湛江安度斯公司的創造專利屬于凝膠法原理：使用高靈敏度的試劑作低靈敏度使用反響時間只需20-25分鐘操作方便、簡單用途：生產過程細菌內毒素的限量快速檢測2025/2/27第十八頁，共三十九頁。://zacb19特點：使用方便

快速檢測盒內配置與國際使用接軌的單次試驗鱟試劑〔TAL〕。使用這種單次試驗TAL時，直接加0.2ml樣品復溶試劑兼檢測，不必象使用0.1ml/支TAL那樣要先加0.1ml的水復溶試劑，然后再加0.1ml樣品檢測。第十九頁，共三十九頁。://zacb20同一試劑盒有多個靈敏度供選擇

在每一批號的快速檢測試劑盒上都標示有至少兩個可供選擇的靈敏度。使用時選擇不同的靈敏度(λ0)對應有不同的反響時間(T0)。如批號為0809082的快速檢測試劑盒，靈敏度標示如下：λ0T00.25EU/mL20±1分鐘0.125EU/mL25±1分鐘第二十頁，共三十九頁。://zacb21CSE無需稀釋

我們知道，作鱟試驗最繁瑣耗時的操作就是稀釋標準內毒素〔CSE〕。快速檢測試劑盒配備了無需稀釋一步到位的CSE，使實驗真正快速方便。配套器具，得心應手

作快速鱟試驗時，如果配合使用安度斯公司提供的可調移液器、采樣瓶、可定時的干式恒溫儀等實驗器具，可真正體會到BET實驗的快速、準確及方便。第二十一頁，共三十九頁。://zacb22名稱規格數量鱟試劑（TAL）0.2ml/支λ：0.125EU/ml/0.25EU/ml8支工作標準內毒素（CSE）5EU/支1支BET水2ml/支1支

試劑盒組成第二十二頁，共三十九頁。://zacb23使用方法：〔λ=0.125EU/mL〕檢查項目反應管數每管加樣陰性對照（溶液D）20.2mLBET水陽性對照（溶液C）20.2mLBET水+0.01mLE5供試品陽性對照（溶液B）20.2mLS+0.01mLE5

供試品（溶液A）20.2mLS第二十三頁，共三十九頁。://zacb24光度法定性快速檢測法屬動態濁度或動態顯色法需要使用動態光度儀及相應軟件方法及步驟1〕確定供試品原液〔S0〕的內毒素限值〔L或Lx〕2〕確定供試品無干擾濃度，如S83〕制備不含可測內毒素的供試品S84〕制備含L8濃度標準內毒素的陽性供試品S8L82025/2/27

第二十四頁，共三十九頁。://zacb255〕在日常監測時，以S8L8與TAL反響的時間T0作為判斷其它供試品內毒素含量的標準：但凡反響時間T<T0的供試品，其內毒素含量>L8，即原液S0的內毒素含量>L但凡反響時間T>T0的供試品，其內毒素含量<L8，即原液S0的內毒素含量<L；只需供試品的動態曲線一到達預設光度值，即可知道該供試品是否合格。甚至分析供試品動態曲線的走勢就可知道供試品是否合格。2025/2/27預設透光度值S8L8產品不合格產品合格T1T0

T2S8NC100%92%RtT(秒)第二十五頁，共三十九頁。://zacb26光度法定量快速檢測法屬動態濁度法或動態顯色法需要使用安度斯軟件“生物探針-2002〞方法及步驟

1〕預先用標準內毒素與TAL反響制備一條標準曲線，存檔。最理想的標準曲線是用同體系模型法建立〔參閱本公司講義2005年3月版〕；

2〕檢測開始前調出存檔標準曲線

3〕反響開始后，只要各供試品的動態曲線一到達預設光度值，界面上的表格中立即顯示出該供試品的內毒素含量2025/2/27第二十六頁，共三十九頁。://zacb27供試品內毒素含量調用的標準曲線2025/2/27第二十七頁，共三十九頁。://zacb28本卷須知制備存檔標準曲線的TAL必須與檢測試劑相同；供試品應在無干擾濃度且不超過MVD濃度內檢測。2025/2/27第二十八頁，共三十九頁。://zacb294、便攜式檢測系統——PTS

PTS是美國查爾斯河實驗室公司(CharlesRiverLaboratories,Inc.)最新推出的生物分析系統

PTS是一種便攜式、可現場使用、快速、定量的檢測系統。細菌內毒素的定量快速檢測僅是PTS的功能之一，其它生物測定的功能正在陸續推出。第二十九頁，共三十九頁。://zacb30PTS是由便攜式光度儀和檢測試劑卡兩局部組成。第三十頁，共三十九頁。://zacb31技術原理——動態顯色法鱟試驗每塊試劑卡中有四條反響通道如下：系統內置存檔標準曲線，儀器自動測定吸光度及進行數據處理。供試品

陽性對照

通道(2條)加樣孔LAL顯色底物CSE反應池抽吸孔供試品

檢查通道

〔2條〕第三十一頁，共三十九頁。://zacb32實驗方法開啟儀器預熱至37℃插入試劑卡在試劑卡的四個加樣孔中各參加25l(0.025ml)供試品溶液按“檢測〞鍵〔Enter〕約7~15分鐘后屏幕上顯示如下檢測結果：回收率：？供試品含量：？EU/mL變異系數：CV=?%第三十二頁，共三十九頁。://zacb33PTS的特點使用極靈敏可靠的鱟試驗技術獲得美國FDA認證體積小巧，僅1公斤重，內置電源，可在任何現場使用7-15分鐘可獲得定量的檢測結果只需極簡單的操作：插入檢測卡片→參加樣品→自動檢測并顯示檢測結果第三十三頁，共三十九頁。://zacb34無需用戶建立標準曲線無外部恒溫孵育要求檢測范圍：10-0.1EUmL