CR及質粒提取CR和質粒提取是分子生物學實驗中常見的技術。CR是指限制性內切酶，可以識別特定的DNA序列并將其切割，而質粒提取則是從細菌中分離出質粒DNA的過程。這兩項技術在基因克隆、基因工程等領域具有重要的應用價值。課程目的掌握基因工程基本理論深入理解基因工程的核心概念，包括基因克隆、基因表達和基因編輯等。熟練掌握CRISPR-Cas9基因編輯技術了解CRISPR-Cas9系統的原理，并掌握其在基因編輯實驗中的應用。學習質粒提取和轉化技術掌握質粒提取和轉化操作流程，并能夠獨立進行實驗。提升實驗操作技能培養嚴謹的實驗態度，提高實驗設計和數據分析能力。基因工程概覽基因工程是一門利用生物技術對基因進行改造和操作的學科。它涉及對基因的克隆、表達、修飾和轉移等操作。基因工程在生物制藥、農業、環境保護等領域有著廣泛的應用。基因工程的應用主要集中在以下幾個方面：生產藥物和疫苗，提高農作物的產量和品質，培育抗病蟲害的作物，改善環境污染等。基因工程中的重要概念限制性內切酶識別特定DNA序列，并在這些序列中切割DNA。DNA連接酶將DNA片段連接在一起，形成新的DNA分子。載體將外源基因傳遞到宿主細胞中的工具，例如質粒或病毒。克隆將特定基因復制并擴增，以獲得大量相同的基因拷貝。什么是質粒小型環狀DNA存在于細菌等微生物中，獨立于染色體之外。復制能力能夠自主復制，并且在宿主細胞中穩定遺傳。攜帶基因可以攜帶特定的基因，例如抗生素抗性基因，可以表達并賦予細菌特定功能。基因工程應用在基因工程中，質粒可作為載體，將目的基因導入受體細胞。質粒的結構質粒是細菌染色體外的環狀DNA分子。典型質粒包含復制起點（ori）、選擇標記（抗生素抗性基因）和多克隆位點（MCS），MCS用于插入外源基因。質粒的特點11.自復制質粒能夠獨立于宿主染色體進行自我復制，確保每個子代細菌都繼承一個拷貝的質粒。22.穩定遺傳質粒能夠穩定地遺傳給子代細菌，確保遺傳信息的持久保存。33.可轉移一些質粒可以從一個細菌轉移到另一個細菌，有利于基因的傳播和擴散。44.可切割質粒的DNA可以被限制性內切酶切割，方便基因的插入和構建重組質粒。質粒的作用基因克隆載體質粒可作為基因克隆載體，將目的基因插入質粒，實現基因的復制和表達。蛋白表達載體質粒可作為蛋白表達載體，控制目的基因的表達，進行蛋白生產和研究。抗生素抗性基因質粒可攜帶抗生素抗性基因，用于篩選含有質粒的細菌，方便克隆操作。熒光蛋白表達載體質粒可攜帶熒光蛋白基因，用于構建熒光標記細胞，便于觀察和研究細胞活動。質粒的獲取途徑購買從專業的生物試劑公司購買現成的質粒，方便快捷，但也可能存在價格昂貴和質量不穩定的問題。提取從已有的菌株中提取質粒，可以節省成本，但也需要掌握相應的技術和設備。構建根據研究需要，構建新的質粒，需要使用分子克隆技術，涉及到基因的連接、酶切、連接等操作。感受態細胞的制備1準備細菌選擇合適的菌株，如大腸桿菌2培養細菌在合適的培養基中培養至對數生長期3處理細菌用CaCl2溶液處理，使細胞膜變得更透性4冰浴保存將處理后的細菌置于冰浴中，保持其活性感受態細胞是指細菌在特殊處理后，細胞膜變得更容易接受外源DNA的細胞。通過制備感受態細胞，可以提高基因轉化的效率。感受態細胞與外源DNA的結合感受態細胞是指經特殊處理，使其細胞壁和細胞膜的通透性增加，能夠攝取外源DNA的細菌細胞。當感受態細胞與外源DNA混合后，外源DNA可以通過細胞壁和細胞膜進入細胞內部。1DNA結合外源DNA與感受態細胞表面的受體蛋白結合2細胞膜穿透DNA通過細胞膜上的孔隙進入細胞質3整合到染色體外源DNA整合到細菌染色體上4復制擴增外源DNA在細菌體內復制擴增熱休克法轉化原理1感受態細胞感受態細胞是經過特殊處理的細菌細胞，能夠吸收外源DNA。2冰浴將感受態細胞與外源DNA混合后，在冰浴中短暫孵育，使DNA結合到細胞表面。3熱休克將冰浴后的混合物轉移至42℃水浴中，短暫熱休克，促進DNA進入細胞內部。4恢復熱休克后，將混合物轉移至冰浴中恢復，使細胞恢復正常生理狀態。5培養將轉化后的細胞涂布于含有抗生素的培養基上，只有成功轉化的細胞才能在抗生素存在下生長繁殖。熱休克法轉化操作步驟準備感受態細胞將感受態細胞置于冰上解凍，確保細胞活性。加入外源DNA將已準備好的外源DNA加入到感受態細胞中，輕柔混合，避免過度震蕩。熱休克處理將混合物轉移到42℃水浴中，進行短暫的熱休克處理，促進DNA進入細胞。恢復培養將熱休克后的細胞轉移到冰上，加入培養基，在37℃培養箱中培養，使細胞恢復生長，表達外源基因。電穿孔法轉化原理1細胞膜電穿孔在高壓電場作用下，細胞膜發生短暫的穿孔，形成可逆的通透性改變。2DNA進入細胞外源DNA通過穿孔的細胞膜進入細胞內部，與細胞染色體結合，并整合到宿主細胞基因組中。3細胞修復電穿孔后，細胞膜迅速修復，恢復正常功能，并開始表達外源基因。電穿孔法轉化操作步驟1準備制備感受態細胞，配制電穿孔緩沖液。2混合將感受態細胞與外源DNA混合。3電穿孔將混合物置于電穿孔儀中進行電脈沖處理。4恢復電穿孔后，將細胞置于恢復培養基中恢復。5涂板將恢復后的細胞涂布于含有抗生素的培養基上。電穿孔法是將外源DNA導入細菌細胞的一種高效方法。通過電脈沖處理，細胞膜暫時變為通透，允許外源DNA進入。電穿孔法比傳統的熱休克法效率更高，但操作步驟更為復雜，需要嚴格控制溫度、電壓和時間等參數。質粒提取技術概述1分離純化從宿主細胞中分離出質粒，并去除細胞碎片和污染物。2去除雜質去除宿主細胞中蛋白質、RNA和其他雜質，獲得高純度的質粒。3濃縮定量濃縮質粒DNA，并進行定量分析，以便后續實驗使用。堿裂解法提取質粒1細菌裂解利用堿性溶液破壞細菌細胞壁和細胞膜2質粒分離利用離心分離質粒DNA和細菌染色體DNA3質粒沉淀利用乙醇沉淀純化質粒DNA4質粒溶解將質粒DNA溶解于緩沖液中堿裂解法是一種簡單高效的質粒提取方法，廣泛應用于分子生物學研究。該方法利用堿性溶液破壞細菌細胞，使質粒DNA與細菌染色體DNA分離，然后利用乙醇沉淀純化質粒DNA。堿裂解法提取質粒步驟細菌培養將含有質粒的細菌在合適的培養基中培養，使其達到對數生長期。收集細菌通過離心將細菌沉淀下來，去除培養基。溶解細菌使用溶液Ⅰ將細菌細胞壁和細胞膜溶解，釋放出細胞內物質，包括質粒DNA。堿裂解使用溶液Ⅱ，使細菌的染色體DNA變性，而質粒DNA保持環狀結構。中和使用溶液Ⅲ中和堿性溶液，使染色體DNA重新折疊成不溶性狀態，而質粒DNA則保持溶解狀態。離心通過離心去除不溶性的染色體DNA，留下上清液，其中含有質粒DNA。乙醇沉淀使用乙醇將質粒DNA從溶液中沉淀下來，并通過離心收集。洗滌用70%的乙醇洗滌沉淀的質粒DNA，去除殘留的鹽和其他雜質。干燥將質粒DNA沉淀干燥，去除殘留的乙醇。溶解將干燥的質粒DNA溶解在合適的緩沖液中，即可獲得純化的質粒DNA。純化質粒的方法柱層析法利用不同物質在層析介質上的吸附能力差異，分離純化質粒。超速離心法利用不同分子大小和密度的差異，通過高速離心分離純化質粒。凝膠電泳法利用電場中帶電分子的遷移速度差異，分離純化質粒。瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的技術，用于分離和分析不同大小的DNA分子。通過觀察質粒在凝膠中的遷移距離，可以確定其大小和純度。電泳結果可以用于評估質粒提取的效率和質量，還可以幫助分析質粒的完整性。限制性內切酶消化質粒1酶切位點選擇合適的限制性內切酶2酶切反應按照酶切反應條件進行操作3電泳檢測確認酶切是否成功4目標片段提取目標片段進行后續實驗限制性內切酶消化質粒是基因工程中常見的操作，可用于構建重組質粒、分析質粒結構等。電泳分析酶切結果瓊脂糖凝膠電泳將酶切后的質粒樣本加載到凝膠上，并在電場中運行，根據分子大小分離DNA片段。DNA分子量標準使用已知大小的DNA片段作為標準，確定未知片段的大小。結果分析分析電泳結果，確定酶切是否成功，并評估質粒的完整性。蛋白酶K消化細菌載體1裂解細菌細胞蛋白酶K是一種廣譜蛋白酶，能夠有效消化細菌細胞中的蛋白質，包括細菌的細胞壁和細胞膜蛋白。2釋放質粒DNA蛋白酶K消化細菌載體后，能夠釋放出質粒DNA，便于后續的質粒提取和純化操作。3提高質粒提取效率通過消化細菌細胞中的蛋白質，能夠減少提取過程中對質粒DNA的干擾，提高質粒提取的效率和純度。乙醇沉淀法濃縮質粒添加乙醇在提取的質粒溶液中加入適量的無水乙醇，使乙醇濃度達到70%左右，使質粒DNA從溶液中析出。低溫沉淀將混合液置于-20℃冰箱中沉淀1小時以上，使質粒DNA沉淀更加完全。離心收集將混合液離心，將沉淀的質粒DNA收集在離心管底部。清洗沉淀用70%的乙醇清洗沉淀，去除殘留的鹽分和雜質，以提高質粒DNA的純度。干燥沉淀將沉淀干燥，去除殘留的乙醇，可使用真空干燥或自然干燥。溶解質粒將干燥的質粒DNA溶解在合適的緩沖液中，例如TE緩沖液，并進行后續實驗或保存。濃縮質粒的定量分析NanoDrop和熒光定量法是兩種常用的方法，用于分析濃縮質粒的濃度。NanoDrop可以提供快速的結果，但對于低濃度的樣本可能不太準確。熒光定量法更加靈敏，但需要使用專門的試劑和儀器。質粒的儲存與保存低溫保存將質粒溶液儲存在-20℃或-80℃的冰箱中，可以有效減緩質粒降解，延長保存時間。避免反復凍融反復凍融會破壞質粒結構，降低其活性，因此應盡量避免。添加甘油添加一定濃度的甘油可以降低溶液冰點，保護質粒在冷凍過程中不被破壞。定期檢測建議定期對保存的質粒進行檢測，確保其質量和活性，以便及時采取措施。質粒轉化效率的影響因素細胞狀態細胞的生長狀態會影響轉化效率。健康、活力的細胞更容易吸收外源DNA。質粒濃度高濃度的質粒能提高轉化效率，因為能增加外源DNA進入細胞的機會。轉化方法不同的轉化方法，如熱休克法或電穿孔法，具有不同的效率。抗生素選擇壓力選擇合適的抗生素濃度可以篩選出成功轉化的細胞，提高轉化效率。質粒提取中的注意事項潔凈操作保持無菌操作，避免污染。試劑準備確保試劑新鮮，避免降解。溫度控制嚴格控制操作溫度，避免降解。操作速度迅速進行操