中國結核病防治規劃

痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊

編委會名單

主審肖東樓王文杰許紹發王黎霞

主編趙雁林劉宇紅姜廣路夏輝尚美

編者（以姓氏拼音為序）

柴琦陳馬秀陳田雄馮苗顧才宏賈衛藍如束李定越李國剛李

國明李輝李琳梁慶福劉潔柳正衛梅建尼瑪彭多潘毓萱錢明

司紅艷蘇云開譚云洪王進鴻王莉王慶王瑞王蘇民楊修軍楊

丹丹袁薇張學志趙德福周楊

前百

為加強我國結核病實驗室網絡建設，提高各級痰涂片實驗室工作質量，我國

自2004年引入并全面推行了世界衛生組織(WHO)推薦的“結核病實驗室痰涂片

檢查室間質量保證指南”，并出版印刷了第一版《中國結核病防治規劃?痰涂片

鏡檢質量保證手冊》(以下簡稱“手冊”)。

在使用新的痰涂片鏡檢質量保證方法的實踐中，我們積累了經驗，也發現了

一些問題；同時，隨著我國結核病控制一些新技術策略的出臺，現行“手冊”需

要進行相應的修改和補充。為此，我們廣泛征求了各省專家意見，并進行多次討

論，為了更準確地描述本手冊涵蓋的內容，經2008年省級參比室工作會議決定，

將本手冊命名為《中國結核病防治規劃?痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手

冊》。

本手冊包括了第一版的大部分內容：結核病痰涂片檢查的標準化操作、我國

結核病實驗室網絡中各級實驗室在痰涂片鏡檢質量保證中的職責、實驗室質量控

制及評估的具體方法，并附有統一的表格，供各省(自治區、直轄市)、地市、

縣區、鄉鎮衛生院以及各醫療機構從事結核病痰涂片檢查的實驗室遵照執行。

本手冊在修訂和出版過程中，得到了香港跨國結核病參比實驗室甘啟文主任

(Dr.KaiManKAM)、WHO顧問金尚才教授(Dr.SangJaeKIM)以及WHO駐中國

代表處醫學官員海妮女士(Dr.CorneliaHennig)的大力支持和幫助，謹表謝意。

編委會

2008年10月

前言3

第一章緒論6

第二章痰涂片顯微鏡檢查標準化操作7

第一節痰涂片檢查的目的及優勢..................................................7

一、診斷傳染性肺結核.........................................................7

二、評價化療效果.............................................................7

三、為流行病學疫情評價服務..................................................7

第二節痰涂片檢查對象...........................................................8

一、確定診斷.................................................................8

二、療效評價.................................................................8

第三節痰標本的采集.............................................................9

一、采集痰標本的容器.........................................................9

二、痰標本的采集時間和采集次數..............................................9

三、對就診者的留痰宣傳教育..................................................9

四、采集痰標本地點..........................................................10

五、痰標本評價..............................................................10

第四節直接涂片抗酸染色顯微鏡檢查標準化操作程序..............................11

一、萋爾原尼爾遜染色顯微鏡檢查法（Ziehl-Neelson,簡稱萋尼染色法）..........11

二、熒光染色顯微鏡檢查法....................................................14

三、玻片的保存..............................................................15

四、抗酸菌痰檢注意事項......................................................15

第五節顯微鏡的使用、維護和保養................................................17

一、一般原則.................................................................17

二、日常維護.................................................................18

三、維修和保養..............................................................18

第六節試劑和材料..............................................................19

第三章痰涂片顯微鏡檢查質量保證20

第一節實驗室網絡及職能........................................................20

一、結核病實驗室網絡....................................................20

二、質量保證體系中各級實驗室職能...........................................21

第二節室內質量控制............................................................22

一、痰標本收集..............................................................22

二、抗酸染色液制備..........................................................23

三、涂片制備................................................................23

四、染色.....................................................................23

五、鏡檢.....................................................................24

六、登記報告................................................................24

七、痰涂片保存..............................................................24

第三節室間質量評估..........................................................25

一、現場評價................................................................25

二、盲法復檢................................................................26

=、批量測試................................................................36

第四章報表39

一、盲法復檢結果上報.......................................................39

二、實驗室基本情況上報.....................................................40

參考文獻43

附件45

附件1、結核病細菌學實驗室登記本.............................................45

附件2、痰涂片鏡檢檢驗........................................................47

附件3、染色劑配制、保存......................................................49

附件4、結核病實驗室痰涂片鏡檢督導清單....................................51

附件5、督導報告參考模式......................................................57

附件6、盲法復檢涂片抽取舉例.................................................59

附件7、術語注釋..............................................................62

第一章概論

在結核病控制工作中，通過實驗室細菌學檢查診斷傳染性肺結核是DOTS策

略的重要要素之一，痰結核菌檢查對于發現傳染源、確定診斷和化療方案、考核

療效、評價防治效果具有重要意義。因此，結核病細菌學檢查是國家結核病防治

規戈ij(NationalTuberculosisProgramme,NTP)的重要組成部分，在現代結核

病控制工作中起著不可缺少的重要作用。

為了進一步加強結核病細菌學實驗室質量控制，實現全國結核病控制規劃目

標，必須具備完善、有效的結核病實驗室網絡，實驗室必須能夠提供準確可信的

試驗結果，并且符合成本一效益原則。為此，只有通過實施有效的質量保證

(QualityAssurance,QA)才能實現。完善的實驗室質量保證系統依賴于國家

結核病防治規劃對各級實驗室工作的支持、培訓和監督，并在具體實施過程中逐

步完善。

本手冊目的是提供標準化操作程序，為評估實驗室工作的質量和結果的可靠

性提供指南和方法。需要指出的是應用這些方法井不是為了校正每個病人的診斷

正確與否，而是為了發現實驗室工作中可能存在的問題并提出相應的解決方案和

措施，從而確保整個實驗室診斷服務的質量。

第二章痰涂片顯微鏡檢查標準化操作

一、痰涂片檢查的目的及優勢

在當前國家結核病防治規劃的框架下，通過痰涂片顯微鏡方法檢杳抗酸桿菌

(acid-fastbacilli,AFB)的目的是:

(-)診斷傳染性肺結核

結核病的控制是以發現和控制傳染源為主，用痰涂片AFB陽性的肺結核患者

是社會上最主要的傳染源，故痰涂片AFB檢結果對診斷傳染性肺結核是一項重要

指標。

(二)評價化療效果

結核病是由結核分枝桿菌引起的，現行化療方案的制定也主要以結核分枝桿

菌的生物學特性為依據，所以對化療效果的評價，也將細菌學檢查結果作為根據。

(三)為流行病學疫情評價服務

由于傳染性結核病在流行病學中有著特殊的意義，因此，在反映某一國家或

地區結核病疫情的嚴重程度的指標中，涂陽患病率、涂陽發病率被更多關注。

根據世界衛生組織((WorldHealthOrganization,WHO)和國際防痔及痹部

疾病聯合會(InternationalUnionAgainstTuberculosisandLung

Disease,UNION)針對低收入且結核病疫情嚴重的發展中國家所制定的技術指

南，痰涂片鏡檢是相應國家開展結核病控制項目時非常符合成本效益原則的細菌

學實驗技術。相對于臨床和實驗室經常采用的其它診斷和檢查項目，高質量的痰

涂片鏡檢有其自身特有的優勢：

1、作為診斷手段，對芍染性肺結核的診斷比X線的準確性高；

2、技術相對簡單，容易標準化和完成操作；

3、建立AFB檢查時需設備投入少；

4、檢查成本低，易于接受；

5、從收到標本到報告結果的時間短，能夠滿足臨床診斷的需要；

6、對涂陽患者的治療效果，能夠作出及時和準確的評價。

二、痰涂片檢查對象

根據《中國結核病防治規劃實施工作指南》的有關規定，檢查對象根據檢查

目的分為兩類：確定診斷（發現傳染源）、療效評價（作為確定化療方案和治療

效果評價的指標）。

（一）確定診斷

凡因結核病癥狀求診及轉診的可疑肺結核患者，均應進行痰涂片檢查。確定

診斷的涂片檢查應采集3個合格的痰標本。就診當時在門診留一份“即時痰”標

本，同時給患者2個痰盒，囑患者留取“夜間痰”和“晨痰”，于次日交驗。

（二）療效評價

凡已確診、登記、治療的肺結核患者，在化療期間按照規定應定期查痰：

1、初治涂陽患者在療程強化期末、治療5個月末和繼續期結束時（一般為治療后

的第2、5和6個月）；復治涂陽患者在療程強化期末、治療第5個月末和繼續期結

束時（一般為治療后的第2、5和8個月），分別收集1份晨痰和夜間痰進行涂片檢

查。

2、初、復治涂陽患者在療程強化期結束時，痰菌仍為陽性者，應在治療第3個月

末增加痰涂片檢查1次。

3、確診、登記的涂陰肺結核患者，即使患者因故未接受治療，也應在登記后滿2

個月和6個月時進行痰菌檢查。

三、痰標本的采集

（-）采集痰標本的容器

必須采用可密封的、帶螺旋蓋的容器（圖1）收集痰標本。容器的參考規格

為：直徑4厘米，高度2厘米。痰容器應標明病人姓名、編號（初診病人門診序號

或隨訪病人登記號）、檢查項目和痰標本序號1、2、3（“1”為當日即時痰，“2”

為夜間痰，“3”為次日晨痰）。

***

圖1標本容器

（-）痰標本的采集時間和采集次數

1、根據痰標本采集的時間，可將標本分為三類：

?即時痰：就診時深呼吸后咳出的痰液

?晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液

?夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出的痰液

2、痰標本采集的數量：

?初診患者應收集3份痰標本（當日即時痰、夜間痰、次日晨痰）；

?治療或隨訪患者應按期留取2份標本（晨痰、夜間痰）。

進行AFB檢查的醫療機構應提供符合要求的并作了標記的痰盒給患者。

三、對就診者的留痰宣傳教育

對疑似肺結核病者，臨床醫護人員應通過解釋，使其充分了解標本質量:對涂

片顯微鏡檢查的重要性，示范并指導其掌握從肺部深處咳痰的方法；還要告知患

者獲得理想的痰標本有時需要反復數次才能獲得。如患者識字，可提供宣教材料。

正確地收集痰液的方法：

1、深吸氣2-3次，每次用力呼出。

2、從肺部深處咳出。

3、將打開蓋的痰盒靠近嘴邊收集痰液。

4、擰緊盒蓋。

注：如果患者剛吃過東西，應先用清水漱口。裝有義齒的患者在留取痰標本之前

應先將義齒取出。

四、采集痰標本地點

當患者咳嗽、咳痰時，易產生含有結核菌的氣溶膠，感染周邊人群的機率較

高，故采集痰標本時應在遠離人群的開放空間，或通風良好的留痰室內進行。

五、痰標本評價

患者留取的痰標本，應由檢驗人員或經培訓的專人目視檢查標本質量（特別

是用于初次診斷的痰標本）：標本量一般在3?5ml,標本性狀屬于干酪痰、褐

色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰者為合格的標本；痰標本不合格者，應

予以進一步指導并要求其重新送檢。進行細菌學檢查時應在結核病細菌學實驗室

登記本（附件1）和痰涂片鏡檢化驗報告單（附件2）上注明標本性狀，以供分析

結果時參考。

合格的痰標本應是患者深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物。按性狀痰標本

可分為以下幾種：

?干酪痰：標本外觀以黃色（或奶酪色）、膿樣、團塊狀的肺部分泌物為主，

粘度較粘液痰低，制片時較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發現大量膿性炎癥

細胞、肺上皮脫落細胞。由于此類標本是由肺部深處咳出，對肺結核的診斷

最有價值，故AFB的檢出率較高。

?血痰：此類標本是因黏液痰或干酪痰標本中混有血液而形成，顏色為褐色或

深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰

的細胞特征外，含新鮮血液的標本中可見到被染色的血細胞。由于含血標

本易T擾AFB鏡檢的結果，故在制片時應盡量避免挑取含血標本。

?黏液痰：標本外觀以白色、粘稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主，制片時

需仔細涂抹；涂片染色后鏡檢時，鏡下可見支氣管內膜纖毛柱狀上皮細胞（細

胞較長且形態不規則、細胞核和細胞質著色均較深，細胞一端可見著色較淺

的纖毛），伴有少量肺上皮脫落細胞（多數為圓形、細胞核較小且著色較細

胞質深，核質比大于1：3）、膿性炎癥細胞（卵圓形、細胞核占細胞比例較

大且著色較深，核質比低于1：1）、口腔脫落細胞及口腔寄生菌。此類標本

的AFB檢出率較唾液高。

?唾液：目視觀察標本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低的口腔分泌

物為主，標木中有時伴有氣泡；涂片染色鏡檢時，鏡下可見少量口腔上皮脫

落細胞（形態不規則、細胞核著色較細胞質深，核質比接近或大于1：2）和

口腔內寄生菌，有時可見食物殘渣。由于此類標本進行AFB檢查時的檢巴率

很低，是不合格的標本0

四、直接涂片抗酸染色顯微鏡檢查標準化操作程序

（一）萋爾―尼爾遜染色顯微鏡檢查法（ZiehLNeelson,簡稱

萋尼染色法）

1、涂片制備

（1）使用一端有磨砂面的無劃痕的新玻片，經脫脂干燥、清潔后備用；

（2）用2B鉛筆在磨砂面上注明實驗序號及標本序號；

（3）確保玻片上的編號與痰盒上的編號相同。

（4）小心打開承載痰標本的容器，防止產生氣溶膠或使標本外溢。

（5）仔細觀察標本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑

部分約0.05ml,于玻片正面均勻涂抹成10義20mm的卵圓形痰膜（見圖

2）o

（6）痰膜朝上靜置自然干燥后（一般約需要30分鐘）進行染色鏡檢。

（7）為保證檢驗人員的安全，嚴禁在涂抹痰標本的同時對我玻片進行加熱。涂

抹完畢后的痰標本，在結果報告前應暫時保留。

圖2制備好的痰涂片示例

2.染色

（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上的距離；

加熱固定（在5秒鐘內將玻片經過火焰加熱4次）。

（2）滴加石碳酸復紅染液蓋滿玻片，加熱至出現蒸汽后，停止加熱，保持染色

5分鐘。染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續加染色液。

加熱時勿使染色液沸騰。高海拔地區應適當增加加熱次數和染色時間。

（3）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標本上剩余的水。

（4）自痰膜上端外緩滴加脫色劑蓋滿玻片，脫色1分鐘；如有必要，流水洗去

脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為上。

（5）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。

（6）滴加亞甲藍復染液，染色30秒鐘。

（7）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，然后瀝去標本上剩余的水。待玻

片干燥后鏡檢。

（8）一張染色合格的玻片，痰膜肉眼觀為亮藍色，無紅色斑塊。

（9）染色液配制見附件3。

3.顯微鏡檢查

（1）使用10X目鏡雙目顯微鏡讀片。

（2）取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。

（3）首先使用40X物鏡，轉動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調節至適當

亮度，調節焦距至可見細胞形態。

（4）移開40X物鏡，在玻片上滴1?2滴鏡油，使用100X油鏡進行細致觀察。

但應避免油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。

（5）讀片時，首先應從左向右觀察相鄰的視野；當玻片移動至痰膜一端時，縱

向向下轉換一個視野，然后從右向左觀察，依此類推（圖3）。通常20nlm

的痰膜，使用100X油鏡，每橫行約有100個視野。

（6）在淡藍色背景下，抗酸菌呈紅色；其它細菌和細胞呈藍色。

（7）仔細觀察完300個視野，一般需要5分鐘以上；每個工作日，一位鏡檢人

員的玻片閱讀量不要超過25張，且連續閱讀10?12張玻片后，應休息

20分鐘左右。

圖3鏡檢讀片移動方式

4.鏡檢結果報告

（1）結果分級報告標準:

抗酸桿菌陰性：連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌。

抗酸桿菌陽性抗酸桿菌菌數：1?8條/300視野。

抗酸桿菌陽性（1+）：3?9條/100視野,連續觀察300個視野;

抗酸桿菌陽性（2+）：1?9條/10視野，連續觀察100個視野;

抗酸桿菌陽性（34-）：1?9條/I視野;

抗酸桿菌陽性（4+）：210條/I視野。

（2）報告1+時至少觀察300個視野，報告2+至少觀察100個視野，3+、4+時至

少觀察50個視野。

5.分枝桿菌的分類、萋尼氏染色原理及顯微鏡下形態

結核菌的生物分類學名稱為結核分枝桿菌，按照分類學單位一一門、綱、

目、科、屬、種的分類單位，結核菌屬于厚壁菌門、裂殖菌綱、放線菌目、分枝

桿菌科、分枝桿菌屬。通過對細菌所屬的種、屬進行的分類學定義為結核分枝桿

菌。

結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌的生物學性狀、

對大多數抗結核藥物的自然耐受性相近，故將這四種菌統稱為結核分枝桿菌復合

群（M.tuberculosiscomplex,MTC）。臨床上結核病的病原菌多為結核分枝桿菌、

其次為牛分枝桿菌。除去這四種以外的其它分枝桿菌，生物學性狀、對抗結核藥

物的自然耐受性與結核分枝桿菌復合群相差很大，統稱這些菌為非結核分枝桿菌

（Nontuberculosismycobacterium,NTM）,大多數存在于自然環境中,屬于條

件致病菌。

分枝桿菌屬的細菌由于細胞結構和細胞成分的特殊性，具有經堿性染料染

色后，能夠耐受酸性介質脫色的特征，具備相應染色特征的細菌習慣上被稱為抗

酸菌（acid-fastbacillus,AFB）。目前，除結核分枝桿菌以外（臨床上最常見的

分枝桿菌），發現的分枝桿菌種類已達100余種。當然，除分枝桿菌屬的細菌以

外，還有少數細菌具有抗酸染色特征，但抗酸性較弱。

萋尼氏（Z-N）染色法基本原理是：抗酸菌具有耐受酸性介質脫色的生物性

狀。此類細菌在石炭酸（苯酚）的協同作用下，被復紅染色劑著色，能夠耐受酸

性酒精脫色，顯微鏡觀察時保持紅色；而其它脫落細胞或標本中的非抗酸菌被酸

性酒精脫色后，可被復染劑亞甲蘭染為藍色。AFE抗酸染色特性還與菌體細胞結

構的完整性有著密切聯系。

當患者標本直接進行涂片鏡檢時，能夠發現分枝桿菌形態變化較多。結核

分枝桿菌多數為桿狀、稍彎曲；菌體寬度0.3?0.6um；菌體長度不一，在0,5?

8um之間，多數在1.5?3.5um；少數菌體較長者可呈螺旋狀；染色良好的結核分

枝桿菌菌體內，能夠發現著色較深的異染顆粒。含結核分枝桿菌較多的新鮮標本

經萋尼氏染色，100X油鏡觀察，既能發現單個存在的細菌、也能看到聚集成簇

或分枝狀排列的細菌。

（二）熒光染色顯微鏡檢查法

1.涂片制備：同萋一尼染色顯微鏡檢查法。

2.染色

（1）玻片經火焰固定后，滴加染色劑蓋滿玻片，染色30分鐘；流水自玻片一

端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。

（2）痰膜上端外緣滴加脫色劑，垂灑球與，脫色3分鐘或至無色，流水自玻片

一端輕洗，洗去脫色劑。

（3）加復染劑復染1分鐘，瀝去復染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡

檢。

（4）染色液配制方法詳見附件3。

3.顯微鏡檢查

玻片放置在玻片臺上并以卡尺固定后，首先以10X目鏡、20X物鏡進行鏡檢,

發現疑為AFB的熒光桿狀物質，使用40義物鏡確認。在暗背景下，抗酸菌發出黃

色熒光，呈桿狀略彎曲。

4.熒光染色鏡檢結果分級報告標準：

（1）結果分級報告標準：

熒光染色抗酸桿菌陰性（-）：0條/50視野；

熒光染色抗酸桿菌陽性（報告抗酸菌數）：：?9條/50視野；

熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：10?49條/50視野；

熒光染色抗酸桿菌陽性（2+）；1?9條抗酸菌/I視野：

熒光染色抗酸桿菌陽性（3+）：10?99條抗酸菌/I視野；

熒光染色抗酸桿菌陽性（4+）：100條及以上抗酸菌/I視野。

（2）、報告2+至少觀察50個視野，3+及以上的陽性結果至少觀察20個視野。

（三）玻片的保存

萋尼氏染色玻片閱讀完畢后，應及時用擦鏡紙輕輕在涂片上揭取數次，徹底

去除玻片上的鏡油。經脫油、干燥后的玻片，按實驗室序號及涂片編號放置在玻

片盒中，存放在陰涼干燥的環境中避光保存，以備復檢或質控抽檢。

熒光染色的玻片，玻片盒中放置干燥劑后密封放置在4c冰箱避光保存。

熒光染色的涂片進行盲法復檢復核時，應首先將復檢涂片脫色后進行萋尼氏

染色后，重新閱讀。

四、抗酸菌痰檢注意事項

（一）涂片染色鏡檢制備注意事項

1.一張載玻片上只能涂抹一份痰標本。

2.每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次月于AFB涂片檢查。

3.涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透過痰膜看報紙上的5號字時，字跡較模

糊為適宜的厚度；看不見5號字或很清晰，則表明該玻片涂抹過厚或過薄。

4.由于香柏油（cedarwoodoil）能夠溶解復紅染料，使萋尼氏染色褪色，并且

容易干燥凝結，對油鏡頭造成損害；故禁止使用香柏油，必需使用顯微鏡專

用的鏡油（英文名：Immersionoil,formicroscopy）0鏡油折射系數

應大于1.5,20℃黏度系數應在100-120mPas之間。

5.采用熒光染色法鏡檢AFB,只限于那些工作量較大（每人日讀片數超過25

張）、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員接受過熒光染色鏡檢培訓的實驗室開展。

6.采用熒光染色時，熒光隨著時間而衰減。故熒光染色后的涂片應于當H鏡檢;

如果玻片數量過多，應將涂片放置于4℃避光保存，次日必須完成鏡檢。

（二）AFB痰檢假陽性結果的預防措施

1.必須使用新玻片進行涂片檢查。

2.每個標本均使用一個新竹簽完成制片涂抹。

3.所有染液均經過濾。

4.染色時玻片彼此保持一定距離，相互徹底分隔開。

5.嚴禁使用染色缸奧色。

6.染色時勿使玻片上的染液干燥。

7.滴加染色液或鏡油時，避免容器滴口直接接觸痰膜。

8.嚴禁物鏡鏡頭直接接觸痰膜。

9.作為對照，可采月己知結果為陰性的玻片完成染色鏡檢過程。

10.完整、準確的標注痰盒、玻片和登記實驗登記本。

11.登記前、后對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細核對。

12.準確記錄和報告結果。

（三）AFB痰檢假陰性結果的預防措施

1、確認標本是痰而非唾液。

2、確認每份標本至少有3ml。

3、選擇膿樣、干酪樣、粘液分泌物涂抹制備玻片。

4、制備玻片時標本涂抹均勻，不要太厚或太薄。

5、使用高質量染料、嚴格按照配方配制染液。

6、嚴格按照操作程序完成染色過程。

7、判斷結果為“陰性”前，必須閱讀規定要求的視野數。

8、作為對照，可采用已知結果為陽性的玻片，完成染色

鏡檢過程。

9、完整、準確的標注痰盒、玻片和實驗登記本。

10、登記前對檢驗單和標本盒上的標注進行仔細垓對。

11、準確記錄和報告結果。

第五節顯微鏡的使用、維護和保養

顯微鏡作為結核病防治工作中的重要設備，實驗室工作人員應正確使用并給

予日常維護，以保證其正常工作和延長使用壽命。在使用和維護顯微鏡時應特別

遵守下列要點：

一、一般原則

（一）顯微鏡是精密儀器，所以應注意

1、小心操作，避免任何撞擊。

2、移動顯微鏡使用雙手，一手托于顯微鏡底部，一手握顯微鏡臂。

3、不要自行拆開顯微鏡。

4、不要將可拆卸的目鏡或其他光學部件摔落.

5、避免振動、過熱、日光直射、潮濕以及灰塵。

（二）如有灰塵或有濺出的鏡油弄臟顯微鏡，應立即清理

1、清潔顯微鏡表面：用柔軟的紗布沾少量中性清潔劑清潔。

2、清潔目鏡內部的鏡頭或聚光器：用鏡頭紙或柔軟的干布擦拭。（這些鏡

頭經常是用光學塑料做成，溶劑可能會使鏡頭變得模糊）。

3、清潔物鏡：使用鏡頭紙或柔軟的干布清潔（使用溶劑可能會使粘附鏡片

的膠溶解）。

4、只有當清潔諸如目鏡外部鏡頭等玻璃部件時，可以用柔軟的紗布沾取少

量溶劑（乙醛與乙醇的混合物，體積比為8：2或7：3）擦拭。必須注

意：目前光學塑料被用于越來越多的部件中，所以在顯微鏡的清潔中不

使用溶劑是最安全的。

5、應該特別注意灰塵，可以用橡皮吸球輕輕吹掉，也可以使用柔軟的刷子

清潔。

（三）在潮熱地區，可能會生長霉菌，破壞顯微鏡的光學部件。為了避免霉菌生

長，可以將顯微鏡罩好，再將其放在用1—2個40瓦燈泡加熱的柜櫥內或放置在空

氣流通處。在這樣的地區，顯微鏡不能放在木箱中過夜。近來某些品牌的顯微鏡

附帶抗真菌裝置，安裝在顯微鏡的內部。

（四）為避免劃痕或留下纖維，只能使用鏡頭紙或軟布清潔光學部分，而不能使

用普通紙巾或棉花。

（五）顯微鏡只能由接受過專門培訓的技術人員拆卸。不能常規地打開顯微鏡進

行清潔，除去目鏡清潔鏡頭足以使灰塵和真菌的泡子穿透并附著在棱鏡上。同樣

地，如果移去物鏡頭進行修理或更換，應該用顯微鏡廠家提供的塑料塞封住物鏡

轉換器上的孔洞c

二、日常維護

1、安穩水平放置顯微鏡。

2、除去表面的灰塵。

3、檢查顯微鏡上的灰塵和油漬，如果需要，按上述方法清潔。

4、檢查物鏡是否擦拭（有的人可能會將顯微鏡的物鏡浸到鏡油）。

5、使用后應關閉顯微鏡電源（適用于電光源的顯微鏡）。

6、待顯微鏡燈泡及其周圍部分充分冷卻后拔除電源線。

7、蓋好顯微鏡并存放好。

三、維修和保養

如上所述，只有經過專門培訓的技術人員才可以進行顯微鏡的維修和超出上

述范圍以外的保養。未經專門培訓的人員所能進行的唯一“維修”操作是更換破

損的燈泡：

1、更換燈泡前，關閉顯微鏡電源，待顯微鏡燈泡及其周圍部分充分冷卻后拔除

電源線。

2、如果必須倒轉顯微鏡以觸到燈泡部分，應先拔下目鏡頭，否則目鏡可能扭落。

3、確認你選擇了正確的燈泡：查看顯微鏡說明書中的詳細說明。

4、正確更換新燈泡：現在許多顯微鏡裝有鹵素燈泡（很小但是功率很強）。這

些鹵素燈泡會變得很熱，因此一定不要用手觸摸，因為在燈泡的工作溫度下，即

使很少的油脂也會和玻璃起反應，并使燈泡破損。所以，當更換鹵素燈泡

時，要使其一直在塑料袋中進行操作，當燈泡安裝到位后才能除去塑料袋。如果

這樣的燈泡被手指接觸，或經其他途徑被弄臟，應使用紗布浸少許酒精擦拭，并

在干燥后安裝。

5、打開燈泡小室的蓋子。

6、安裝新燈泡（如果是鹵素燈泡可將燈泡插腳插入針孔，或者將其他燈泡旋轉

入位）。

7、關閉燈泡小室的蓋子。

8、插上顯微鏡電源試用.

第六節試劑和材料

為保障痰涂片鏡險工作的連續性，各實驗室應根據實際工作負荷儲存一定

數量的實驗耗材和相應試劑，儲備量一般應比平均工作量高20%作為緩沖，每

檢查1000份標本所試劑消耗和應該儲備的耗材和試劑見表1：

表1實驗室準備耗材（每檢查1000份標本）

材料、試劑名稱實際用量需要儲備量備注

痰盒1000個1200個

竹簽1000個1200個

載玻片1000張1200張

鏡油100ml120ml

復紅染色液3000ml3600ml

亞甲蘭復雜液3000ml3600ml

濃鹽酸。300ml360ml每張玻片需染

95%酒精◎5700ml7000ml色液、復染液各

石碳酸135g162g約3ml,需脫色

金胺0染色液（如使用熒光染色）3000ml3600ml液約6ml；

高鋅酸鉀復染液（如使用熒光染色）3000ml3600ml

定性濾紙6張

擦鏡紙2本

玻片盒（100張/盒）10個

。鹽酸、酒精的消耗量根據脫色情況調整。

第三章痰涂片顯微鏡檢查質量保證

實施質量保證工作對于持續提高結核病實驗室痰涂片檢查的工作效率和可

靠性非常重要。質量保證（QualityAssurance,QA）包括三個方面：室內質量控

制（QualityControl,QC）、室間質量評估（ExternalQualityAssessment,EQA）、

質量提高（QualityInprovement,QI）。

按照國家結核病防治規劃的要求以及WHO的建議，在實驗室內部質量控制的

基礎上，應用實驗室間質量檢查和評估的方法，進行實驗室檢查系統的評價，并

通過采取一系列措施不斷改進和提高實驗室服務的總體水平。必須依靠全國結核

病實驗室質量保證系統網絡。現將我國結核病實驗室網絡及職能、質量保證工作

介紹如下。

第一節實驗室網絡及職能

實驗室質量保證依賴于完整的實驗室網絡以及網絡中各級實驗室是否能夠

有效地發揮各自職能。

一、結核病實驗室網絡

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她《巾）宴祖隼?康?市）宴驗室

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圖4結核病實驗室網絡

二、質量保證體系中各級實驗室職能

（一）國家結核病參比實驗室

1、根據國家結核病防制規劃的要求，組織全國結核病實驗室的工作，制定和推

行結核病細菌學實驗技術標準化準操作規程及規章制度。

2、建立可行的全國結核病實驗室質量控制標準和質量保證系統，并負責組織、

實施。

3、指導、協調、檢查各省（市、自治區）結核病實驗室工作，為全國各級結核

病實驗室服務提供技術支持。

4、對結核病實驗室的沒施、設備、耗材的技術指標及質量進行評價。

5、參與跨國參比實驗室的質量評估。

（二）省（市、自治區）級結核病參比實驗室

1、按照國家和省結核病防制規劃的要求，在國家參比實驗室的統一部署下，規

劃本省結核病實驗室工作，制定實施措施，協調、指導省內各級結核病實驗室工

作并提供技術支持。

2、根據國家結核病實臉室質量保證體系的要求，組織全省各級實驗室痰涂片鏡

檢的質量保證工作，按要求對所轄的地市、縣級實驗室進行督導和評估，指導地

市級實驗室對各縣級實驗室的盲法復檢和現場評估。

3、對本省結核病實驗室所用耗材、試劑的質量進行評估和核準。建議省級參比

室為全省統一提供抗酸染色試劑，為省內開展分離培養的實驗室統一提供培養

基。

4、負責組織、實施本省結核病實驗室質量保證相關的培訓工作。

5、接受國家參比實驗室的質量評估，按有關規定上報各類表格。

（三）地（市）級結核病實驗室

1、在省級參比實驗室的指導下，制定本地（市）結核病實驗室工作計劃。

2、根據國家結核病實驗室質量保證體系的要求，組織實施本地市痰涂片鏡檢的

盲法復檢和現場評估，并按要求向省參比實驗室報告結果。

3、對縣級實驗室以及鄉鎮衛生院查痰點提供技術支持。在省級參比室難以統一

提供抗酸染色試劑時，協助省級為轄區內的痰涂片檢查實驗室提供抗酸染色液。

4、培訓所轄縣（市）結核病實驗室技術人員，監督轄區內檢驗人員培訓后上崗

制度。

5、接受省級參比室的質量控制、技術培訓和現場督導。

（四）縣級結核病實驗室

1、在省、地（市）參比實驗室的指導下，制定本縣（市）結核病實驗室檢查的

工作計劃。

2、按照國家結核病實驗室質量保證體系的要求，在所屬地（市）級實驗室的組

織下，開展痰涂片鏡檢盲法復檢。

3、按國家統一的標準叱操作程序常規開展痰涂片鏡檢工作，并按規定保存痰涂

片待上級實驗室抽取復檢。

4、接受上級實驗室的督導、現場評估和定期培訓.

5、對轄區內鄉鎮衛生院查痰點的工作提供技術支持。

（五）鄉鎮衛生院查痰點

1、按國家統一的標準化操作程序開展痰涂片鏡檢工作，并按規定送痰涂片復檢。

2、接受上級實驗室的培訓、現場督導和技術指導。

第二節室內質量控制

室內質量控制（QualityControl,QC）指實驗室內部的操作規程、設備和

耗材.、痰標本收集、染色劑制備、涂片制備和染色、顯微鏡維護、顯微鏡鏡檢、

結果登記和報告、以及痰片保存等整個過程的內部檢查和監測。

一、痰標本收集

1、容器：采用可密封的螺旋蓋痰盒收集痰標本（參考規格：直徑4厘米，高度

2厘米）。痰容器應標明病人姓名、日期、編號（初診患者門診序號或隨訪患

者登記號）和容器序號1、2、3（1為當日即時痰，2為夜間痰，3為次日即

時痰）。

2、痰標本性質：干酪痰、血痰、粘液痰為合格標本；唾液或口水為不合格標本,

除照常進行涂片檢查外，應耍求患者重新送檢。

3、初診病人應收集3份痰標本（當日即時痰、夜間痰和次日晨痰），治療中或復

診隨訪病人按期每次收集2份痰標本（夜間痰、當日或次日晨痰）。

4、對當日不能進行涂片檢查的痰標本，須置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干

涸或污染。

二、抗酸染色液制備

1、配制染色液的實驗室必須按標準濃度和步驟配制染色液（附件3）,實驗室要

有染色液制備配方和配制紀錄。

2、染色液試劑瓶須標明染色液名稱、濃度和制冬時間。

3、染色液置于棕色瓶內或者不透明塑料瓶內存放，避光保存。

4、為監測染色液的質量，每次制備一批新的染色液之后，需使用未經染色的已

知陽性和陰性涂片進行染色、鏡檢，并記錄結果。

三、涂片制備

1、新載玻片應經95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后方可使用。

2、一張裁玻片只能涂抹1份痰標本，且只能一次性使用，嚴禁清洗后重復使用。

3、推薦使用一端有磨砂面的玻片.

4、2B鉛筆在磨砂面上注明實驗序號及標本序號，若使用無磨砂面的玻片，則必

須使用玻璃刻刀在玻片一端的1/3處進行標注。

5、大約0.05ml痰標本，在玻片正面右側2/3的中央處均勻涂抹面積為10X20mm

的卵圓形痰膜。

6、將已干燥的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的5號字，則

表明該玻片涂抹過厚u

四、染色

1、肉眼觀察染色后的痰膜應呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。

2、染色后的痰膜脫落部分應小于整個涂抹面積的10%o

五、鏡檢

1、為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡頭直接接觸涂片上的痰膜。

2、按照結果報告標準仔細觀察足夠的視野數。

3、每個工作日，一名鏡檢人員的涂片閱讀量不應超過25張。

4、連續閱讀1()72張涂片后，應休息20分鐘左右。

5、采用自查和互查方式，至少抽查復檢當日10%涂片，并填寫室內質控登記

表(表2)。

表2痰涂片鏡檢室內質量控制記錄表

單位名稱：年月

鏡檢涂片數初檢者抽查復檢痰涂片復檢者

日期

合計陰性陽性簽名涂片數符合數簽名

合計

六、登記報告

1、登記前應反復核對檢驗單、標本盒、涂片上的標注。

2、檢查后的每一張涂片結果，應按規定準確記錄在“結核病細菌學實驗室登

記本”上。

3、鏡檢結果報告應及時發出，以便盡早為臨床提供診斷依據。

七、痰涂片保存

1、鏡檢后應及時用擦鏡紙輕輕在涂片上揭取數次，徹底去除玻片上的鏡油。

2、涂片脫去鏡油后，必須再次核對實驗室登記本與每張涂片實驗序號是否一

致。

3、涂片上禁止標記鏡檢的陰、陽性結果。

4、全部涂片按實驗室登記本序號連續排列，存放于玻片盒內。

5、涂片保存與實驗室登記本記錄應一致。初診病人第一張涂片存入涂片盒后

需預留出2個空位置，以備第二張、三張涂片檢查后放入；隨訪病人第一張涂片

存入涂片盒后需預留出1個空位置，以備第二張涂片檢查后放入。

6、對涂片保存量的要求：

(1)根據結核病實驗室登記本記錄，按照棄舊存新的原則，保存近期3個月

的全部痰涂片待復檢。

(2)、年涂片量不足50()張的實驗室，必須保存全年的涂片待復檢。

(3)、如果近3個月的涂片數超過100()張，可以按照棄舊存新的原則，保存

近期1000張的涂片待抽查復檢°

7、裝滿涂片的玻片盒，需用標簽注明涂片實驗序號區間和日期區間，以便日

后盲法復檢或現場評價時抽樣。

第三節室間質量評估

室間質量評估(EQA)是通過進行批量測試、盲法復檢并與網絡中的其他實

驗室(上級或同級實驗室)比對結果，對實驗室的能力進行評價的過程。EQA

包括實驗室現場評價(OnsiteEvaluation盲法復檢(BlindRechecking)以及

批量測試(PanelTesting)。

一、現場評價

(-)目的

通過現場評價發現問題，提出正確的建議解決問題，提高痰涂片鏡檢質量。

(二)頻度

1、國家參比室不定期對省級參比室進行現場評價，同時抽查市及縣級結核

病實驗室。

2、省級參比室每年對所轄地(市D級實驗室至少進行1次現場評價，同時

每地(市)抽查1?2個縣級實驗室；對批量測試或盲法復檢存在問題的市、縣實

驗室，應適當增加現場評價頻率。

3、地（市）級實險室每年對所轄區（縣）實驗室每年至少

進行2次現場評價。

4、對批量測試或盲法復檢存在問題的縣級實驗室必須盡快進行針對性的現

場督導，以查找原因，提高涂片鏡檢質量。

（三）注意事項

I、現場評價的優點是能直接觀察實驗室實際工作，能核實并驗證設備和耗

材，因此有利于發現問題、查找出現錯誤的原因。更重要的是與有關領導進行直

接溝通，以促進實驗室工作。

2、現場評價的缺點是工作時間短，工作強度大，而且花費高，因此必須保

證現場評價高效實行。這就要求現場評價員（督導員）應由經驗豐富的實驗室技

術人員擔任，必須經過高一級實驗室的培訓.

3、現場評價要按本手冊所附督導清單（附件4）進行。如果省、市對縣級

督導，人員及硬件設施沒有變動，不需要每次都填寫。

4、現場評價反饋艱告的參考模式見附件5。

5、上級實驗室對下級進行督導的時候，應核對以前的督導報告和被評估實

驗室實際情況，因此各級督導報告應保存至少二年。

二、盲法復檢

（一）原則

1、抽樣要保證隨磯：從各個實驗室抽取的用于盲法復檢的涂片必須按本手

冊的要求隨機抽出，即能代表整個實驗室的操作水平。

2、復檢要保證盲法：盲法復檢的整個過程必須保證第一復檢者不知道初檢

結果，以確保復檢結果的客觀、真實。

3、最終復檢結果由盲法復檢組織者確定。選擇同級實驗室交叉復檢模式的

地區，若第一復檢者盲法復檢結果與初檢結果不一致，由上級實驗室進行第二次

復檢后最終確定。選擇地市級（或省級）直接復檢的地區，由該地市（或省級）

另一名鏡檢人員查驗第一復檢結果與初檢結果，如果出現不符，對不符合的涂片

進行第二次復檢，以確定最終復檢結果。

4、由盲法復檢的組織單位抽取涂片。為保證盲法，應由非實驗室人員（項

目管理人員、臨床醫生或統計人員等）或實驗室中不進行第一復檢的人抽片。

5、盲法復檢組織者必須及時將復檢結果以書面形式反饋給接受檢查的實驗

室，必須保證受檢查實驗室留存有反饋報告或復印件，受檢查實驗室的實驗員能

看到反饋報告，以便其了解出現的錯誤，查找原因并改正。

6、盲法復檢組織者按本手冊要求及時將盲法復檢結果分析匯總，并按期上

報。

（二）盲法復檢的實施模式

1、對地（市）實驗室的盲法復檢：由省級參比實驗室負責組織實施。可以

根據本省實際情況組織不同地市實驗室之間交叉互檢（第一復檢），再由省級參

比實驗室進行第二復檢；也可由省級參比室對所有地市實驗室抽取的涂片統一進

行盲法復檢C

2、對縣（區）級實驗室的盲法復檢：由地市實驗室負責組織實施。可以根

據本地區實際情況組織不同縣區實驗室之間交叉互檢（第一復檢），再由地市實

驗室進行第二復檢；也可由地市實驗室對所有縣區實驗室抽取的涂片統一進行盲

法復檢。第-種模式適用于地域面積大、所轄縣區數目較多、地市實驗室承擔對

所有縣區實驗室的盲法復檢難度較大的地區；面后者適用于地域面積較小、所轄

的縣區數目較少、地市能夠承擔對所有縣區熨驗室盲法庭檢任務的地區。某一地

市選擇哪種盲法復檢的模式，需由本地區實驗室根據具體情況提出意見，并由省

參比實驗室批準。

（三）盲法復檢中各級實驗室職責

總體來說，盲法復檢時由上一級實驗室負責對所轄下一級各個實驗室盲法復

檢的組織實施、現場盲法抽片一，根據當地具體情況安排第一復檢者和第二次復檢、

負責結果的匯總、分析、報告和反饋，以及根據盲法復檢中出現的問題及時進行

有針對性的的現場督導，幫助查找錯誤原因并督促改正。詳見表3。

表3、盲法復檢中各級實驗室職責

對地市實驗室的盲法復檢對縣級實驗室的盲法復檢

同級交叉省級復檢同級交叉地市復檢

組織實施、現場抽片省級省級地市級地市級

第一復檢地市級省級縣級地市級

第二復檢、

省級省級地市級地市級

反饋、及督促整改

（四）盲法復檢頻度：

1、省參比室對地（市）級實驗室講行的盲法復檢，每半年講行1次。

2、地（市）級實驗室對縣級實驗室進行的盲法復檢，每季度進行1次；對

于因地域、交通等原因不能每季度進行1次盲法復檢的實驗室，可在省參比實驗

室核準后適當減少盲法復檢次數，但一年不得少于2次，并應相應增加每次抽取

復驗的涂片數，以保證年內抽驗涂片總數不變（詳見以下內容）。

（五）抽取涂片的樣本最

1，樣木量估算：盲法復檢的關鍵是復檢結果能否代表被評估實驗室的實際

水平。WHO推薦80%靈敏度、100%特異性（針對陰性涂片）、誤差為0的可接

受數量以及95%可信限樣本量表，可保證盲法復檢在統計學意義上可以代表被評

估實驗室的總體水平。表4為按上述統計參數計算的本年應抽取的涂片樣本量計

算表。

表4樣本量計算表

涂片陽性率

上一年陰性

涂片的總數5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%

30012910180675950

40014310886706151

50015411489716252

70016712192756554

100018012896766655

2000197135100796856

5000208141103806957

10000213142104806957

20000215143104826957

說明：

(1)涂片陽性率：指所有檢測的涂片中陽性涂片的比例。

(2)上一年陰性涂片總數：每年涂片的總數減去全年陽性涂片數。

(3)抽樣時，當上一年陰性涂片數量和涂片陽性率不在選擇點，陰性涂片

數值采用區間上限，涂片陽性率采用區間下限。也就是采取偏大的樣本量。

(4)涂片陽性率小于5%按5%計算,大于18%按18%計算。

(六)現場抽樣方法(參考附件6現場抽片舉例)

1、確定年抽片量：現場抽片時首先核實被評估實驗室“上一年陰性涂片數”

和“涂片陽性率”，根據樣本量表(表4),確定該年內應復檢的涂片總量。

2、確定現場抽樣量：復檢涂片總量除以年內計劃盲法復檢次數，即為每次

盲法復檢應抽取的涂片數。

3、現場核實實驗室實際保存的涂片數量。

4、確定抽樣間距：用實際保存涂片數量(指已經登記結果的涂片)除以現

場應抽片數量，即為本次抽片的抽樣間距。

5、隨機確定第一張涂片。如抽樣人員可以隨機取出一張錢幣，以錢幣號碼

的末位數字為抽取第一張涂片的序號。也可參考隨機數字表確定。第一張涂片號

以不大于抽樣間距為宜。

6、以此序號為起始向下計數，每數到一個抽樣間距即抽取一張涂片，直到

抽滿所需數量的涂片。應先在實驗室登記本上找到抽取的涂片序號登記到表5,

然后從片盒中找到相應序號的涂片。禁止直接從片盒中抽取玻片后再登記。

7、如果所抽到的某一張涂片丟失或損壞，則選擇下一張涂片，并填寫變更

涂片號，并在備注欄說明原因。但其余編號不變。即未丟失或損害的涂片仍按登

記本上抽取的編號抽取。

8、抽出的涂片按順序擺放在玻片盒內。

9、將實際抽取涂片的初檢結果填入表5,有變更號的應填寫變更號的結果。

10、將實際抽取涂片的編號填入表6。

11、受檢實驗室的實驗員在實驗室登記本中備注欄對被抽的涂片進行標注，

說明該涂片被抽走，同時注明抽片時間（標注月、日即可）

（七）盲法復檢步驟

1、抽片人員將抽樣的涂片連同表6一起交給第一復檢者，并保證第一復檢

者不知道初檢結果，表5由抽片員妥善留存。

2、第一復檢者應在接到涂片的3天內完成盲法復檢，并將復檢結果及對涂

片外觀評價填入表6相應位置，然后將涂片和填寫完畢的表6交回抽片人員。

3、抽片人員收到第一復檢者交回的涂片和表6后，將初檢結果填入表遠相

應位置。

4、若發現初檢結果和第一復檢結果存在差別由承擔第二復檢任務的實驗員

對不符合的涂片進行第二次復檢，然后再復檢10%的涂片。

5、初檢結果和第一復檢結果的差別包括陰性與陽性的差別，還包括陽性級

別相差達到或超過2個級別。而陽性結果相差一個級別，例如初檢結果為2+,

而第一復檢結果為1+或者