廣州市協和中學

李麗基因工程的基本操作程序(第2課時)高二—人教版—生物學選擇性必修3—第3章基礎知識回顧一.轉基因抗蟲棉的基本操作流程圖3.將目的基因導入受體細胞將含有Bt基因的表達載體導入受體細胞檢測和鑒定Bt基因是否穩定維持和表達其遺傳特性1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建

用限制酶切割

載體和含有Bt基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體4.目的基因的檢測與鑒定獲取質粒、噬菌體等載體篩選和獲取Bt基因請根據資料，參考轉基因抗蟲棉獲取的主要步驟，設計獲取轉基因抗凍番茄的方案。探究·實踐資料1：番茄是基礎生物學研究中的重要對象和模式植物。但番茄不耐

寒，生長最適地溫為20～23℃，當地溫降到6℃時，根系停止生長。資料2：棲息于南極和北極的極地魚類能長期在零下低溫環境中生存，

也稱為抗凍魚。經研究發現，抗凍魚血液中有抗凍蛋白afp，對冰

晶具有較高的親和力，能夠附著到冰晶表面，阻止冰晶長大，因此，

抗凍魚能夠在低于血漿冰點的溫度下生存，而血漿不凝固，達到抗

凍效果。目前，科學家不僅掌握了抗凍蛋白基因afp的序列信息，

也對抗凍蛋白afp有了較為深入的了解。一.目的基因的篩選與獲取1.從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。2.利用PCR擴增抗凍蛋白基因afp（3）原理：DNA半保留復制。轉基因抗凍番茄（1）發明人：1985年，穆里斯等人，為此，1993年穆里斯獲得諾貝爾化

學獎（我國臺灣科學家錢嘉韻也作出了重要貢獻）。（2）概念：PCR全稱聚合酶鏈式反應，是在體外提供參與DNA復制的各種

組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。從基因文庫中獲取、人工合成、利用PCR獲取目的基因：抗凍蛋白基因afp1.從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。2.利用PCR擴增抗凍蛋白基因afp轉基因抗凍番茄參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3＇端開始連接脫氧核苷酸表3-1DNA復制所需的基本條件（體外用高溫代替）（體外耐高溫）一.目的基因的篩選與獲取1.從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。2.利用PCR擴增抗凍蛋白基因afp轉基因抗凍番茄（4）條件：DNA模板、4種脫氧核苷酸、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶。一.目的基因的篩選與獲取（5）擴增過程：（5）擴增過程：第一輪循環的產物作為第二輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環的產物。第二輪循環的產物作為第三輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第四輪循環的產物。受熱變性引物

耐高溫的

DNA聚合酶(5)PCR擴增過程小結：1.從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。2.利用PCR擴增抗凍蛋白基因afp轉基因抗凍番茄（6）結果：1個模板DNA分子經過n輪PCR，以

方式擴增，可以擴增出

個DNA片段。指數2n一.目的基因的篩選與獲取1.從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。2.利用PCR擴增抗凍蛋白基因afp轉基因抗凍番茄PCR擴增儀瓊脂糖凝膠電泳一.目的基因的篩選與獲取利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述錯誤的是（）

A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶

B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶

C.復性過程中引物與模板鏈的結合遵循堿基互補配對原則

D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸D二.基因表達載體的構建轉基因抗凍番茄核心限制酶切割位點：插入需要轉入的目的基因復制原點：DNA分子復制起始的地方標記基因：鑒定和篩選含有目的基因的

受體細胞啟動子：DNA片段，RNA聚合酶識別和結合的

部位，驅動轉錄終止子：DNA片段，終止轉錄基因表達載體中啟動子、終止子的來源：①如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，已含有啟動子、終止子，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上接上特定的啟動子、終止子。②如果目的基因是通過人工方法合成的，或是cDNA，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構建基因表達載體時，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。二.基因表達載體的構建轉基因抗凍番茄核心基因表達載體構建模式圖質粒DNA分子（含抗凍蛋白基因afp）帶有切口的質粒目的基因片段DNA連接酶含抗凍蛋白基因afp的重組質粒（同種或產生相同末端的限制酶處理）三.將目的基因導入受體細胞轉基因抗凍番茄花粉管通道法農桿菌轉化法轉化：指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和

表達的過程。農桿菌在自然條件下能感染雙子葉植物和裸子植物，一般不能感染單子葉植物。其細胞內含有Ti質粒，侵染植物細胞時，Ti質粒的T-DNA可轉移至被侵染的細胞，并將其整合到該細胞的染色體DNA上。Ti質粒T-DNA目的基因構建表達載體含有目的基因的重組Ti質粒農桿菌轉化法示意圖：

轉入農桿菌

導入植物細胞將目的基因插入染色體DNA中植物細胞表現新性狀的植株兩次導入細胞兩次拼接含有重組Ti質粒的農桿菌三.將目的基因表導入受體細胞轉基因抗凍番茄農桿菌轉化法Ti質粒抗凍蛋白基因afp構建含抗凍蛋白基因afp的重組Ti質粒導入普通番茄細胞插入番茄細胞染色DNA上表達轉基因抗凍番茄轉入農桿菌思考：受體細胞選擇體細胞還是受精卵？三.將目的基因導入受體細胞轉基因抗凍番茄Ca2+處理（使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態）原核生物(常用)花粉管通道法動物顯微注射法體細胞或受精卵受精卵農桿菌轉化法生物種類導入方法受體細胞

植物大腸桿菌

最為廣泛在基因工程中，為將目的基因導入受體細胞常采用農桿菌轉化法，在農桿菌中常含有一個Ti質粒。某科研小組欲將某抗蟲基因導入某植物，下列分析錯誤的是（

）（單選）A．Ti質粒含有對宿主細胞生存具有決定性作用的基因，是基因工程中重要的載體。B．用Ca2＋處理細菌是重組Ti質粒導入農桿菌中的重要方法。C．土壤農桿菌成功感染植物細胞，可通過植物組織培養技術將該細胞培養成具有抗蟲性狀的植物。D．若能夠在植物細胞中檢測到抗蟲基因，則說明將重組質粒成功地導入到了受體細胞。A四.目的基因檢測與鑒定轉基因抗凍番茄分子水平檢測個體生物學水平鑒定利用PCR技術檢測是否插入抗凍蛋白基因afp利用PCR技術檢測是否轉錄出mRNA利用抗原-抗體雜交技術檢測是否產生抗凍蛋白afp栽種在寒冷環境中下列技術依據堿基互補配對原理的是（

）（單選）①檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因；

②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；

③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質；

④通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡判斷棉花是否被賦予了抗蟲特性。A．①②③④B．①②C．①②④D．①②③B轉基因抗凍番茄的基本操作流程圖3.將目的基因導入受體細胞

將含有抗凍

蛋白基因afp的

Ti質粒重新導入農桿菌，再把含有重組質

粒的農桿菌導入普通番茄細胞在分子水平

和個體生物學水平檢測和鑒定抗凍蛋白基因afp是否穩定維持和表達其遺傳特性1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建

用限制酶切割

Ti載體和含有抗凍蛋白基因afp的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體4.目的基因的檢測與鑒定獲取農桿菌Ti質粒篩選和獲取抗凍蛋白基因afp目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可進行遺傳、表達和發揮作用。載體進入受體細胞穩定表達，才能實現一種生物的基因在另一種生物中的轉化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩定遺傳和正確表達。前提核心關鍵保證小結謝謝觀看！廣州市協和中學

李麗基因工程的基本操作程序(第2課時答疑)高二—人教版—生物學選擇性必修3—第3章1.

PCR反應為什么需要2種引物？思考引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3‘端開始連接脫氧核苷酸。5＇目的基因3＇3＇5＇5＇3＇3＇5＇引物1引物22.PCR復性的過程一定是引物與DNA模板鏈結合嗎？思考

復性時引物與DNA模板的結合是隨機的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結合，但兩條模板鏈重新結合的概率較低，原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復雜得多，重新結合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數量少，引物與模板之間的碰

撞結合機會，遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞機會。3.用PCR可以擴增mRNA嗎？思考mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄為cDNA再進行擴增。單鏈RNA逆轉錄酶雜交雙鏈RNA鏈DNA鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA（RNaseH）由mRNA逆轉錄為cDNA的過程示意圖思考4.利用PCR獲取目的基因時至少要經過幾次循環才能分離出目的基因？至少要三次循環。第一次循環第二次循環第三次循環5.PCR技術中引物是什么？引物設計的依據是什么？如圖所示的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理，請分別說明理由。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA復制通常以RNA單鏈為引物；細胞外（P