第八章生殖毒理學和發育毒理學第一節概述一、哺乳動物的繁殖過程--生殖發育過程，是哺乳動物繁衍種族的生理過程生殖發育其中包含生殖細胞發生，即精子發生和卵細胞發生、配子的釋放、性周期和性行為、卵細胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發育、器官發生（或稱器官形成）、胎仔發育、分娩和哺乳過程、直至性成熟的整個過程。二、外源化學物對生殖發育的影響干擾生殖發育的任何環節并造成損害作用。可以通過對內分泌系統特別是對性腺的作用，發生間接的影響。神經系統對內分泌功能也有調節作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發育過程。外源化學物對生殖發育損害作用的特點生殖發育過程較機體其他系統更為敏感外源化學物對生殖發育過程影響的范圍較為廣泛和深遠生殖毒理學(reproductivetoxicology)主要研究外源化學物對生殖細胞發生、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害作用及其評定，評定方法即為生殖毒性試驗。發育毒理學(developmentaltoxicology)主要研究外源化學物對胚胎發育、胎仔發育以及出生幼仔發育的影響及其評定，評定方法稱為發育毒性試驗，其中主要為致畸試驗。第二節生殖毒性及其評定一、生殖毒理學歷史。二、生殖毒性外源化學物對生殖的過程的損害作用可以表現為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現排卵規律改變，月經失調或失經，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等；雄性可表現為睪丸萎縮或壞死，精子數目減少。1、外源化學物的雄性生殖毒性對睪丸生精細胞的影響對內分泌功能的影響對性功能和生殖功能的影響1）對睪丸生精細胞的影響棉酚影響睪丸功能的典型外源化學物CS2工業污染物引起睪丸萎縮，精子生成障礙；對生殖細胞有致突變作用。重金屬鉛、鎘、汞、錳等損害形態、功能，如精子畸形率↑、精子數和精子活動率↓農藥生精↓、精子畸形率↑、睪丸萎縮、性功能減退等2）對內分泌功能的影響精子數目、精子的發育成熟、活動率、活動能力等3）對性功能和生殖功能的影響性欲功能降低、陽痿、雄性不育等2、外源化學物的雌性生殖毒性對卵細胞的影響對內分泌的影響對子代生長發育的影響環境因素尤其是化學物工業污染物、農藥、重金屬、毒素等三、生殖毒性的評價外源化學物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。生殖毒性試驗可以全面反映外源化學物對性腺功能、發情周期、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發育可能發生的影響。1、雄性生殖毒性評價精子生成分析精子計數、形態觀察、狀態分析精子穿透試驗精子體外受精試驗睪丸中標志酶活性測定體外試驗生殖細胞體外培養接觸受試物雄性激素檢測顯性致死試驗雄性生殖細胞遺傳毒性檢測雄性生殖毒性病理檢查2、雌性生殖毒性評價體外試驗動物試驗輔助試驗第三節發育毒性及其評定發育毒性基本概念生殖毒性的評價一、基本概念1、發育毒性(developmentaltoxicity)指出生前經父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達成體之前出現的有害作用。發育毒性具體表現為:生長遲緩:即胚胎與胎仔的發育過程在外源化學物影響下，較正常的發育過程緩慢。致畸作用:由于外源化學物干擾，活產胎仔胎兒出生時，某種器官表現形態結構異常。功能不全或異常:即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經活動及行為的缺陷或異常。胚胎或胎仔致死作用:某些外源化學物在一定劑量范圍內，可在胚胎或胎仔發育期間對胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。2、畸形、畸胎和致畸物畸形(malformation):器官形態的異常。畸胎(terate):具有畸形的胚胎或胎仔。致畸物或致畸原(teratogen):凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物。致畸試驗:評定外源化學物是否具有致畸作用的試驗。3、胚胎毒性作用(embryotoxicity)外源化學物引起的胎仔生長發育遲緩和功能缺陷不全的損害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。4、母體毒性作用(maternaltoxicity)母體毒性作用是指外源化學物在一定劑量下，對受孕母體產生的損害作用。具體表現包括體重減輕、出現某些臨床癥伏、直至死亡。5、母體毒性作用與致畸作用關系具有致畸作用，但無母體毒性出現。出現致畸作用的同時也表現母體毒性。不具有特定致畸作用機理，但可破壞母體正常生理穩態。僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。在一定劑量下，既不呈現母體毒性，也未見致畸作用。6、畸形與變異在胚胎或胎兒出現器官形態結構異常稱為畸形。機體的形態結構或生理功能，在同一物種的子代與親代之間或子代的個體之間，有時出現不完全相同的現象，為變異。二、外源化學物發育毒性的評價—雌性生殖發育毒性評價1、生殖毒性評價生殖毒性試驗2、發育毒性評價致畸作用評定主要依據是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）及斷奶后發育情況等。檢查外源化學物對動物生育繁殖機能有無損害作用。生殖毒性的評價試驗試驗方法原則受試動物：性成熟大鼠、小鼠或家兔劑量分組:一般設立三個劑量組（至少兩個劑量組）和一個對照組染毒途徑:動物接觸受試物的方法應參照人類實際接觸途徑動物數:每組雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只試驗方案1三代兩窩兩代一窩(和一代一窩)觀察指標：受孕率（％）:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況正常分娩率（％）:反映雌性動物妊娠過程是否受到影響幼仔出生存活率（％）:反映雌性動物分娩過程是否正常幼仔哺育成活率（％）:反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力除上述４個指標外，還應該注意出生幼仔是否有畸形存在，對死亡的幼仔應進行畸形檢查，可為下一步致畸試驗提供參考2、發育毒性評價致畸作用毒理學特點機理傳統致畸試驗致畸作用的毒理學特點器官發生期的胚胎對致畸物最為敏感劑量與效應關系較為復雜劑量效應關系復雜的表現及原因致畸作用的劑量反應曲線較為陡峭致畸作用最大無作用劑量問題尚有不同意見物種差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。致畸作用機理Wilsom(1977)提出了畸形發生的9種機制，包括突變、染色體斷裂、有絲分裂改變、改變核酸完整性或功能、減少前體或底物的補給、減少能源支持、改變膜特性、滲透壓不平衡和酶抑制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進展，雖然胚胎有代償機制彌補外源性化學物的影響，但是，是否產生畸形依賴于在致病過程中的每個步驟在損傷和修復之間的平衡。致畸作用機理干擾基因表達基因突變與染色體畸變損傷細胞和分子水平的翻譯細胞調亡干擾細胞通過胎盤毒性引起發育毒性干擾母體穩態內分泌干擾作用傳統常規致畸試驗動物選擇劑量分組動物交配處理胎仔檢查動物選擇:致畸試驗的動物選擇，除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養和繁殖及價廉外，還應特別注意妊娠過程較短、每窩產仔數較多和胎盤構造及厚度與人類接近等特點。劑量分組先進行預試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設3個劑量組，另設對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組不應觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數關系。一般，最高劑量不超過LD50的1/5～1/3；低劑量可為LD50的1／100～1／30。動物交配處理每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。出現陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。由于致畸作用有極為明確的敏感期，應精確掌握動物接觸受試物的時間，必須在器官發生期。胎仔檢查自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。下列幾方面進行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等。畸形檢查只限活產胎仔。結果評定活產幼仔平均畸形出現數:即根據出現的畸形總數，計算每個活產幼仔出現的畸形平均數。畸形出現率:即作為畸胎的幼仔在活產幼仔總數中所占的百分率。母體畸胎出現率:即出現畸形胎仔的母體在妊娠母體總數中所占的百分率。確定受試物是否具有致畸作用時需注