關于薄層色譜掃描法

一、薄層色譜掃描法簡介二、影響薄層掃描定量的因素三、介紹CAMAG薄層掃描儀第2頁,共34頁，星期六，2024年，5月一、薄層色譜掃描法簡介第3頁,共34頁，星期六，2024年，5月1、簡述

薄層色譜掃描法是指用一束一定波長、一定強度的紫外或可見光對薄層板進行掃描，測定薄層板上的樣品斑點對光的吸收強度或斑點經激發后產生的熒光強度。所得到的圖譜及積分數據可用于藥品的鑒別、檢查及含量測定。第4頁,共34頁，星期六，2024年，5月

中藥材：山豆根、槲寄生、女貞子、牛黃、兩面針、黃連等；中成藥：六味地黃丸（濃縮丸）、元胡止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、九分散等;第5頁,共34頁，星期六，2024年，5月2、檢測方法(1)吸收法:掃描時測定薄層板上的樣品斑點對光吸收強度的方法。(2)熒光法:測定樣品斑點經激發后產生的熒光強度的方法。(3)熒光淬滅法:利用某些化合物減弱吸附劑中熒光劑的紫外吸收強度而進行定量的方法。由于薄層板各部分熒光強度不均勻,對定量不太適用,而是便于斑點的定位。第6頁,共34頁，星期六，2024年，5月3、測量方式

(1)透射法：測定照射光穿透樣品斑點后光的吸收情況。(2)反射法：樣品斑點對照射光的反射情況進行測定的方法。第7頁,共34頁，星期六，2024年，5月4、測光形式

(1)單波長掃描：使用一種波長的光束對薄層進行掃描。適用于分離度好，背景干擾小的薄層色譜。(2)雙波長掃描：用測定波長和參比波長分別掃描薄層后，測定樣品斑點在兩波長下的吸收度之差，可減少分離度欠佳的組分間的相互干擾，并減少薄層板的背景干擾，能顯著改善基線的平穩性。操作時應選擇待測斑點無吸收或最小吸收的波長作為參比波長。第8頁,共34頁，星期六，2024年，5月5、掃描方式

(1)線性掃描：用一束比待測斑點略寬的狹窄光帶沿展開方向做單向等速掃描。適于形狀較規則斑點的掃描。在進行熒光測定時一般只用線性掃描。(2)鋸齒掃描：使用微小正方形光束沿展開方向掃描的同時，在垂直于展開方向進行往復式掃描，掃描過程中光束的運動軌跡呈鋸齒形或矩形，它對于形狀不規則或分布不均勻的斑點掃描重復性較好，但掃描速度較慢。第9頁,共34頁，星期六，2024年，5月6、定量方法

(1)外標法：如果標準曲線經過原點，可用一點法校正；如果不通過原點，采用二點法校正，必要時用多點校正法。測定時，供試品溶液和對照品溶液應交叉點于同一薄層板上，每份供試品溶液點樣不得少于2個，對照品每一濃度不得少于2個，其計算結果的相對平均偏差不得大于5%。計算公式:C=kA+b(kA+b)×稀釋倍數點樣量×稱樣量(2)內標法：將內標加入供試品溶液和對照品溶液中以峰面積的比值為定量依據.由于內標物的選擇比較困難，目前應用較少。內標物：a.在樣品溶液中加入一種在樣品溶液中不存在的，

b.性質與被測物質類似且又與樣品中被測成分得易分離的純化物，第10頁,共34頁，星期六，2024年，5月7、系統適用性試驗

（1）檢測靈敏度：指用于限量檢查時，被測成分能被檢出的最低量。（2）分離度：用于限量檢查或含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度,應大于1.0。（3）重復性：指同一薄層板上同一供試品溶液相同濃度的數個斑點，掃描結果的偏差。不顯色直接掃描，相對標準偏差應不大于3.0%，顯色后掃描，相對標準偏差應不大于5.0%。第11頁,共34頁，星期六，2024年，5月二、影響薄層掃描定量的因素

第12頁,共34頁，星期六，2024年，5月（一）吸附劑性能及薄層質量1、吸附劑：（1）吸附劑顆粒大小，分布均勻程度能影響分離度和檢出限度。小顆粒且分布均勻的吸附劑，分離度好，靈敏度高。（2）吸附劑的含水量影響薄層活度，如果大氣濕度過大，吸附劑含水量過高，導致薄層活度過低，就會影響分離效果，所以在點樣前薄層板應進行活化在110℃干燥30分鐘。第13頁,共34頁，星期六，2024年，5月（一）吸附劑性能及薄層質量2、薄層：薄層厚度會影響定量結果，厚度下降，展開后斑點擴散較嚴重，影響定量結果。用透射法測定時，峰面積值隨薄層厚度下降而減小，用反射法測定，峰面積值隨薄層厚度下降而增加。因此對吸附劑及薄層性能的規格化是薄層色譜重現性及定量準確性的先決條件。第14頁,共34頁，星期六，2024年，5月薄層板的種類

硅膠G板、硅膠GF254板、硅膠H板、氧化鋁板。硅膠G板以石膏作為黏合劑；硅膠GF254板是添加熒光指示劑；常用的熒光指示劑有兩種:一種是錳激活的硅酸鋅（Zn2SiO4:Mn）,在254nm波長下能發出熒光;另一種是銀激活的硫化鋅、硫化鎘（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波長下能發出熒光。我們常用的是硅膠GF254板。硅膠H板是沒有外加黏合劑。氧化鋁板以氧化鋁作為固定相，可以分離萜類，生物堿類，脂肪族及芳香族化合物。第15頁,共34頁，星期六，2024年，5月（二）點樣

1、一般為圓點狀或窄細的條帶狀;

點樣基線距底邊10-15mm;

圓點狀直徑一般不大于3mm;

條帶寬度一般為5-10mm;

點間距離不少于8mm。2、點樣是薄層色譜的第一步,也是關鍵的一步,它既關系到能否得到可以重現的薄層色譜,也關系到定量測定結果的準確與否,點樣量不宜過大,最好控制在10μl以下,點樣過多或原點“超載”,展開劑產生“繞行”現象,使斑點拖尾或重疊,致使掃描峰形不對稱,或達不到基線分離。第16頁,共34頁，星期六，2024年，5月(三)展開

1、預飽和薄層各個部分對展開劑蒸氣的預吸附程度不同,會影響色譜分離，因此當用展開劑時，先將薄層及展開缸進行預飽和,以便得到重現的色譜圖。2、相對濕度：50%-60%較適宜相對濕度過大影響薄層活度,吸附劑吸附能力下降,分離效果不理想。3、溫度:一般18-25℃較適宜溫度變化會影響組分在兩相間的分配,被分離物質的Rf值應在0.2-0.8較適合,Rf值太大,斑點易擴散,掃描重現差,Rf值太小,斑點沒有完全展開,掃描結果不能代表真實濃度。第17頁,共34頁，星期六，2024年，5月4、邊緣效應：同一化合物，在同一塊薄層板上,用同一混合展開劑，在同一展開槽內展開后，薄層中間部分的斑點比薄層兩側邊緣處的斑點的Rf值小。

用展開劑將展開缸及薄層板飽和后再進行展開就可以消除邊緣效應，飽和時間的長短因展開劑極性以及比例不同而異。5、展開劑(1)展開劑過多次數的重復使用，也會影響Rf值的穩定。多次使用展開劑時，實際上每一次的展開劑的組成,由于揮發、吸附等原因已有改變。最好是臨用新配，這樣每次展開劑少量、定量使用，以足夠展層一次的用量為宜。

第18頁,共34頁，星期六，2024年，5月(2)每一種溶劑在展開中都有其一定的作用：a.展開劑中比例較大的溶劑起溶解物質和基本分離的作用，極性相對較小：b.展開劑中比例較小的溶劑,極性較大，對被分離物質有較強的洗脫力，幫助化合物在薄層上移動，可以增大Rf值，但不能提高分辨率；c.展開劑中加入少量酸、堿可抑制某些化合物的斑點拖尾；比如：六味地黃丸測定山茱萸中的熊果酸，展開劑是：環己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20：5：8：0.1）d.展開劑中加入丙酮等中等極性溶劑可使不相混合的溶劑混溶，并可以降低展開粘度，加快展速。第19頁,共34頁，星期六，2024年，5月6、展距:一般為8-15cm

在這種展距內得不到分離的組分,增加展距并非解決問題的辦法,不僅延長了分離的時間,而且會引起斑點擴散反而降低分離度,因此,展距內分離不理想時,不能一味的增加展距,而是可以優化展開劑,以得到理想的結果。

由此可見,展開時必須控制條件一致，得到重現的分辨率最佳的色譜，才能得到可靠的定性定量結果。第20頁,共34頁，星期六，2024年，5月（四）顯色

顯色劑必須與樣品定量反應,且靈敏度要高,專屬性要強,色點穩定性好。

常用的是噴霧法顯色,分為自動噴霧、手動噴霧。自動噴霧的霧滴均勻而細,比手動噴霧得到的背景吸收小,重現性及定量準確度高。需注意的是：噴完顯色劑后,需加熱顯色的,應注意控制加熱的溫度和時間，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，溫度過高或加熱時間過長易焦化，如果用硫酸等顯色劑可使板面炭化而影響顯色效果；加熱時間不夠，導致斑點未顯出或顯色不完全；有的成分加熱的溫度和加熱的時間不同.顯色效果是有差別的。

將顯色的薄層板避光保存，以同樣大小的玻璃板覆蓋并密封，可增加色斑的穩定性。第21頁,共34頁，星期六，2024年，5月（五）薄層掃描定量（1）色譜條件不優化，操作技術不規范得到的色譜很差，就不可能得到準確的定量結果。（2）輸入薄層掃描儀的參數不合理也會影響定量的準確性，掃描方向應保持一致，應沿展開方向掃描,不宜垂直于展開方向掃描。

總之，要得到理想的色譜分離及準確的定量結果，色譜條件的標準化，操作技術的規范化是十分重要的。第22頁,共34頁，星期六，2024年，5月三、介紹CAMAG薄層掃描儀

第23頁,共34頁，星期六，2024年，5月1、基本原理日本島津生產的CS系列儀器瑞士CAMAG公司的薄層掃描儀基本原理：就是用一束長寬可以調節的一定波長、一定強度的光照射到薄層斑點上進行整個斑點的掃描，用儀器測量通過斑點或被斑點反射的光束強度的變化達到定量的目的。第24頁,共34頁，星期六，2024年，5月2、基本用途

（1）定性—光譜測定在波長200-800nm之間進行斑點原位掃描，測得該化合物的吸收曲線及最大吸收，并與對照品比較從而對樣品中該成分進一步確證。CAMAG公司的WINCATS軟件有斑點光譜圖的儲存功能，因此可對斑點光譜進行檢索，可隨時與分析樣品或標準進行對比。（2）定量—色譜測定，前面已經介紹了定量方法：外標法、內標法等。第25頁,共34頁，星期六，2024年，5月3、CAMAG薄層掃描的組成部分

（1）半自動點樣儀：注意：樣品溶液應澄清，防止溶液中的沉淀堵塞點樣針。第26頁,共34頁，星期六，2024年，5月第27頁,共34頁，星期六，2024年，5月第28頁,共34頁，星期六，2024年，5月（2）數碼照相系統暗箱:可見光、254nm紫外光、及365nm紫外光光源。注意：薄層照相前應揮干溶劑，防止溶劑污染,腐蝕儀器。第29頁,共34頁，星期六，2024年，5月(3)薄層掃描儀第30頁,共34頁，星期六，2024年，5月(1)由光源、單色器、薄層板臺、檢測器、WINCATS工作站組成。(2)光源：鎢燈：可見光區370-800nm

氘燈：紫外區190-450nm

汞燈：220-650nm第31頁,共34頁，星期六，2024年，5月注意：（1）儀器使用過程中，當長時間不進行掃描（約2小時），應把儀器內部的三個光源燈（D2，W，Hg）通過手動控制面板熄滅，或關閉儀器電源。（2）儀器掃描結束后，應及時把薄層板取出，避免溶劑蒸氣