關于酶及細胞固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術第2頁,共71頁，星期六，2024年，5月隨著固定化技術的發展，作為固定化的對象不一定是酶，也可以是微生物細胞、植物細胞、動物細胞或細胞器。此外，固定化生物催化劑的研究還發展到多酶體系的固定化，以及帶有ATP、NAD(P)這一類輔酶的復合酶反應系的固定化。第3頁,共71頁，星期六，2024年，5月第一節概述一、固定化酶的優缺點優點：多次使用可以裝塔連續反應純化簡單提高產物質量應用范圍廣缺點：首次投入成本高大分子底物較困難第4頁,共71頁，星期六，2024年，5月二、固定化的原則酶催化作用依靠它的高級結構及活性中心，固定化時活性中心的必需基團應避免參加反應；避免高溫、強堿、有機溶劑以及高濃度鹽的處理，保護靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋白質的高級結構。盡可能在溫和條件下進行固定化反應。

第5頁,共71頁，星期六，2024年，5月三、固定化酶的性質及其影響因素(一)影響固定化酶性質的因素1．酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態等發生了變化。2．載體的影響（1）分配效應（2）空間障礙效應（3）擴散限制效應3.固定化方法的影響第6頁,共71頁，星期六，2024年，5月(二)固定化后酶性質的變化1.酶活性下降：(1)酶活性中心的重要氨基酸與水不溶性載體相結合；(2)當酶與不溶性載體相結合時，它的結構起了變化；(3)酶被結合后雖不失活，但酶與底物的相互作用受到空間位阻。

前二種可用適當條件加以克服，而第三中則無法克服了。至于包埋法固定化酶的活性下降，可能是因為固定化過程中酶有些變化或者底物和產物對凝膠的滲透力較小之故。第7頁,共71頁，星期六，2024年，5月2．對酶穩定性的影響操作穩定性提高貯存穩定性比游離酶大多數提高。對熱穩定性，大多數升高，有些反而降低。對分解酶的穩定性提高。對變性劑的耐受力升高原因:固定化后酶分子與載體多點連接。酶活力的釋放是緩慢的。抑制自降解，提高了酶穩定性。第8頁,共71頁，星期六，2024年，5月3．固定化酶pH的變化載體帶負電荷，pH向堿性方向移動；載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。產物性質對pH的影響催化反應的產物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低第9頁,共71頁，星期六，2024年，5月4．最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。5．

底物特異性變化作用于低分子底物的酶特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會變化。第10頁,共71頁，星期六，2024年，5月6．米氏常數Km隨載體性質變化由于分配效應：ρ=[Si]微環境/[S]宏觀環境

Km'=Km/ρ(表觀米氏常數)（1）載體與底物帶相同電荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，[Si]>[S]，則ρ>1,Km'<Km對簡單的固定化酶系統，其動力學性質一般服從米氏方程：第11頁,共71頁，星期六，2024年，5月四、評價固定化酶的指標1．酶活定義（IU)：在特定條件下，每分鐘催化一微摩爾底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活單位。

——計量單位酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位

——品質的體現第12頁,共71頁，星期六，2024年，5月1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量穩定性的指標。連續測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）3.4.或稱偶聯效率，活力保留百分數。5.相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力第13頁,共71頁，星期六，2024年，5月五、固定化酶的活力測定方法1.振蕩測定法：稱取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一邊振蕩或攪拌，一邊進行催化反應取出一定量的反應液進行酶活力測定。2.酶柱測定法：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應柱中讓底物溶液以一定的流速流過酶柱收集流出的反應液測定其中產物的生成量或底物的消耗量。3.連續測定法：利用連續分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續測定，從而測定固定化酶的酶活力。

第14頁,共71頁，星期六，2024年，5月第二節固定化酶的制備（一）吸附法（二）結合法（三）交聯法（四）包埋法（entrappingmethod）第15頁,共71頁，星期六，2024年，5月第16頁,共71頁，星期六，2024年，5月（一）吸附法---物理吸附法（1）常用載體無機物有機物高分子化合物活性炭、白陶土、氧化鋁、多孔玻璃、硅膠、碳酸鈣凝膠淀粉麩質、大孔樹脂、DEAE纖維素、DEAE葡聚糖凝膠（2）固定化酶的制備機理所用載體具有活性，可將酶吸附到載體上。（3）優缺點

優點：酶蛋白活性中心不易被破壞，完整保持酶的高級結構;方法簡單，成本低。缺點：酶吸附不牢固，易脫落；防止吸附酶的蛋白質與載體發生變性反應第17頁,共71頁，星期六，2024年，5月（一）吸附法---離子鍵結合法酶與具有離子交換基團的不溶性載體結合形成固定化酶（1）所用載體纖維素的衍生物，離子交換樹脂（2）固定化酶的制備機理酶蛋白的帶電基團和含有離子交換基團的固相載體之間由于靜電相吸而形成絡合物，使酶吸附到離子交換劑上。（3）優缺點優點：操作簡便，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心不易破壞，有利于制備高活性酶缺點：載體與酶的結合力較弱，在高離子強度下酶易從載體上脫落第18頁,共71頁，星期六，2024年，5月(二)共價鍵結合法

酶與不溶于水的載體以共價鍵形式結合制備固定化酶的方法。即，通過化學共價鍵，把與酶蛋白活性無關的氨基酸功能基團連接在不溶于水的載體上。1.酶與載體反應的主要功能基團游離羥基：肽鏈C－末端的α–羧基、天門冬酰氨酸、谷氨酸的β－γ羧基游離氨基：肽鏈N－末端的δ－氨基、賴氨酸ε－氨基巰基：半胱氨酸羥基：絲氨酸、蘇氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：組氨酸第19頁,共71頁，星期六，2024年，5月2.載體活化的方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應法D．硅烷化法E．溴化氰法第20頁,共71頁，星期六，2024年，5月A．重氮法反應示意式如下：

亞硝酸重氮化與酪蛋白反應第21頁,共71頁，星期六，2024年，5月A．重氮法目前在我們國內用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基反應式及原理：第22頁,共71頁，星期六，2024年，5月A．重氮法例5′-磷酸二酯酶的固定化此酶用來降解核酸，可分離得到四個5′-單核苷酸；對-β-硫酸酯乙砜基胺（SESA）作為雙功能試劑，將酶共價結合到多糖載體上；本成果榮獲國家發明三等獎，中國科學院上海生化研究所袁中一等，我國第一個用于工業生產的固定化酶）

第23頁,共71頁，星期六，2024年，5月B疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化葡萄糖淀粉酶步驟如下：⑴酯化：CM-纖維素先洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴中通入HCl氣體，進行酯化反應；然后洗滌，空氣干燥。⑵肼解。把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中，再加入80%水合肼回流反應1小時，過濾，洗滌干燥。⑶疊氮化。肼解后的CM-纖維素（1g）加入150ml2%HCl在冰浴中混合，攪拌滴加9ml3%NaNO2反應20min，過濾用冷蒸餾水洗滌，同時加酶。(4)偶聯：經疊氮化后的載體加入0.05NpH8.0磷酸緩沖液（內含250-500mg酶），5℃攪拌2-3小時，過濾，用0.001NHCl，水洗滌，即為固定化葡萄糖淀粉酶（凍干保存）。第24頁,共71頁，星期六，2024年，5月將與載體反應的功能基團與各種重氮化劑、烷化劑等反應形成共價鍵制備固定化酶。 纖維素+鹽酸甲醇CMC－甲酯＋肼CMC－酰肼CMC－疊氮化物＋NH2酶亞硫酸鈉鹽酸＋固定化酶－CH2CO-NH酶CMC－CH2COOH制備酰肼疊氮化物羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程序纖維素羧甲基化羧甲基纖維素第25頁,共71頁，星期六，2024年，5月C．烷基化反應法第26頁,共71頁，星期六，2024年，5月D．硅烷化法一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特點：①機械強度好，表面積大。②耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。

第27頁,共71頁，星期六，2024年，5月E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。第28頁,共71頁，星期六，2024年，5月（三）交聯法制備固定化酶概念：雙功能試劑或多功能試劑與酶蛋白質中的氨基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯成網，凝集成固定化酶1、發生作用的氨基酸殘基：酪氨酸的酚基胱氨酸的SH巰基

N－末端的a－氨基。2、常用的雙功能或多功能試劑：戊二醛聚甲叉雙碘乙酰胺雙重氮聯苯胺第29頁,共71頁，星期六，2024年，5月先將酶吸附在不溶于水的載體上，再用雙功能試劑戊二醛與酶蛋白的氨基之間交聯起來，形成酶網包圍在載體表面。

常用載體：硅膠、離子交換樹脂。第30頁,共71頁，星期六，2024年，5月（四）包埋法制備固定化酶酶本身不參與反應，僅用物理方法把酶包埋在凝膠細小的格子中，或包圍在半透膜或聚合物中。包埋方法有兩種：1格子型固定化酶2微型膠囊法（1）原理以丙烯酰胺、硅膠、淀粉瓊脂等材料，在酶存在下聚合成凝膠，酶被包埋在聚合物的細小多孔的網狀格子中。反應為厭氧反應。第31頁,共71頁，星期六，2024年，5月酶液丙烯酰胺N，N－雙丙烯酰胺氫氣催化劑：四甲基乙二胺、明礬胺引聚劑：過硫酸鉀、核黃素光照聚合反應凝膠酶塊固定化酶切割（2）方法（以丙烯酰胺為材料是最常用的方法）第32頁,共71頁，星期六，2024年，5月第33頁,共71頁，星期六，2024年，5月2微型膠囊法（1）原理

把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球狀含酶微型膠囊。（2）特點微囊直徑幾微米～幾百微米。低分子底物可以自由通過并進入微囊內。與酶反應后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物質不能通過微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質也無法進入微囊內第34頁,共71頁，星期六，2024年，5月以親水性單體和疏水性單體在表面發生聚合反應將酶包圍起來，形成微型膠囊酶。分三步：常用形成膠囊的材料和生成的聚合物種類：親水性單體疏水性單體生成的聚合物聚胺聚異氰衍生物聚胺、聚酯乙二醇、多元醇聚異氰衍生物聚胺、聚酯3.表面聚合法制備微型膠囊第35頁,共71頁，星期六，2024年，5月A乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機溶媒中充分乳化。B表面聚合：將含有疏水性單體的有機溶媒加入到上述乳化液中，發生聚合反應，生成的薄膜把酶包圍起來形成微型膠囊球。三步：C清洗：反應完成后，用有機溶劑洗去未反應的剩余單體1表面聚合法第36頁,共71頁，星期六，2024年，5月各類固定化方法的特點比較:

比較項目吸附法結合法交聯法包埋法物理吸附.共價鍵結合離子鍵結合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強中等強強活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶第37頁,共71頁，星期六，2024年，5月第三節

固定化細胞固定化菌體概念：把菌體細胞中特定的酶不經過分離提純，直接用適當的方法將菌體加以固定來催化各種特定的生物化學反應。優點：不需提制酶，可保持酶的活性。反復使用，成本低——與固定化酶比較制備方法：與固定化酶相同，有包埋法、載體結合法、交聯法、熱處理法、射線處理法。其中包埋法是最理想的方法。第38頁,共71頁，星期六，2024年，5月一包埋法1原理在菌體細胞本身不發生化學反應的情況下，將其包進半透性的多聚物膜內。小分子的底物和產物均可自由出入，而菌體細胞卻不會漏出。2方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂以制備含天門冬氨酸的大腸桿菌細胞為例將菌體細胞預先用生理鹽水懸浮，向懸浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，然后加入催化劑過硫酸胺和加速劑四甲基乙二胺，混勻后放置一定時間聚合。將得到的凝膠破碎即得到固定化細胞。收率達72.5％第39頁,共71頁，星期六，2024年，5月二載體結合法（吸附法）1原理微生物細胞表面帶有電荷，在適當的條件下可以與載體的離子交換基團形成絡合物或吸附在載體上。2常用載體離子交換纖維素。陰離子樹脂、DEAE－纖維素。3優缺點優點：方法簡單、載體易于再生。缺點：結合力弱，菌體細胞易脫落。第40頁,共71頁，星期六，2024年，5月研究熱點——光交聯樹脂包埋法

例：相對分子量為1000-3000的光交聯聚氨酯預聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得第41頁,共71頁，星期六，2024年，5月第四節固定化原生質體和輔酶一、原生質體固定化的方法制備原生質體——將原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩定劑的緩沖液中配成原生質體懸浮液——包埋法固定化原生質體。關鍵：原生質體如何制備？第42頁,共71頁，星期六，2024年，5月二、原生質體的制備將對數生長期的細胞收集——懸浮在含有滲透壓穩定劑的高滲緩沖液中——去細胞壁——分離純化——得到原生質體-活性鑒定第43頁,共71頁，星期六，2024年，5月三、酶解注意要點1、酶解前要預處理：主要是為了使酶滲透到細胞器中去。采取的策略：先加入物質抑制或阻止某種細胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巰基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。2、酶系選擇：溶菌酶、蝸牛酶、β葡聚糖酶、纖維素、半纖維素和果膠酶3、酶濃度選擇（0.5%-1%）4、酶解溫度和pH5、酶解終點確定第44頁,共71頁，星期六，2024年，5月四、穩定劑（高滲溶液）要求1.加入的化合物對細胞和原生質體無毒性2.不會影響水解酶的活性3.對代謝產物無不良影響四、穩定劑加入操作注意點1.一定pH（酶和菌體活性最高）2.一定的濃度（過高濃度原生質體易脫水皺縮）3.種類：無機鹽-對細菌有機物糖和糖醇-酵母4.易于滲入質膜、易于被原生質體和菌體分解的物質不宜作為穩定劑第45頁,共71頁，星期六，2024年，5月五、原生質體細胞活性的檢測1熒光素雙醋酸鹽（FDA)染色法2酚藏花紅染色法3伊文思蘭染色法第46頁,共71頁，星期六，2024年，5月六、輔酶固定化1、原因有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應(遞氫、遞電子或遞某些化學基團的作用）有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機輔因子價格昂貴——工業上應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生第47頁,共71頁，星期六，2024年，5月輔酶固定化的方法：2、固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯法等共價偶聯，或將其進行適當的化學修飾后固定在超濾器中。3、輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。策略：先在輔酶的一定部位進行修飾--引入功能團和間隔臂（形成輔酶衍生物）--再與水溶性高分子結合第48頁,共71頁，星期六，2024年，5月輔酶的固定化第49頁,共71頁，星期六，2024年，5月輔酶的固定化第50頁,共71頁，星期六，2024年，5月輔酶再生的形式：輔酶和酶共固定 與酶分子偶聯成輔酶-酶復合物第51頁,共71頁，星期六，2024年，5月第四節固定化技術的應用●生產果葡糖漿●生產6-APA和抗生素●生產乙醇和啤酒●生產氨基酸●生產蘋果酸●生產淀粉酶第52頁,共71頁，星期六，2024年，5月生產果葡糖漿利用葡糖異構酶是胞內酶的特性，可以直接將含酶的菌體細胞固定化，進行果葡糖漿(也稱高果糖漿)的工業生產。與以前采用水溶狀態的葡糖異構酶或含有此酶的微生物菌體的分批法相比，固定化生物催化劑連續生產法具有以下優點：①果葡糖漿質量均一；②隨著異構效率的提高，甜度也增強；③可以得到色淺、混濁度小的透明糖液；④可以制得灰分少、純度高、風味佳的產品等。有關的固定化方法很多，曾報道過的有加熱固定法、離子吸附法、絮凝法、包埋法、交聯法等。例如加熱法，將含葡糖異構酶的白色鏈霉菌的菌體細胞，在60～65℃加熱處理10min，酶就固定在細胞內。此法簡便，成本低廉，工業上容易采用。

第53頁,共71頁，星期六，2024年，5月生產6-APA和抗生素6-APA即6-氨基青霉烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉素酰胺酶的固定化細胞，可生產6-APA。例如，中國科學院微生物研究所和太原制藥廠曾研究采用各種不同的方法制備含青霉素酰胺酶的固定化細胞。

抗生素是一大類重要的發酵產品，近年來在研究利用固定化菌體生產青霉素和桿菌肽方面也有所突破，引起了人們的注意。尤其是利用固定化細胞可以由單一營養物生成桿菌肽，這是比傳統發酵法(用淀粉-肉湯培養基)優越的地方。第54頁,共71頁，星期六，2024年，5月生產乙醇和啤酒(一)生產酒精酒精發酵需要大型發酵罐，不但設備繁雜，操作困難，而且耗費一部分糖以供酵母生長之用。自從應用固定化細胞進行連續發酵日益發展后，酒精發酵時間由傳統方法的36h縮短至3h以下，乙醇生產能力每小時為20～50g/L，而傳統方法僅為2g/L。例如，千田一郎等將酵母固定于K-角叉菜膠，利用這種固定化增殖酵母可穩定、連續生產一年以上，并且生產速率比以前的發酵法快10多倍。另外，關于細菌固定化的研究也頗為活躍，據Arcuri等報道，將運動發酵單胞菌用玻璃纖維吸附，使用由葡糖5-20%及酵母膏0.5%配成的培養基，連續發酵28d，乙醇生產能力152g/L·h(停留時間為10～15min)，這要比固定化酵母的乙醇生產能力大得多。第55頁,共71頁，星期六，2024年，5月(二)生產啤酒利用麥芽汁發酵生產啤酒，實際上是一種特殊類型的酒精發酵。近年來，利用固定化酵母細胞生產啤酒的研究已經很多。例如，white等人報道了一個利用海藻酸鈣凝膠包埋非絮凝性細胞，連續生產啤酒的方法。Linko等人將酵母細胞固定于海藻酸鈣凝膠內，置于填充式柱式反應器內，用于由麥芽汁連續發酵生產啤酒，可維持幾個月，其麥芽汁在柱式反應器內的停留時間為2h，啤酒的酒精含量可達到4.5%。我國上海工業微生物所從1979年起，也開始進行了固定化酵母細胞連續發酵啤酒的研究。

第56頁,共71頁，星期六，2024年，5月生產氨基酸(一)生產L-天門冬氨酸L-天門冬氨酸作為醫藥品、食品添加劑和甜味肽原料而被大量使用。目前用于生產L-天門冬氨酸的菌種都是大腸桿菌，固定化的方法以凝膠包埋法的效果較好。例如，千田一郎利用角叉菜聚糖凝膠包埋大腸桿菌，L-天門冬氨酸酶的活力比聚丙烯酰胺凝胺包埋法制得的固定化大腸桿菌的酶活力大大提高，而且用戊二醛、六甲叉二胺處理后，穩定性明顯增加，其生產能力較聚丙烯酰胺包埋法的提高15倍。(二)生產L-丙氨酸例如，Yamamoto等利用K-角叉菜聚糖固定含L-天門冬氨酸-β-脫羧酶的德阿昆哈假單胞菌，裝入柱式反應器，由L-天門冬氨酸連續生產L-丙氨酸。

第57頁,共71頁，星期六，2024年，5月生產蘋果酸生產L-蘋果酸自1972年起，千田一郎等人利用聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產氨短桿菌，制成固定化細胞，實現了L-蘋果酸的連續、高效、大量、廉價的工業化生產。

第58頁,共71頁，星期六，2024年，5月生產淀粉酶利用聚丙烯酰胺凝膠包埋的枯草桿菌合成α-淀粉酶，是固定化菌研究方面又一新進展。通過掃描式電子顯微鏡檢查得知，凝膠中的細菌在保溫過程中仍在生長，所以Kokubu等人認為，利用固定化菌體柱，在不久的將來進行α-淀粉酶的工業生產是有可能的?？梢姡潭ɑ夹g在工業上顯示出廣闊的應用前景。第59頁,共71頁，星期六，2024年，5月在實際應用中需要考慮的一些重要因素主要有：(1)用于固定化的載體和試劑的成本；(2)固定化后酶的活力與回收率；(3)操作過程中固定化酶和固定化細胞的穩定性；(4)在長時間使用后，固定化酶或固定化細胞的再生能力。目前，固定化增殖細胞方面的研究進展很快?？梢灶A期，在不久的將來有可能利用固定化微生物生產氨基酸、多肽、核苷酸、輔酶、乙醇、啤酒、抗生素、酶制劑、有機酸、激素等產品，這將使整個發酵工業和化學工業發生根本性的變革。第60頁,共71頁，星期六，2024年，5月固定化酶、固定化細胞反應器第61頁,共71頁，星期六，2024年，5月第五節固定化酶動力學在化學工程或催化反應工程上采用固定化酶，就其本質而言與傳統的固體催化劑一樣，但固定化酶的反應動力學和溶液酶的顯著不同，如酶的活力、反應動力學參數、底物專一性等都可能發生變化。這不僅是由于酶固定化后其結構可能發生了變化，而